童匯慧，周貝貝

(1.浙江工商大學(xué)，浙江 杭州 310018； 2.浙江大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州 310027)

1 前 言

鈦金屬及其合金由于其優(yōu)良的機械性能和生物相容性被廣泛應(yīng)用于骨科和牙科植入體[1-4]。為改善其與宿主骨組織的結(jié)合，也就是骨整合，通常需對其表面進(jìn)行修飾[5]。近年來，納米結(jié)構(gòu)TiO2涂層，如納米點[6]、納米線[7]、納米管[8-9]、納米棒[10-11]等，在這方面得到了廣泛的研究。例如TiO2納米管薄膜可以顯著加速成骨細(xì)胞的粘附和骨整合，不同直徑的單個納米管被發(fā)現(xiàn)能夠影響細(xì)胞的粘附、形態(tài)、酶的活性并最終影響細(xì)胞的命運[12-14]；不同晶相的納米點薄膜表現(xiàn)出調(diào)控不同細(xì)胞粘附和增殖的能力等[15-16]。在這些涂層中，納米棒薄膜因為具有準(zhǔn)三維結(jié)構(gòu)，能夠為細(xì)胞附著、增殖及分化等行為提供合適的微環(huán)境從而得到了廣泛的重視。合適的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在細(xì)胞生長初期能夠促進(jìn)細(xì)胞粘附，促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化和骨整合等[11,17-18]。同時，納米棒之間的空間可以用來進(jìn)一步復(fù)合其他種類的材料[19-20]，如磷酸鈣、生物玻璃等，這可以進(jìn)一步改進(jìn)涂層的生物學(xué)性能。

近年來，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)得到了越來越多的關(guān)注。ECM的主要成分包括結(jié)構(gòu)性和功能性的蛋白質(zhì)分子，如膠原蛋白、層粘連蛋白、糖胺聚糖和其他糖基化蛋白等。其獨特的三維結(jié)構(gòu)[21]不僅為細(xì)胞提供了支持結(jié)構(gòu)和附著位點，還能提供細(xì)胞發(fā)揮功能所需的信號[22-25]。因此，ECM的主要成分可以作為生物材料以誘導(dǎo)合適的細(xì)胞響應(yīng)，如粘附、增殖和分化等[26-28]。例如，層粘連蛋白在體外可以促進(jìn)細(xì)胞的附著和存活[29]；I型膠原能誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)的成骨分化[28,30]，這可能與其獨立激活FAK和ERK信號通路，促進(jìn)堿性磷酸酶和骨鈣素的表達(dá)有關(guān)[26]；引入I型膠原的支架也表現(xiàn)出良好的成骨性和更好的粘附相關(guān)基因表達(dá)[31]。近年來，由于從組織或體外培養(yǎng)獲得的全ECM能夠保留更多的天然成分和微觀結(jié)構(gòu)，將其用于組織修復(fù)的研究逐漸增多。Shraddha將hMSCs衍生的ECM加入到生物相容性聚合物中，獲得電紡混合支架[32]。ECM的加入能顯著提高軟骨培養(yǎng)基中II型膠原蛋白的表達(dá)。而且，不同種類細(xì)胞衍生的基質(zhì)可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖[33]。

然而，由于成分和結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，如何在成分和微觀結(jié)構(gòu)上更好地仿生ECM仍然是一個難題。研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)獲取的細(xì)胞片層通過聚多巴胺處理固定在Ti基底上，可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的成骨向分化[34]。由于TiO2納米結(jié)構(gòu)對ECM蛋白有著良好親合性[16]，并提供了很大的容納空間，因此可以將其作為固定ECM的基體，所形成的復(fù)合涂層可望初期由于ECM的存在具有良好的細(xì)胞響應(yīng)性，ECM降解后則可通過納米結(jié)構(gòu)表面持續(xù)促進(jìn)細(xì)胞響應(yīng)。

鑒于此，本研究首先制備了TiO2納米棒薄膜，然后通過體外細(xì)胞培養(yǎng)和去細(xì)胞處理在薄膜中沉積ECM以形成復(fù)合涂層，并對涂層表面干細(xì)胞的響應(yīng)進(jìn)行評價。

2 實 驗

2.1 TiO2納米棒與ECM復(fù)合涂層的制備

TiO2納米棒薄膜制備參照文獻(xiàn)方法[35]：先通過分相自組裝在基底上制備TiO2納米點晶種層，之后水熱處理生長出TiO2納米點薄膜[36]。在本研究中，為減少其它因素的干擾，采用石英基板做為基底。

將鼠前成骨細(xì)胞(MC3T3-E1，CRL-2594，ATCC)以5×104個細(xì)胞/cm2的密度接種在納米棒薄膜上，培養(yǎng)3天；然后用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)和MilliQ純凈水洗滌細(xì)胞。采用凍融循環(huán)處理進(jìn)行脫細(xì)胞處理：將細(xì)胞在-80 ℃的MilliQ純凈水中冷凍3 h，室溫解凍后，用MilliQ水洗凈，凍融循環(huán)重復(fù)3次。之后，將所得涂層在凍干機(FD-1A-50)中冷凍干燥12 h，進(jìn)而通過紫外光照滅菌。ECM量可通過多次重復(fù)前述過程增加。將ECM沉積一次、沉積兩次和沉積三次的復(fù)合涂層分別記為NRLM(低含量)、NRMM(中含量)和NRHM(高含量)。

2.2 復(fù)合涂層的表征

通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM，SU47)表征涂層表面形貌。涂層中的總蛋白量通過BCA試劑盒法檢測。水接觸角(WCA)用接觸角儀(Dataphysics，OCA20) 以滴落法測量。每個樣品重復(fù)測量4次。

通過免疫熒光染色表征復(fù)合涂層中的I型膠原和層粘連蛋白等：先將復(fù)合涂層用4%多聚甲醛固定15 min，之后用0.1%Triton X-100滲透10 min及0.5%BSA/10%FBS/0.5%Triton X-100在PBS中阻斷1 h；然后用一抗以1/100稀釋度在4 ℃下培育過夜；之后將復(fù)合涂層與二抗依次在37 ℃黑暗中培育80 min;最后在共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM，LSM780)下觀察。ECM中的細(xì)胞核殘留通過DAPI染色結(jié)合CLSM觀察進(jìn)行表征。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

從Sprague-Dawley(SD)大鼠中分離并收集BMSCs。該動物實驗方案經(jīng)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院動物研究倫理委員會批準(zhǔn)。將4周齡的雄性SD大鼠通過頸部脫臼犧牲后從股骨及脛骨上采集骨髓，然后懸浮在含有低葡萄糖型杜爾貝科改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Gibco)和10%胎牛血清(FBS，Gibco)的生長培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的濕潤氣氛中培養(yǎng)。1天后通過更換培養(yǎng)基去除非粘附細(xì)胞，之后每兩天更換一次培養(yǎng)基。亞培養(yǎng)階段中，用0.25%胰蛋白酶(Amresco，USA)和1mM乙烯二胺四乙酸(Gibco)分離細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長到80%～90%融合時進(jìn)行傳代。

3 結(jié)果與討論

3.1 復(fù)合涂層的成份及微觀結(jié)構(gòu)

典型的涂層Raman圖譜與SEM圖像如圖1所示。復(fù)合涂層可以檢測出銳鈦礦相的存在(圖1a)，這可歸為表面的納米棒。如圖1b所示，表面箭頭所指處可以觀察到明顯的ECM沉積，ECM較為均勻地沉積在納米棒之間空隙中，最終形成相互連接結(jié)構(gòu)。

圖1 復(fù)合涂層的典型Raman圖譜(a)及SEM圖像(b)Fig.1 Typical Raman spectrum (a) and SEM micrograph (b)

圖2a表面吸附蛋白總量的結(jié)果顯示，隨著ECM沉積次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)總量明顯增加。NRLM為23.4 μg/cm2，NRMM為33.1 μg/cm2，NRHM為53.5 μg/cm2。與此相對應(yīng)，圖2b的水接觸角結(jié)果也證實了復(fù)合涂層變得比納米棒更疏水。由于各種不溶于水的大分子和疏水官能團(tuán)的存在，平均接觸角由7.4°變?yōu)?7.3°、41.0°和46.6°。這些結(jié)果證明ECM已經(jīng)有效沉積在納米棒之間，形成了ECM/TiO2復(fù)合涂層，且其含量可通過沉積次數(shù)在一定程度上可控。

熒光顯微分析顯示，去細(xì)胞處理后，細(xì)胞核含量顯著減少(圖3a、b)。而ECM的主要成分，包括I型膠原和層粘連蛋白，如圖3c～f所示，在涂層中得到了有效保留。脫細(xì)胞前的涂層比脫細(xì)胞后的涂層顯示出更多的I型膠原和層粘連蛋白存在。這意味著在脫細(xì)胞過程中可能有部分ECM流失。

圖2 復(fù)合涂層的蛋白含量及表面潤濕性(a) 總蛋白含量； (b) 水接觸角Fig.2 Total protein content and surface wettability(a) total protein amount； (b) contact angles

圖3 復(fù)合涂層中的共聚焦熒光顯微圖像(a) 細(xì)胞核染； (b) 細(xì)胞核染； (c) I型膠原； (d) I型膠原染色； (e) 層粘連蛋白(去細(xì)胞前)； (f) 層粘連蛋白(去細(xì)胞后) Fig.3 CLSM images of the composite coatings(a) DAPI; (b) DAPI; (c) Col-I; (d) Col-I ; (e) laminin (Before decellularization); (f) laminin (After decellularization)

3.2 BMSC對復(fù)合涂層的反應(yīng)

CCK-8結(jié)果顯示NRLM和NRMM涂層顯著改進(jìn)了細(xì)胞的粘附性(圖4a)。經(jīng)過4天和7天的培養(yǎng)，復(fù)合涂層上的細(xì)胞有明顯的增殖，NRMM組的效果最好。

堿性磷酸酶(ALP)的水平可以表征成骨向的早期分化。圖4b中，復(fù)合涂層上培養(yǎng)細(xì)胞的ALP活性明顯高于NR對照組，說明復(fù)合涂層能有效促進(jìn)干細(xì)胞早期分化為成骨細(xì)胞。在所有涂層中，NRHM涂層的數(shù)值最高。

圖4 復(fù)合涂層的CCK-8 (a)與ALP結(jié)果 (b)Fig.4 CCK-8 (a) and ALP level (b) of BMSCs on composite coatings

圖5為實時PCR表征的成骨相關(guān)基因表達(dá)的量化結(jié)果，包括ALP、Col-Ⅰ和Runx-2。培養(yǎng)14天后，ALP基因在所有復(fù)合涂層中的表達(dá)量均有所下降，與對照組相比無明顯差異。Col-Ⅰ是成骨分化中期的一個指標(biāo),其在所有復(fù)合涂層中的表達(dá)量均顯著高于對照組，且NRMM組表現(xiàn)最佳。而在代表全期成骨的指標(biāo)Runx-2中，NRMM也是最高的。作為成骨晚期的指標(biāo)，采用茜素紅染色法對21天后的細(xì)胞礦化情況進(jìn)行了評估，結(jié)果如圖6所示。所有復(fù)合涂層均顯示出顯著上調(diào)的細(xì)胞礦化行為。尤其是NRMM組，其促進(jìn)細(xì)胞礦化的能力遠(yuǎn)優(yōu)于其他組，而NRHM涂層在礦化能力方面僅次于NRMM。

圖5 成骨相關(guān)基因表達(dá)Fig.5 Bone-related gene expression

事實上，由于納米棒與蛋白質(zhì)之間具有良好的親和力[11,17-18]，ECM可以很好地沉積在單個納米棒之間，并形成相互連接的結(jié)構(gòu)，這種相互連接的結(jié)構(gòu)可以很好地固定ECM，最終形成ECM/TiO2納米棒復(fù)合涂層。由于殘留的細(xì)胞體和細(xì)胞核可能導(dǎo)致異物反應(yīng)，因此通常需要進(jìn)行脫細(xì)胞處理[37]。如圖3b所示，一些細(xì)胞核成分仍然存在，這可能是由于細(xì)胞與其之下的納米棒之間的相互作用造成的。盡管強化去細(xì)胞化能夠進(jìn)一步減少細(xì)胞體和細(xì)胞核等，但將進(jìn)一步導(dǎo)致ECM的過多損失，如圖3d、3f所示。有鑒于此，本研究在ECM獲取和BMSCs獲取方面均選擇了同一類型的大鼠。如圖4～圖6所示，這種細(xì)胞核的殘留并未顯示出對生物相容性的不利影響。這意味著，采用同源自體細(xì)胞培養(yǎng)獲取細(xì)胞外基質(zhì)有可能是一種有效地制備植入體表面生物活性涂層的手段。

圖6 復(fù)合涂層表面礦化行為Fig.6 Mineralization behavior of the composite coatings

綜合以上實驗數(shù)據(jù)，對于復(fù)合涂層上的細(xì)胞反應(yīng)，NRLM涂層比無ECM組和ECM含量較多的組在初始粘附性、展布性和ALP基因表達(dá)方面都有改善。這表明，少量ECM的加入可能對促進(jìn)成骨早期分化有較好的傳導(dǎo)作用。由于TiO2納米棒薄膜對粘附和分化有利(如納米棒暴露長度影響細(xì)胞反應(yīng)),早期細(xì)胞反應(yīng)的改善可能是ECM和納米結(jié)構(gòu)協(xié)同作用的結(jié)果；而對于NRMM和NRHM，隨著ECM含量的增加，細(xì)胞增殖和成骨相關(guān)基因的表達(dá)方面的提升則可能來自于ECM的優(yōu)勢。但是，隨著更多的ECM沉積導(dǎo)致納米棒在表面暴露逐漸減少，這可能導(dǎo)致表面主要表現(xiàn)出ECM特性。由于TiO2納米棒和ECM的協(xié)同作用，NRMM表現(xiàn)出最佳的礦化性能。

4 結(jié) 論

在TiO2納米棒薄膜的基礎(chǔ)上結(jié)合細(xì)胞薄層培養(yǎng)沉積，成功得到了ECM/TiO2復(fù)合涂層，復(fù)合涂層表現(xiàn)出良好的生物相容性和調(diào)控BMSCs細(xì)胞的粘附、增殖和成骨分化等行為的能力。本工作提供了一種利用宿主細(xì)胞體外培養(yǎng)獲取細(xì)胞外基質(zhì)用于骨金屬植入體表面修飾的新方法，這可能為植入體的表面修飾提供新思路。