杜亞楠，張 敏，孫淑英*，陳貴林

(1 內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010070；2 內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙藥材規(guī)范化生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心，呼和浩特 010070；3 牧草與特色作物生物學(xué)教育部重點實驗室，呼和浩特 010070)

遺傳多樣性是揭示物種適應(yīng)環(huán)境的指標(biāo)，也是物種與生俱來的特性[1]。了解植物種群的遺傳結(jié)構(gòu)和變異程度，對于開展野生資源的保護(hù)和育種計劃具有重要意義[2]。在用于遺傳分析的分子工具中，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)[3]和簡單序列重復(fù)(ISSR)[4]標(biāo)記與簡單序列重復(fù)(SSR)、序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)和目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(SCoT)等標(biāo)記相比，具有節(jié)約成本、不需要序列信息、無需特定引物、操作簡便快速等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性研究中[5-7]。單一分子標(biāo)記會使各項遺傳參數(shù)產(chǎn)生偏差，檢測多態(tài)性信息少，不能全面揭示物種的遺傳多樣性[8]。ISSR可以擴(kuò)增基因組的內(nèi)含子區(qū)域[9]，RAPD可以同時擴(kuò)增大量位點[10]，這兩種分子標(biāo)記的組合允許更高程度的基因組覆蓋。目前，ISSR和RAPD兩種分子標(biāo)記結(jié)合廣泛用于荔枝[11]、竹子[12]、紅景天[13]、茴芹[14]、葉子花[15]及獐牙菜屬[16]等植物的遺傳變異、親緣關(guān)系和遺傳多樣性研究中。

赤芍是中國常用的大宗藥材，為毛茛科植物芍藥 (PaeoniaelactifloraPall.) 或川赤芍 (PaeoniaveitchiiLynch) 的干燥根，具有清熱涼血，散瘀止痛之功效[17]。中國赤芍廣泛分布于內(nèi)蒙古、黑龍江和河北等省(區(qū))，其中內(nèi)蒙古赤芍產(chǎn)量占據(jù)國內(nèi)外供應(yīng)市場近三分之一的份額，為重要的主產(chǎn)區(qū)[18]。隨著赤芍藥材需求日益增加，野生赤芍資源經(jīng)過半個世紀(jì)的無序采挖，特別是進(jìn)入21世紀(jì)之后，已日趨枯竭，市場主要以栽培赤芍為主。但目前生產(chǎn)中赤芍種質(zhì)混雜，來源不清，各地間盲目引種更加重了混雜程度，根本無法保證藥材質(zhì)量。為此，本研究從赤芍種群的遺傳多樣性角度解析其種群結(jié)構(gòu)特征及親緣關(guān)系，為赤芍的引種選育、優(yōu)良種質(zhì)挖掘和分子輔助育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

供試赤芍樣本于2017年9月25日-10月8日分別采自內(nèi)蒙古自治區(qū)、黑龍江省和吉林省等地，共計28個赤芍種群，包括12個野生種群和16個栽培種群。每個種群采集8株健康赤芍的根部組織，迅速裝入密封袋中，用硅膠干燥，帶回實驗室用去離子水清洗干凈并編號，放入-80 ℃冰箱儲存。實驗材料經(jīng)內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳貴林教授鑒定為赤芍，樣品采集地信息詳見表1。

表1 赤芍種群采樣點地理信息

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA提取與質(zhì)量檢測以單株赤芍的根組織樣本為單位，使用植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen)提取28個種群224株赤芍樣本的DNA。經(jīng)1.3%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop核酸蛋白測定儀檢測DNA質(zhì)量與濃度后，存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選與其檢測本研究初步篩選的60條ISSR引物參照Zietkeiwitcz等[4]公布的序列，由上海生物工程技術(shù)公司合成。40條RAPD分子標(biāo)記引物[19-20]，由華大基因合成。用2個赤芍基因組DNA進(jìn)行引物篩選，最后選取穩(wěn)定、清晰和多態(tài)性條帶豐富的14條ISSR引物和14條RAPD引物，并確定了其最佳退火溫度，用于本實驗研究。

ISSR分子標(biāo)記擴(kuò)增的方法是按照Liu等[21]方法進(jìn)行，并做了一些小的修改。反應(yīng)體系的總體積為25 μL，包含2 μL (20 ng/μL)DNA模板、1.5 μL(10 μmol/L)引物、9 μL ddH2O和12.5 μL 2×EsTaq Master Mix酶(TaKaRa)。PCR擴(kuò)增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，退火復(fù)性45 s，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

RAPD分子標(biāo)記PCR反應(yīng)體系與循環(huán)參數(shù)參照來明達(dá)等[19]報道的方法進(jìn)行。反應(yīng)體系總體積為25 μL，包含2 μL DNA模板(20 ng/μL)、1.5 μL(10 μmol/L)引物、10 μL ddH2O和11.5 μL 2×EsTaq Master Mix酶(TaKaRa)。PCR擴(kuò)增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，退火復(fù)性45 s，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)33次；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。1.3%瓊脂糖凝膠觀察擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，通過凝膠成像系統(tǒng)拍照，記錄結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行拍照，人工讀帶統(tǒng)計，在凝膠的相同遷移位置上將有條帶記為“0”，無條帶記為“1”，輸入到Excel中建立矩陣。利用PopGene32軟件對由野生和栽培的種質(zhì)組成的兩組矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行分組分析，計算多態(tài)性位點數(shù)(NPL)、多態(tài)性位點百分率(PPL)、觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(He)、Shannon’s多樣性信息指數(shù)(I)、遺傳分化系數(shù)(Gst)和基因流(Nm)等遺傳系數(shù)；利用軟件NTsys Version 2.1進(jìn)行UPGMA聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增結(jié)果多態(tài)性分析

14條ISSR引物共擴(kuò)增得到257條清晰可重復(fù)條帶，平均每條引物擴(kuò)增出18.4條條帶，多態(tài)性條帶為251條，平均每條引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶為17.9條，平均多態(tài)性比率為97.8%。其中ISSR UBC835引物擴(kuò)增的條帶最多為25條，ISSR UBC860引物擴(kuò)增的條帶最少為14條。

14條RAPD引物共擴(kuò)增出215條條帶，平均每條引物擴(kuò)增出15.4條帶，多態(tài)性條帶為209條，平均每條引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶為14.9條，平均多態(tài)性比率為97.2%。其中RAPD S43、RAPD S1089和RAPD S1110引物擴(kuò)增的條帶數(shù)最多為18條，RAPD S75和RAPD S1114引物擴(kuò)增的條帶最少為13條(表2)。兩種標(biāo)記擴(kuò)增效率即多態(tài)帶百分率數(shù)值相近，證明篩選的引物擴(kuò)增條帶清晰度和多態(tài)性較好，可用于本研究材料的遺傳多樣性分析。

表2 引物序列及擴(kuò)增條帶數(shù)

M.DL2000；1-8. 多倫(DL)種群8株植株編號圖1 引物ISSR UBC807(A)和RAPD S428(B)對多倫(DL)種群的擴(kuò)增M.DL2000；1-8. No. of DL population’s 8 samplesFig.1 Effect of primers ISSR UBC807 and RAPD S428 for amplification of Duolun (DL) population of Paeoniae Radix Rubra

ISSR引物UBC807和RAPD引物S428對DL種群的擴(kuò)增結(jié)果如圖1，擴(kuò)增出的譜帶穩(wěn)定、清晰和多態(tài)性豐富，擴(kuò)增片段長度約在 450～2 000 bp之間。由擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ISSR擴(kuò)增出的條帶清晰且多于RAPD，對赤芍具有更強(qiáng)的檢測能力。

2.2 遺傳多樣性分析

根據(jù)ISSR、RAPD 兩種分子標(biāo)記得到的0/1矩陣，通過 PopGene32軟件，假定遺傳平衡分別得到28個種群的遺傳多樣性參數(shù)，具體數(shù)據(jù)見表3。在28個種群中，DL(內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟多倫縣)種群各遺傳參數(shù)最高，ELC3(內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾市鄂倫春自治旗大楊樹鎮(zhèn))種群最低。在野生種群中，DL種群遺傳多樣性水平仍然最高，對其生存的環(huán)境適應(yīng)能力最強(qiáng)；而LK(黑龍江牡丹江市林口縣朱家鎮(zhèn))種群的遺傳多樣性水平最低，對環(huán)境適應(yīng)能力最弱。而在栽培種群中，YKS種群(內(nèi)蒙古呼倫貝爾牙克石市農(nóng)牧場)遺傳多樣性最高，ELC3種群最低。同時ISSR分子標(biāo)記得出的多態(tài)性位點數(shù)、多態(tài)性條帶百分率、Na、Ne、He、I等值均高于RAPD分子標(biāo)記，在一定程度上表明樣品數(shù)相同、引物數(shù)相同時，ISSR檢測遺傳多樣性的能力較高，改進(jìn)的ISSR可能是一種比RAPD更有效的研究赤芍植物系統(tǒng)發(fā)育的方法。

表3 28個赤芍種群的ISSR與RAPD遺傳多樣性參數(shù)分析

基于兩種標(biāo)記對赤芍群體遺傳多樣性結(jié)果的比較(表4)，28個種群的多態(tài)性位點平均百分比分別為 39.57%和35.95%；Na平均值分別為1.40和0.36；He平均值分別為0.15和0.13；I平均值分別為 0.22和0.19，由此可見赤芍種群存在較高的遺傳多樣性。根據(jù)反映研究對象遺傳多樣性水平高低指標(biāo)的I和He，野生種群各遺傳多樣性指數(shù)平均值均高于栽培種群，即野生赤芍種群的遺傳多樣性水平高于栽培赤芍種群。

表4 赤芍群體ISSR和RAPD遺傳多樣性結(jié)果比較

2.3 遺傳分化分析

由表5可知，ISSR和RAPD得到28個赤芍種群的總遺傳多樣度(Ht)分別為0.32、0.27，種群內(nèi)基因遺傳樣性(Hs)結(jié)果為0.15、0.12，那么群體之間的遺傳多樣性(Dst)大小為0.17、0.14。即遺傳多樣性在種群內(nèi)占46%、47%，在種群間則為54%、53%，比較顯示赤芍種群間的多樣性水平大于種群內(nèi)的。遺傳分化系數(shù)是反映種群分化程度的指標(biāo)，Gst值在0至0.05之間，表示分化程度較弱；Gst值在0.05至0.15之間代表中等分化程度；Gst值在0.15至0.25之間表示較大的分化程度；大于0.25表示分化程度極大[22]，兩種分子標(biāo)記顯示赤芍種群間的遺傳分化程度較大, 且栽培赤芍種群間的遺傳分化程度大于野生種群。基因流(Nm)指生物個體在遷移過程中致使基因從一個種群到另一個種群的過程，Nm在0.44～0.47<1，說明種間產(chǎn)生了明顯的遺傳分化，28個赤芍種群之間的基因流較為豐富。同時觀察到野生種群比栽培種群Nm值高，且野生赤芍種群的遺傳分化主要發(fā)生在種群內(nèi)，這可能是由遺傳漂變引起；而栽培赤芍種群之間的遺傳分化較為明顯，種群間的基因交流較少導(dǎo)致Nm值低。

表5 基于ISSR和RAPD的赤芍種群的遺傳分化分析

2.4 聚類分析

根據(jù)ISSR的擴(kuò)增結(jié)果得出0/1矩陣，經(jīng)過NTSYS2.10軟件計算的遺傳距離構(gòu)建聚類分析圖，遺傳距離變化范圍為0.115 1～0.343 8(圖2，A)，28個赤芍種群可約在遺傳距離0.234處被分為5大類。第一類包括除了LK野生種群外的其余11個野生種群，還有YKS、ARQ1、ARQ2、WNTQ2和ZLQ 5個栽培種群組成；第二類包括LK、LK1和FS種群，這3個種群分別來自黑龍江省和吉林??；第三類只包括ELC3種群；第四類包括WNTQI、DL1、BZ、ELC4、LY、HHHT1、HHHT2種群；第五類只包括ARQ3種群。

種群編號同表1圖2 基于ISSR (A)和RAPD (B)的UPGMA 聚類結(jié)果圖The population codes are same as Table 1Fig.2 UPGMA dendrogram based on ISSR (A) and RAPD (B) markers

基于RAPD分子標(biāo)記與ISSR方法得到的結(jié)果相似，遺傳距離變化范圍為0.095 5～0.286 2，在遺傳距離0.179處同樣將28個赤芍種群分為5類(圖2,B)。第一類包括23個種群，其中包括了全部12個野生赤芍種群和大部分栽培赤芍種群，野生赤芍種群和栽培赤芍種群沒有完全分開；第二類由ELC3種群單獨聚為一類；第三類只有LK1種群；第四類HHHT1種群單獨聚為一類；第五類由HHHT2和BZ2組成。

兩種分子標(biāo)記的聚類結(jié)果顯示YKS、ARQ1、ARQ2、WNTQ2和ZLQ等5個栽培種群總是與野生種群聚在一類，說明這5個栽培赤芍種群與野生赤芍種群的親緣關(guān)系較近；且均顯示栽培赤芍種群ELC3是獨立聚類的，該種群與其他栽培赤芍種群相比差異顯著，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，具有獨特的遺傳背景。ISSR結(jié)果中LK、LK1和FS種群聚為一類，這3個種群分別來自黑龍江省和吉林省，證明種質(zhì)聚類與地理分布有一定的相關(guān)性。但不完全一致，RAPD聚類中同是栽培種的安徽亳州BZ和內(nèi)蒙古呼和浩特HHHT2種質(zhì)聚在一起，以及ISSR聚類結(jié)果中ELC1和WNNTQ1種群、RAPD聚類結(jié)果中EEGN2和ELC2種群也未完全分開，這可能存在人為引種等原因?qū)е滤鼈冊谶z傳背景上相似。

3 討 論

分子標(biāo)記被認(rèn)為是最可靠、最有力的種質(zhì)資源鑒定手段[23]。不同分子標(biāo)記的結(jié)合使用可以根據(jù)各自的特點檢測基因組的不同部分，提高多態(tài)性位點的覆蓋率和均勻度，彌補(bǔ)一種分子標(biāo)記帶來的局限性和弊端[24, 25]。在評價趕黃草[26]、野生艾蒿[27]和紅花[28]種質(zhì)遺傳多樣性的研究中發(fā)現(xiàn)多種分子標(biāo)記技術(shù)的使用可以互相驗證結(jié)果，從多方面、多角度地了解植物資源的遺傳信息，有效地揭示種質(zhì)之間的遺傳多樣性。近年來, 國內(nèi)外學(xué)者對芍藥屬進(jìn)行了大量的遺傳多樣性研究，主要是探討牡丹的種間親緣關(guān)系[29, 30]和觀賞芍藥的群體遺傳關(guān)系[31-32]，而關(guān)于藥用芍藥遺傳結(jié)構(gòu)的研究多集中于白芍[33-34]。內(nèi)蒙古作為赤芍的道地產(chǎn)區(qū)，因其優(yōu)越的自然地理條件及退耕還林政策，赤芍的蘊(yùn)藏量十分豐富，目前對該地區(qū)赤芍道地藥材的分子遺傳研究鮮有報道。本研究應(yīng)用ISSR和RAPD兩種分子標(biāo)記評估不同赤芍種群遺傳多樣性水平、遺傳變異以及種群之間的親緣關(guān)系，對于就地保護(hù)野生赤芍種質(zhì)資源和內(nèi)蒙古赤芍產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

在本研究中，ISSR和RAPD 兩種分子標(biāo)記分析均發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古錫林郭勒盟多倫縣種群(DL)的赤芍遺傳多樣性水平最高，而近代以來一直推崇內(nèi)蒙古多倫縣所產(chǎn)的野生赤芍為最佳道地藥材，使得多倫亦處于生產(chǎn)性赤芍資源瀕危狀態(tài)。因此，亟需就地建立自然保護(hù)區(qū)，制定赤芍資源保護(hù)策略，盡快開展優(yōu)良種質(zhì)基因庫的保護(hù)、研究及科學(xué)引種工作。通過歷代本草的記載發(fā)現(xiàn)，野生赤芍產(chǎn)區(qū)隨著野生資源的枯竭逐漸北移，目前主產(chǎn)區(qū)已轉(zhuǎn)至呼倫貝爾等地[35]。來自呼倫貝爾市的大部分赤芍野生種群具有較豐富的遺傳多樣性，是選育優(yōu)良藥用和觀賞品種的物質(zhì)基礎(chǔ)；而栽培赤芍種群遺傳多樣性降低，可能是由于栽培赤芍所用繁殖材料主要取自野生資源并以分根的方式克隆繁殖，且藥農(nóng)多從經(jīng)濟(jì)價值角度出發(fā)，主觀選擇根較粗壯的植株種植，使得群體的種質(zhì)趨于單一；另外在栽培種群引種馴化過程中，參與馴化的野生種群偏小影響其基因頻率的變化，遺傳多樣性逐漸變窄。

兩種標(biāo)記的聚類結(jié)果雖都將野生種群聚在一類，但栽培赤芍種群和野生赤芍群體之間有所交叉，未完全分開，可能是由于栽培赤芍的種源多來源于野生種，且初期栽培種多用種苗和芽頭無性繁殖[36]。在雪蓮果遺傳研究中認(rèn)為，無性繁殖的營養(yǎng)性質(zhì)會使其遺傳變異性變低[37]，使得栽培種與野生種之間的性狀差異并不顯著，因而難以按產(chǎn)地聚類。獨自聚類的ELC3種群在所有種群中具有最低水平的遺傳多樣性，根據(jù)第四次中藥資源普查了解到內(nèi)蒙古鄂倫春自治旗(縣)赤芍種植歷史悠久，ELC3可能是在人工馴化過程中形成了獨特的基因型種質(zhì)，可作為優(yōu)質(zhì)赤芍新品種進(jìn)行進(jìn)一步培育。對藥用植物而言，次生代謝物是臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，豐富的化學(xué)成分多樣性使其具有更高的進(jìn)化潛力和應(yīng)用價值[38]。次生代謝物的合成和積累主要受內(nèi)部遺傳基礎(chǔ)和外部環(huán)境因素的影響。因此，基于本研究基礎(chǔ)，擴(kuò)大采樣區(qū)域，結(jié)合化學(xué)成分及環(huán)境因子對赤芍資源進(jìn)行更加全面系統(tǒng)的分析和評價，以保存和挖掘優(yōu)良的基因型和化學(xué)型，為赤芍原位保護(hù)、遺傳改良和品種選育提供科學(xué)依據(jù)。