向前勝，張登山，孫 奎，王 寧

(1 青海大學 農(nóng)林科學院，西寧 810016；2 韶關(guān)學院，廣東韶關(guān) 512005)

土壤微生物參與生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)和能量流動，對土壤中的有機質(zhì)礦質(zhì)化和腐殖質(zhì)化具有重要的作用，是土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)的主要驅(qū)動力[1-4]。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性及穩(wěn)定性反映土壤的營養(yǎng)條件[5-6]，進而影響植物的生長發(fā)育和對環(huán)境的適應(yīng)能力[7]。土壤微生物在生命過程中產(chǎn)生的物質(zhì)(如赤霉素和抗菌素)可以促進植物生長，具有增強植物抗病性的作用[8]。土壤細菌是構(gòu)建土壤微生物的主要群體，細菌的多樣性和群落周轉(zhuǎn)易受環(huán)境因素的影響，亦能有效反映環(huán)境變量的狀況[9]；部分真菌共生體可提高植物抗氧化保護酶活性和抗氧化劑含量，同時也能誘導信號物質(zhì)和次生代謝物質(zhì)產(chǎn)生，誘導植物相關(guān)保護基因的表達，以促進植物對非生物逆境的抗性，降低逆境脅迫對植物造成的傷害。對植物生境土壤微生物的空間分布模式的研究可探究其與植物適應(yīng)逆境脅迫的協(xié)同作用機理。

海拔梯度的變化會導致溫度、光照、水分等多種環(huán)境因子的改變，引起山地區(qū)域小氣候、土壤理化特征等梯度效應(yīng)，進而影響土壤微生物生物量、活性及群落結(jié)構(gòu)的變化[10-11]。土壤微生物群落及功能多樣性隨海拔的變化趨勢有多種模式：先上升后下降、單調(diào)遞減、單調(diào)遞增、無規(guī)律等[10,12-16]，主要因研究區(qū)域、研究對象的不同而有差異。海拔梯度對土壤微生物群落組成及多樣性的影響主要是通過影響土壤溫度、養(yǎng)分、理化性質(zhì)等間接產(chǎn)生的。土壤中的各類微生物都有適應(yīng)生長的溫度生態(tài)幅和最適生長溫度，溫度是不同海拔梯度微生物群落變化最重要的環(huán)境影響因素[17]。同時，海拔也會影響土壤養(yǎng)分的含量，其數(shù)量和質(zhì)量可以影響微生物生長，通常被認為是決定土壤微生物生存、物種組成和代謝的關(guān)鍵因素之一[18-19]。土壤pH的變化是土壤中優(yōu)勢真菌和細菌的主要驅(qū)動力[20-21]，土壤中硝態(tài)氮的含量與可溶性有機氮含量具有顯著正相關(guān)性，而可溶性有機氮作為微生物較易利用的溶解性有機質(zhì)，能促進微生物的生長，影響著微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性[22-24]。在高海拔地區(qū)，溫度和氮的有效性是微生物活動和分解的主要制約因素[25-26]。以上研究表明，微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性特征會因海拔梯度的變化趨勢不同而有差異，產(chǎn)生這些差異的原因可能與不同地區(qū)不同海拔位置的植被狀況、氣候條件和土壤環(huán)境存在密切關(guān)系，因此有必要加強不同地區(qū)不同海拔梯度同一植物生境條件下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性變化格局和影響機制的研究。

西北小檗(B.vernae)為小檗科小檗屬的植物，為刺狀灌木，具有抗旱、耐寒、耐鹽堿、耐風蝕，適應(yīng)性強等特性，是一種抗逆性良好的生態(tài)植物。西北小檗體內(nèi)含有豐富的次生代謝物——小檗堿(又名黃連素)，具有能抑制多種癌細胞和治療心血管系統(tǒng)疾病等作用，有較高的藥用價值和經(jīng)濟價值，最新研究表明，小檗堿可用作為新型冠狀肺炎治療的潛在候選藥物[27]。除此之外，西北小檗的花、果和葉均有較高的觀賞價值，可用作庭院綠化的觀賞樹種，果實可用作保健飲料開發(fā)、天然色素提取和制作飼料的原料[28]。青海高原是西北小檗的重要分布區(qū)之一[29]，主要分布在海拔2 300～4 100 m左右，且長勢良好。關(guān)于西北小檗的研究主要集中在其體內(nèi)鹽酸小檗堿含量的變化上，結(jié)果表明西北小檗各部位鹽酸小檗堿的含量隨海拔降低而呈現(xiàn)減少的趨勢[30-33]。目前，尚未有對青海高原不同海拔分布的西北小檗生境中土壤微生物群落組成與多樣性進行系統(tǒng)性的研究?；诖?，本研究以自然分布在青海高原不同海拔梯度的西北小檗生境中的土壤樣本為研究對象，采用高通量測序技術(shù)分析土壤微生物群落組成及多樣性分布特征，探究西北小檗根系與土壤微生物的相互關(guān)系，為將西北小檗用作高海拔城鎮(zhèn)綠化樹種的研究提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2019年秋季，在青海高原按海拔梯度分別在海東市樂都區(qū)上北山林場底(hdld1)、海東市樂都區(qū)上北山林場中部(hdld2)、西寧市大通縣新莊村佛溝(xndt)、黃南州澤庫縣麥秀林場(hnzk)、玉樹州勒巴溝景區(qū)(yslbg)和玉樹州玉樹縣下拉秀鄉(xiāng)(ysxlx)共6處西北小檗的自然分布生境地取樣。以西北小檗主莖為圓心，半徑為25 cm的位置取土樣，分別采集樣點處0～20 cm、20～40 cm、40～60 cm的土層，各土層分別采集4次(東、南、西、北方位)，重復取樣3次，各層土樣均勻混合后裝入兩種自封袋并標記，一類土樣保存在-20 ℃冰箱用于微生物測序分析(保存時間為72 h)，另一類風干保存以用作土壤理化性質(zhì)測定。采樣基本信息見表1。

表1 樣點基本信息

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)測定DNA 提取及16s擴增子測序在北京奧維森基因科技有限公司完成，使用DNA Kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA,U.S.)對6個采樣點共18份樣品提取DNA，獲得的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA，并用分光光度法(260 nm/280 nm 光密度比)進行質(zhì)量檢測，再將樣品于-20 ℃保存以備后續(xù)實驗使用。細菌16SrDNAV3-V4擴增引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)，真菌ITS1片段擴增采用特異引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS1R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。PCR擴增程序為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃(細菌)/56 ℃(真菌)30 s，72 ℃ 30 s，共25(細菌)//33(真菌)個循環(huán)；72 ℃ 5 min，10 ℃保溫。將產(chǎn)物進行膠回收后作為模板進行第二步PCR擴增，采用40 μL反應(yīng)體系：5×Buffer 8 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，Phusion超保真DNA聚合酶0.8U，F(xiàn)/R特異引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板5 μL，ddH2O補至40 μL。PCR擴增程序為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共8個循環(huán)；72 ℃ 5 min，10 ℃保溫。

1.2.2 土壤理化性質(zhì)測定土壤理化性質(zhì)測定方法參考鮑士旦的《土壤農(nóng)化分析》[34]進行，對18個土壤樣品進行理化性質(zhì)測定，每個樣品重復3次。土壤pH值采用pH儀(上海雷磁PHS 3C)測定《NY/T1121.2-2006土壤檢測》；土壤有機質(zhì)含量測定采用《LY/T 1237-1999重鉻酸鉀容量法-外加熱法》；土壤堿解氮含量測定采用堿解擴散法《LY/T1229-1999堿解擴散法》；土壤硝態(tài)氮含量測定采用紫外分光光度計法《GB/T 32737-2016紫外分光光度法》；土壤銨態(tài)氮含量測定采用《LY/T 1231-1999靛酚藍比色法》；土壤速效磷含量測定采用鉬銻抗比色法《HJ704-2014碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法》；土壤速效鉀含量測定采用火焰光度計法《NY/T889-2004乙酸銨提取-火焰光度法》。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過 Illumina MiSeq 平臺進行 Paired-end 測序，測序原始序列上傳至 NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫。下機數(shù)據(jù)經(jīng)QIIME(v1.8.0)軟件過濾、拼接、去除嵌合體，去除打分低于20、堿基模糊、引物錯配或測序長度小于150 bp 的序列。根據(jù)barcodes歸類各處理組序列信息，聚類為用于物種分類的 OTU(operational taxonomic units)，OTU相似性設(shè)置為97%。通過RDP Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp)算法基于細菌數(shù)據(jù)庫(Silva 128)對 OTU 代表序列進行比對分析，并在界(Domain)、門(Phylum)、綱(Class)、目(Order)、科(Family)、屬(Genus)水平注釋群落的物種信息。使用R中g(shù)gplot2[35]包繪制物種在門水平和屬水平上的豐度直方圖。利用Mothur軟件進行α多樣性分析(包括 Shannon指數(shù)、 Chao1指數(shù)), 并利用SPSS 22.0進行Duncan多重比較，分析各樣點土層各指數(shù)間差異顯著性?；?Unweighted Unifrace 距離，使用R(V3.6.0)軟件的vegan(V2.5-6)和pheatmap(V1.0.12)進行聚類分析，在OTU水平上計算18個樣品之間的Bray-cutis距離，pheatmap程序包進行作圖[35]，分析6處土壤樣品間微生物群落差異性。利用SPSS 22.0進行Duncan多重比較，分析6處取樣點各項土壤理化指標間差異顯著性。利用Canoco for Windows 4.5對18個樣品的OTU相對豐度矩陣做去趨勢對應(yīng)分析(detrended correspondence analysis, DCA)，根據(jù)結(jié)果中梯度長度在第一軸上的值，選擇冗余分析(redundancy analysis, RDA)，分析土壤理化指標對細菌、真菌群落多樣性的影響，土壤理化指標解釋量顯著性檢驗利用Monte Carlo置換檢驗方法，置換次數(shù)為999。并利用CanoDraw for windows進行作圖[36]。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物樣品測序結(jié)果

在97%的序列相似度水平上，通過對序列進行質(zhì)控和過濾，共獲得細菌、真菌OTU數(shù)分別為35393個、10719個，細菌種數(shù)大于真菌。

由圖1可知，絕大多數(shù)樣品的稀疏曲線趨于平緩，如ysxlx-2細菌、hdld1-3真菌樣品，即再增大測序深度也不會增加新的OTU數(shù)量，說明該樣品的OTU覆蓋度已達到飽和，能夠反映西北小檗生境中各樣點土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成。而hdld1-1細菌、hnzk-1真菌樣品等的稀疏曲線仍有上升趨勢，尚未達到飽和狀態(tài)，說明隨著測序深度的增加可能會發(fā)現(xiàn)新的細菌和真菌類群。所有樣點中，hdld1樣點的細菌OTU數(shù)量最多，hnzk樣點的真菌OTU數(shù)量最多；除hdld2和yslbg樣點外，其他采樣點土層0～20 cm的細菌、真菌OTU數(shù)量均較20～40 cm和40～60 cm的多。

圖例中“編號-1”、“編號-2”、“ 編號-3”分別表示各樣點0～20 cm、20～40 cm、40～60 cm的土層，下圖均同。圖1 西北小檗生境各樣點土壤細菌(A)和真菌(B)樣品在97%水平下的稀疏曲線“No.-1”, “No.-2” and “No.-3” in the legend represent the soil layers of 0-20 cm, 20-40 cm and 40-60 cm at each sample point, respectively and the same with the following figuresFig.1 Rarefaction curves of soil bacterial (A) and fungal (B) samples in various points of B. vernae habitat at cut off level of 97%

2.2 土壤微生物群落多樣性指數(shù)分析

由表2可知，樣點hdld1的0～20 cm土層細菌OTU數(shù)值(2 540±347)最高。土壤細菌豐富度與多樣性指數(shù)均與OTU數(shù)目變化基本一致，其中hdld1樣點0～20 cm土層的細菌群落的平均Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)最高，分別為3 842.60±265.15和9.87±0.10。

0～20 cm土層：OTU數(shù)值中，ysxlx樣點的最低，且與xndt、hdld2和hdld1樣點的差異顯著；hdld1樣點的最高，說明hdld1樣點0～20 cm土層的細菌物種的數(shù)量最多，與該點中、深層土壤存在顯著差異。Chao1指數(shù)中，ysxlx樣點數(shù)值最低，細菌群落豐富度最低；hdld1樣點數(shù)值最高，與hdld2、hnzk、yslbg和ysxlx樣點存在顯著差異，且與該點中、深層土壤存在顯著差異。Shannon指數(shù)中，各樣點間差異不顯著，hdld1樣點的數(shù)值最高，說明該點表層土壤細菌群落多樣性最高，且高于該點中、深層。

20～40 cm土層：OTU數(shù)值中，ysxlx樣點的最低，與另5處樣點均存在顯著差異；xndt樣點數(shù)值最高，說明該樣點該土層的細菌物種的數(shù)量最多。Chao1指數(shù)中，ysxlx樣點數(shù)值最低，細菌群落豐富度最低，且與其他5個樣點均存在顯著差異；hdld2樣點數(shù)值最高，與其他樣點差異不顯著，但與該點40～60 cm土層差異顯著。Shannon指數(shù)中，ysxlx樣點數(shù)值最低，除與xndt樣點存在顯著差異外，與另4個樣點無顯著差異；xndt樣點數(shù)值最高，該點各土層間無顯著差異。

40～60 cm土層：OTU數(shù)值中，hdld2樣點的最低，除與xndt樣點存在差異不顯著外，與其他樣點均存在顯著差異，hdld1樣點該土層的細菌物種數(shù)量最多。Chao1指數(shù)中，xndt樣點數(shù)值最低，細菌群落豐富度最低，除與yslbg樣點存在差異顯著外，與其他樣點差異不顯著；yslbg樣點的數(shù)值最高，細菌群落豐富度最高，該點各土層間差異不顯著。Shannon指數(shù)中，hdld2樣點數(shù)值最低，細菌群落多樣性最低，與其他樣點間差異不顯著；hdld1樣點數(shù)值最高，細菌群落多樣性最高，且該點各土層間差異不顯著。

土壤真菌豐富度及多樣性比較結(jié)果見表2，hnzk樣點0～20 cm土層的OTU數(shù)及Chao1指數(shù)數(shù)值(3 410.34±456.30)最高，xndt樣點0～20 cm土層的Shannon指數(shù)數(shù)值(6.86±0.26)最高。

表2 土壤樣品微生物豐富度和群落多樣性指數(shù)

0～20 cm土層：OTU數(shù)值中，yslbg樣點的最低，除與ysxlx樣點的差異不顯著外，與另4處樣點的差異顯著；hnzk樣點最高，說明hnzk樣點0～20 cm土層的真菌物種的數(shù)量最多，與該點中、深層土壤存在顯著差異。Chao1指數(shù)中，各樣點間存在顯著差異，yslbg樣點數(shù)值最低，真菌群落豐富度最低；hnzk樣點數(shù)值最高，且該點各土層間土壤存在顯著差異。Shannon指數(shù)中，ysxlx樣點數(shù)值最低，說明該點表層土壤真菌群落多樣性最低，與其他5處樣點存在顯著差異，且該點各土層間存在顯著差異；xndt樣點數(shù)值最高，說明該樣點表層土壤真菌群落多樣性最高，除與ysxlx樣點差異顯著外，與另外4處樣點間差異不顯著。

20～40 cm土層：OTU數(shù)值中，ysxlx樣點的最低，除與yslbg樣點差異不顯著外，與另4處樣點均存在顯著差異；xndt樣點數(shù)值最高，說明該樣點該土層的真菌物種的數(shù)量最多。Chao1指數(shù)中，yslbg樣點數(shù)值最低，真菌群落豐富度最低，且與其他5個樣點均存在顯著差異；hnzk樣點數(shù)值最高，除與xndt樣點差異不顯著外，與其他4處樣點差異顯著。Shannon指數(shù)中，hnzk樣點數(shù)值最低，除與xndt樣點存在顯著差異外，與另4個樣點無顯著差異；xndt樣點數(shù)值最高，真菌群落多樣性最高，該點各土層間無顯著差異。

40～60 cm土層：OTU數(shù)值中，hdld1樣點的最低，除與ysxlx樣點存在差異不顯著外，與其他4處樣點均存在顯著差異；hdld2樣點該土層的真菌物種數(shù)量最多。Chao1指數(shù)中，hdld1樣點數(shù)值最低，真菌群落豐富度最低，與其他樣點均存在顯著差異；hdld2樣點的數(shù)值最高，說明該點該土層真菌群落豐富度最高。Shannon指數(shù)中，ysxlx樣點數(shù)值最低，真菌群落多樣性最低，與其他5處樣點存在顯著差異；hdld2樣點數(shù)值最高，說明其真菌群落多樣性最高，除與xndt樣點存在差異不顯著外，與其他4處樣點均存在顯著差異。

2.3 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成分析

2.3.1 細菌群落結(jié)構(gòu)組成依據(jù)18個土壤樣品細菌門水平分布柱狀圖(圖2，A)，共得到10個細菌類群(相對豐度≥0.1%細菌門)，相對豐度最高的為放線菌門(Actinobacteria)，在不同位置采樣點的平均值分別為47.54%(ysxlx)、23.38%(yslbg)、42.35%(hnzk)、36.22%(xndt)、30.42%(hdld1)和21.93%(hdld2)，其中ysxlx處數(shù)值最高，而各土層中hnzk-1的相對豐度高達52.23%。其余前幾個細菌門的相對豐度由高至低依次為變形菌門(Proteobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)等。

在細菌屬分類水平上共得到21個類群(相對豐度≥0.1%細菌屬)(圖2，B)，尚未鑒定出來的未分類細菌屬相對豐度最高，除hnzk樣點相對較低外，其余樣點所處的生境類型條件下相對豐度均高于63.71%，各土層中，xndt樣點40～60 cm中相對豐度高達75.64%。hnzk樣點中除放線菌門的未分類細菌屬之外，Gaiella、RB41、硝化螺旋菌屬(Nitrospira)、土微菌屬(Pedomicrobium)、Iamia、和土壤紅桿菌屬(Solirubrobacter)分別占總量的2.43%、1.79%、1.11%、1.23%、1.02%和1.64%。

圖2 西北小檗生境0～60 cm土層土壤細菌門(A)和細菌屬(B)群落結(jié)構(gòu)組成Fig.2 The structure composition of soil bacterial phylum and genus community in 0-60 cm soil layers with B. vernae habitat

2.3.2 真菌群落結(jié)構(gòu)組成根據(jù)真菌門水平分布柱狀圖(圖3，A)，共得到8個真菌類群(相對豐度≥0.1%真菌門)，其中子囊菌門(Ascomycota)相對豐度最高，在hnzk、hdld1和hdld2中相對豐度均高于60%，各樣點中相對豐度最高的為hnzk(70.34%)，各土層中hnzk樣點20～40 cm的相對豐度最高，達77.95%。其次為擔子菌門(Basidiomycota)，ysxlx和yslbg中的相對豐度均大于44%，ysxlx樣點40～60 cm土層中高達70.92%。除此之外，xndt和hdld1樣點的球囊菌門(Mortierellomycota)相對豐度分別為24.59%和22.18%，高于其他樣點。其余真菌類群相對豐度較低，同時具有未分類真菌門存在。

在真菌屬水平柱狀圖上可以看出(圖3,B)，共得到59個真菌類群(相對豐度≥0.1%真菌屬)，以子囊菌門的未分類真菌屬相對豐度最高，集中表現(xiàn)在樣點ysxlx和hdld2中，均超過49%，其中ysxlx樣點土層40～60 cm相對豐度最大，為79.30%。被孢霉屬(Mortierella)在樣點xndt的相對豐度最高，為23.58%，在土層xndt-1、xndt-2、hdld1-1和hdld1-2中的相對豐度較高，分別為23.64%、31.16%、34.63%和25.95%；子囊菌門古根菌屬(Archaeorhizomyces)在樣點hnzk相對豐度最高，為33.77%，在該處土層20～40 cm和40～60 cm中的相對豐度較高，分別為60.90%、39.81%；珊瑚菌屬(Clavaria)在樣點yslbg的相對豐度最高，為24.33%，在該處土層20～40 cm和40～60 cm中的相對豐度較高，分別為20.46%、52.49%；絲蓋傘屬(Inocybe)在樣點yslbg的相對豐度最高，為9.91%，在該處土層20～40 cm中的相對豐度較高，為16.42%；青霉菌屬(Penicillium)在樣點hnzk的相對豐度最高為5.98%，在該處土層0～20 cm中相對豐度較高，為17.55%；腐質(zhì)霉屬(Humicola)在樣點hdld2的相對豐度最高為7.41%，在該處土層0～20 cm中相對豐度較高，為14.70%。但這6個屬在其余樣品中比例不高。

圖3 西北小檗生境0～60 cm土層土壤真菌門(A)和真菌屬(B)群落結(jié)構(gòu)組成Fig.3 The structure composition of soil fungi phylum and genus community in 0-60 cm soil layers with B. vernae habitat

2.4 土壤微生物群落多樣性差異分析

基于Bray-cutis距離，在OTU水平上利用物種有無及其相對豐度信息進行各采樣點土壤樣品微生物群落多樣性相似性分析，紅色越深表示差異性越大，相似性越小，而藍色越深代表差異性越小，相似性越大。如圖4，A中，ysxlx與yslbg、hnzk、xndt、hdld1和hdld2采樣點的土壤細菌群落多樣性具有差異(d>0.50)，hnzk-1與yslbg-2、yslbg-3的差異較大(d>0.69)。而相比之下，yslbg與hdld2最近(d=0.46)，可以看出，不同采樣點土壤細菌群落多樣性具有一定的差異。在同一采樣點，不同土層的細菌群落的多樣性具有相似性，特別是在hdld1樣點中最為顯著(hdld1-2與hdld1-3最早被分出，d =0.24)。

如圖4，B，同一樣點不同采樣土層真菌群落多樣性相似性較大，各采樣點間的相似性不同。ysxlx-1與ysxlx-2最先被分出，因此具有較高的相似性(d=0.28)，說明兩者在物種組成及相對豐度上與其他采樣點存在較大差異。 ysxlx與yslbg、hnzk、xndt、hdld1和hdld2具有差異性(d>0.87)，yslbg-2、yslbg-3與ysxlx-1、ysxlx-2、ysxlx-3的差異性較大(d>0.90)。相比之下，xndt與hdld1關(guān)系最近，但兩者相似度并不高(d=0.78)。因此，不同采樣點和采樣土層的差異會影響真菌群落多樣性。

圖4 西北小檗生境土壤樣品細菌(A)和真菌(B)群落多樣性分析Fig.4 Analysis of the diversity of bacterial(A) and fungal(B)communities in soil samples with B. vernae habitat

2.5 土壤環(huán)境因子及其對微生物群落多樣性的影響分析

2.5.1 土壤理化指標測定結(jié)果從表3分析可知，西北小檗各采樣點土壤均呈弱堿性，且隨著土壤深度增加，pH值增大，隨海拔梯度變化的趨勢不明顯。xndt樣點40～60 cm土層的pH最高，為8.54。

表3 西北小檗生境土壤理化性質(zhì)表

各樣點的有機質(zhì)(OM)、速效鉀(AK)、速效磷(OP)、硝態(tài)氮(N)、堿解氮(AN)和銨態(tài)氮(A)值隨海拔梯度變化的趨勢不明顯，但部分指標隨土層深度變化呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律。其中，土壤的速效鉀、速效磷和硝態(tài)氮值表現(xiàn)出隨土層深度增加而遞減的趨勢，有機質(zhì)、堿解氮值表現(xiàn)出土壤0～20 cm土層均高于20～40 cm、40～60 cm土層，而銨態(tài)氮值在ysxlx和hdld2樣點表現(xiàn)出隨土層深度增加而增加的趨勢，其他樣點則表現(xiàn)出隨深度增加而遞減的趨勢。hdld2樣點的0～20 cm土層的有機質(zhì)、速效鉀、速效磷和堿解氮數(shù)值最高，分別為32.46 g/kg、354.89 mg/kg、11.25 mg/kg和369.54 mg/kg；xndt樣點0～20 cm土層的硝態(tài)氮數(shù)值最高，為17.25 mg/kg；hdld2樣點的40～60 cm土層的銨態(tài)氮數(shù)值最高，為6.92 mg/kg。

2.5.2 土壤理化指標與微生物群落多樣性關(guān)系分析進行DCA分析計算，結(jié)果lengths of gradient<3，即土壤理化性質(zhì)就細菌、真菌類群分布產(chǎn)生的影響應(yīng)該利用RDA進行分析, 用RDA分析各采樣點土壤環(huán)境因子與細菌、真菌群落之間的關(guān)系(圖5)。

細菌RDA 冗余分析結(jié)果(圖5，A)顯示，土壤理化性質(zhì)對細菌群落在第一主坐標軸的解釋度為47.10%，在第二主坐標軸的解釋度為12.21%。N、AK、OM、OP和pH線段長度較長，說明其對細菌群落組成影響較大，而A的線段長度較短，說明對細菌群落組成影響較小。Gaiella、Nordella、玫瑰彎菌屬(Roseiflexus)與pH正相關(guān)，與其他指標呈負相關(guān)；RB41、AKYG587、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、侏囊菌亞目的Haliangium與OM、AK、A、AN、OP和N均呈正相關(guān)，與pH呈負相關(guān)；硝化螺旋菌(Nitrospira)與A、pH和OM正相關(guān)，與其他指標呈負相關(guān)；土微菌屬(Pedomicrobium)、Pseudonocardia與N、OP、AN、AK正相關(guān)，與OM不相關(guān)，與A、pH呈負相關(guān)；Iamia與文中各指標均呈負相關(guān)；紅色桿菌亞目的Solirubrobacter、芽球菌屬(Blastococcus)、Candidatus_Alysiosphaera、德沃斯氏菌屬(Devosia)、鞘脂單胞菌屬(Sphin-gomonas)、Bradyrhizobium與A、pH呈負相關(guān)，與其他指標正相關(guān)；中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)與N、OP、AN呈正相關(guān)，與AK不相關(guān)，與其他指標負相關(guān)；分枝桿菌屬(Mycobacterium)與N、OP、AN、AK呈正相關(guān)，與其他指標負相關(guān)；Variibacter與N、OP、AN、AK、OM正相關(guān)，與A不相關(guān)，與其他指標負相關(guān)；生絲微菌科的Rhodoplanes、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)與N、OP、AN、AK、OM正相關(guān)，與其他指標負相關(guān)。綜上，與pH、N、OP、AN、AK呈正相關(guān)的細菌屬較多，與A呈正相關(guān)的細菌屬較少。

真菌RDA冗余分析結(jié)果(圖5，B)顯示，土壤理化性質(zhì)對真菌群落在第一主坐標軸的解釋度為19.34%，在第二坐標軸的解釋度為14.14%。OP、N、AK和pH的線段長度較長，說明其對真菌群落組成影響較大，而A、OM、AN的線段長度較短，說明對真菌群落組成影響較小。被孢霉菌屬(Mortierella)、外瓶柄霉屬(Exophiala)、青霉屬(Penicillium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、木層孔菌屬(Phellinus)和Gibberella與OP、AK、N正相關(guān)，橘黃刺杯菌屬(Cookeina)、古根菌屬(Archaeorhizomyces)、Hygrocybe與AK、N正相關(guān)，Tetracladium與AK、OP正相關(guān)，Dactylonectria、Podospora、Ilyonectria與OP正相關(guān)，珊瑚菌屬(Clavaria)與N正相關(guān)，Oidiodendron、珊瑚菌屬與AK不相關(guān)，橘黃刺杯菌屬與OP不相關(guān)。角擔菌屬(Ceratobasidium)、Halegrapha、Inocybe、Cadophora與AN、pH、A、OM呈正相關(guān)，古根菌屬、Hygrocybe和Clavaria與AN、pH、A呈正相關(guān)，木層孔菌屬、赤霉屬(Gibberella)、橘黃刺杯菌屬與AN呈正相關(guān)，Tetracladium、樹粉孢屬(Oidiodendron)、Ilyonectria、Podospora、Dactylonectria和Pseudeurotium與OM呈正相關(guān)。綜上，與N、AK、OP呈正相關(guān)的真菌屬最多。

a1.Gaiella; b1.RB41; c1.硝化螺旋菌屬; d1.土微菌屬; e1.Iamia; f1.土壤紅桿菌屬; g1.芽球菌屬; h1.玫瑰彎菌屬; i1.假諾卡氏菌屬; j1.Nordella; k1.鞘氨醇單胞菌; l1.Haliangium; m1.Variibacter; n1.慢生根瘤菌屬; o1.紅游動菌屬; p1. Mycobacterium; q1.絲狀細菌屬; r1.Mesorhizobium; s1.Gemmatimonas; t1. Nocardioides; A1.被孢霉屬; B1.子囊菌門古根菌屬; C1.珊瑚菌屬; D1.絲蓋傘屬; E1.青霉菌屬; F1.腐質(zhì)霉屬; G1.外瓶柄霉屬; H1.Pseudeurotium; I1.Tetracladium; J1.Dactylonectria; K1.角擔菌屬; L1.土赤殼屬; M1.赤霉屬; N1.濕傘屬; O1.樹粉孢屬; P1.Halegrapha; Q1.Cadophora; R1.針層孔菌屬; S1.Cookeina; T1.柄孢殼菌屬圖5 西北小檗生境土壤理化指標和細菌(A)、真菌(B)群落多樣性的RDA分析a1. Gaiella; b1. RB41; c1. Nitrospira; d1. Pedomicrobium; e1. Iamia; f1. Solirubrobacter; g1. Blastococcus; h1. Roseiflexus; i1. Pseudonocardia; j1. Nordella; k1. Sphingomonas; l1. Haliangium; m1. Variibacter; n1. Bradyrhizobium; o1. Rhodoplanes; p1. Mycobacterium; q1. Candidatus_Alysiosphaera; r1. Mesorhizobium; s1. Gemmatimonas; t1. Nocardioides; A1. Mortierella; B1. Archaeorhizomyces; C1. Clavaria; D1. Inocybe; E1. Penicillium; F1. Humicola; G1. Exophiala; H1. Pseudeurotium; I1. Tetracladium; J1. Dactylonectria; K1. Ceratobasidium; L1. Ilyonectria; M1. Gibberella; N1. Hygrocybe; O1. Oidiodendron; P1. Halegrapha; Q1. Cadophora; R1. Phellinus; S1. Cookeina; T1. PodosporaFig.5 RDA of soil physical and chemical indexes and diversity of bacterial (A) and fungal (B) communities with B. vernae habitat

3 討 論

3.1 西北小檗生境中土壤微生物的特征

從西北小檗生境中各采樣點來看：土壤均呈弱堿性，土壤微生物中細菌OTU數(shù)目多于真菌，說明在本研究區(qū)域細菌的繁殖能力要強于真菌。各樣點不同土層的細菌、真菌OTU數(shù)量不同。整體來看，各樣點0～20 cm土層的細菌OTU數(shù)目較20～40 cm或40～60 cm的多，其中海東樂都1號樣點的0～20 cm、40～60 cm土層及西寧大通樣點的20～40 cm土層最多，玉樹下拉秀樣點0～20 cm、20～40 cm土層及海東樂都2樣點40～60 cm土層最少。真菌OTU數(shù)目在各土層表現(xiàn)規(guī)律性不明顯，黃南澤庫樣點的0～20 cm、40～60 cm土層及西寧大通20～40 cm土層最多，玉樹勒巴溝樣點0～20 cm土層、玉樹下拉秀樣點20～40 cm和海東樂都1號樣點40～60 cm土層最少。海東樂都1號樣點所處海拔位置低，年均溫等生境條件均優(yōu)于其他樣點；玉樹下拉秀樣點所處海拔較高，多高寒草甸植被覆蓋，生境條件較其他樣點差。

西北小檗生境中土壤細菌組成包括放線菌門、變形菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、硝化螺旋菌門、擬桿菌門、厚壁菌門等，8個細菌門相對豐度較大，其相對豐度之和在所有土壤樣品中占到土壤細菌總量的96.92%以上，說明其為優(yōu)勢細菌群。本研究區(qū)域6個采樣點中，放線菌門、變形菌門的相對豐度較大，其中玉樹下拉秀樣點各土層的放線菌門相對豐度較大，海東樂都2號樣點各土層的相對豐度最??；玉樹勒巴溝樣點各土層變形菌門相對豐度較大，玉樹下拉秀樣點的相對豐度最小。放線菌門作為土壤中一類重要的微生物菌群，對自然界的碳、氮物質(zhì)循環(huán)有重要影響[37]，相對豐度大則更能適應(yīng)各種極端(如低溫、厭氧及營養(yǎng)貧乏等)的生態(tài)環(huán)境[37]；而變形菌門則具有較強的適應(yīng)能力，包含多種代謝功能的種類，能適應(yīng)玉樹勒巴溝高寒堿性土壤的環(huán)境[35]。其他門類細菌在各采樣點均有分布，只是比例有差異，說明在西北小檗生境土壤細菌特有性程度低。在屬水平上，Gaiella和Iamia在玉樹下拉秀樣點的相對豐度最高，RB41和土微菌屬在玉樹勒巴溝樣點相對豐度最高?？赡苡捎谖鲗幋笸狱c土壤中的硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和堿解氮的含量均高于其他樣點，而硝化螺旋菌屬亦可作為硝化細菌，能將土壤中的亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽，因此，硝化螺旋菌屬和土壤紅桿菌屬在西寧大通樣點的相對豐度較高。

本研究中土壤真菌在門水平上整體相對豐度最高的為子囊菌門，在屬水平上存在未分類類群，說明在青海高原西北小檗生境土壤中具有發(fā)掘真菌新種的潛力。子囊菌門真菌在玉樹下拉秀和玉樹勒巴溝樣點的相對豐度較其他4個樣點的低，而擔子菌門真菌則在各樣點的相對豐度呈現(xiàn)出相反的趨勢，且均表現(xiàn)出隨著土層加深，其相對豐度逐漸增大。其原因可能是由于玉樹下拉秀鄉(xiāng)和玉樹勒巴溝樣點所處位置海拔高、溫度低、土壤表層的有機質(zhì)豐富，子囊菌門真菌的腐生菌對動植物殘體進行的分解活動減慢，繁殖速度降低，因而導致該真菌相對豐度較低；而擔子菌門的一些大型真菌對枯枝落葉和有機質(zhì)具有較強的降解作用，由于高海拔樣點土壤有機質(zhì)含量較高，因而擔子菌門的相對豐度較大。而在其他低海拔樣點，由于環(huán)境條件、土壤理化性質(zhì)及野生動物活動的差異，可能會影響土壤不同土層子囊菌門真菌的相對豐度，這與其他區(qū)域植物物種多樣性、土壤肥力與真菌群落物種多樣性正相關(guān)的研究結(jié)論具有相似性[39-41]。

在屬水平上，古根菌屬真菌的分布范圍較廣，其主要生長于土壤中植物根部的附近，在黃南澤庫樣點西北小檗生境中的20～40 cm和40～60 cm土層中相對豐度值較大，主要原因可能是因為該區(qū)域西北小檗的根系主要分布在深于20 cm的位置處，該屬真菌可能與西北小檗植物根系存在某一種共生關(guān)系所致。兩者的關(guān)系將成為本課題組今后繼續(xù)研究的方向之一。珊瑚菌屬真菌主要分布在林地土壤中，少數(shù)腐生于樹木或其他植物殘體上[42]，在玉樹勒巴溝樣點20～40 cm和40～60 cm土層土壤中相對豐度較高的原因可能是與該區(qū)域處于自然保護區(qū)內(nèi)林地有關(guān)，林木自然更新后，土壤中的枯枝落葉為該屬真菌的繁殖提供了適宜的條件。被孢霉屬真菌是一種森林樹種的菌根真菌，對甾族化合物有生物轉(zhuǎn)化作用，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)被孢霉屬菌根真菌能有效促進鐵皮石斛對礦質(zhì)元素的吸收，并能與鐵皮石斛形成良好的共生關(guān)系[43]。在西寧大通和海東樂都1號樣點中0～20 cm、20～40 cm的土層中相對豐度較高，可能說明該屬真菌在較低海拔范圍內(nèi)受到土壤理化性質(zhì)的影響較大，并可能與部分生物物種有穩(wěn)定的共生關(guān)系。西北小檗生境中真菌種類主要為子囊菌門和擔子菌門類真菌，具體類別會因生境差異和土層不同而有差異，其相對豐度與周圍的環(huán)境條件也可能存在一定的關(guān)系。

土壤微生物群落多樣性除受生物性因素影響外，通常還受土壤理化因子、海拔等環(huán)境因素的驅(qū)動，真菌和細菌對不同環(huán)境因素的敏感性不同[44]。尤其是海拔、土壤化學性質(zhì)對土壤表層(0～20 cm)微生物種類及數(shù)量影響程度較為顯著[45-46]。海東樂都2號樣點位置的海拔較玉樹下拉秀樣點低，海東樂都2號樣點0～20 cm、20～40 cm土層和海東樂都1號樣點0～20 cm、20～40 cm、40～60 cm土層的細菌群落多樣性均高于玉樹下拉秀樣點相對應(yīng)土層。

真菌和細菌代謝底物有所不同，真菌抵抗環(huán)境脅迫的能力比細菌強[47]，其群落多樣性也受到海拔和土壤理化性質(zhì)的影響，但表現(xiàn)出的特性與細菌不同。本研究區(qū)域中，較高海拔位置的玉樹下拉秀和玉樹勒巴溝樣點各土層的真菌多樣性要低于其他低海拔位置的樣點，這與Wang等[46]在林芝色季拉山對真菌、細菌和古菌豐度和多樣性與海拔的關(guān)系的研究結(jié)論相似，說明西北小檗生境土壤中真菌群落的多樣性會受到海拔因素的影響。西寧大通樣點所處的生境條件較好，0～20 cm土層的速效磷、硝態(tài)氮等含量較高，而其0～20 cm、20～40 cm土層真菌群落的多樣性均較其他樣點相應(yīng)土層高，可以說明土壤理化性質(zhì)也能影響真菌群落的多樣性。

3.2 海拔對西北小檗生境土壤理化性質(zhì)的影響

在不同海拔位置的西北小檗生境采樣點間，隨著海拔的升高，生境中的各種生態(tài)環(huán)境條件也發(fā)生相應(yīng)的變化(如：年均溫逐漸降低，年均降水量及植被分布產(chǎn)生變化)，土壤理化性質(zhì)各指標數(shù)值也會發(fā)生變化，但隨海拔變化的規(guī)律不明顯。其中，玉樹勒巴溝樣點的土壤pH值較其他樣點高，各樣點間的差異不顯著；海東樂都2號樣點各土層的土壤有機質(zhì)、速效鉀、速效磷、堿解氮、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的數(shù)值均較其他樣點高。各樣點的不同土層間，隨著土層深度增加，土壤pH逐漸增大，土壤有機質(zhì)、速效鉀、速效磷和硝態(tài)氮則成逐漸降低的趨勢，銨態(tài)氮、堿解氮隨土層深度變化的趨勢不明顯。由此還可以說明，土壤深度對土壤化學性質(zhì)的影響程度明顯要強于海拔因素的影響。海東樂都1號樣點位于河灘地，為沙質(zhì)土，因此與其他5個樣點的土壤化學指標的數(shù)值差異較明顯。

在不同土層中，由于受生物和非生物(如淋溶)因素的共同作用，土壤中氮、磷、鉀等物質(zhì)以不同的形式在不斷進行交換，最終會導致土層間理化及生物學性質(zhì)存在差異[48]。對于海拔對土壤理化性質(zhì)影響的相關(guān)研究，目前在不同研究領(lǐng)域的結(jié)論均存在差異，不同土壤的理化性質(zhì)會因研究區(qū)域、海拔范圍、植被類型等因素之間的差異而呈現(xiàn)不同的規(guī)律[49]。

3.3 海拔對西北小檗生境中不同土層土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響

西北小檗生境不同土層土壤微生物細菌群落豐富度和多樣性隨海拔變化的趨勢不一致。隨著海拔升高，0～20 cm、40～60 cm土層的細菌群落豐富度及多樣性呈現(xiàn)出先降低再升高再降低的趨勢，20～40 cm土層的細菌群落豐富度及多樣性則呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。說明隨著海拔升高，年均溫度降低[50]，植被多樣性發(fā)生變化，導致細菌群落的數(shù)量下降，溫度降低有可能是導致細菌群落種類呈現(xiàn)遞減變化的重要原因[51-52]。對于植物多樣性與土壤微生物多樣性的相關(guān)研究表明，植被是土壤微生物賴以生存的營養(yǎng)物質(zhì)和能量來源，食物供應(yīng)(植物)是決定生物多樣性海拔分布趨勢的關(guān)鍵因子[53]，所以植被種類多樣性與土壤微生物多樣性呈顯著正相關(guān)關(guān)系[54]。由于水比熱容較大，臨近水源可縮小不同海拔土壤間的溫度差異，從而影響微生物的生態(tài)分布[55]。本研究中，在海拔升高的同時，植被種類的多樣性和生物量會逐漸減少，但在不同研究區(qū)域的植被分布存在差異，在西寧大通和玉樹勒巴溝樣點出現(xiàn)拐點的原因可能是由于局部小環(huán)境的影響所致。

西北小檗生境中0～20 cm、20～40 cm土層土壤微生物真菌群落豐富度隨著海拔的升高呈現(xiàn)出先升高再降低再升高的趨勢，40～60 cm土層的變化趨勢不明顯；生境中0～20 cm、40～60 cm土層真菌群落多樣性隨海拔升高呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，20～40 cm土層的變化趨勢不明顯。整體來看，玉樹下拉秀和玉樹勒巴溝樣點所處的海拔位置較高，受溫度、土壤理化性質(zhì)等因素的共同影響，所以各土層真菌群落的豐富度和多樣性較低；黃南澤庫樣點的土壤pH值較低，硝態(tài)氮含量較高，所以該樣點各土層真菌群落的豐富性較高；西寧大通樣點所處海拔位置較低，溫度、土壤pH和養(yǎng)分情況有助于真菌群落繁衍，以表現(xiàn)出較高的真菌群落多樣性。

綜上，我們可以發(fā)現(xiàn)西北小檗生境中土壤微生物群落的多樣性會受到地理距離和土壤屬性的共同影響，這與以往對土壤微生物驅(qū)動因子的研究結(jié)果具有相似性[55-57]。

3.4 海拔對西北小檗次生代謝物含量和生境中土壤微生物影響

在高海拔地區(qū)，生態(tài)環(huán)境較為惡劣，植物體內(nèi)次生代謝過程所對應(yīng)的個體自我保護機制得以啟動，對逆境的響應(yīng)基因得以較大程度表達，以減少逆境對植物個體的傷害。部分土壤微生物如叢枝菌根真菌能夠通過提高土壤蛋白酶、多酚氧化酶和脲酶的活性來改善土壤理化性質(zhì)[58]，通過促進植物水分和養(yǎng)分吸收利用，來提高寄主植物對溫度脅迫的耐受性[59,60]，同時還能夠通過誘導植物防衛(wèi)基因的表達，來提高植物對非生物逆境的抗性[19]。很顯然，兩者的協(xié)同作用有助于高海拔地區(qū)植物對非生物逆境的適應(yīng)，以減少外界不利條件對植物體的傷害。

以往研究發(fā)現(xiàn)西北小檗各部位的次生代謝物鹽酸小檗堿的含量隨海拔升高呈現(xiàn)增加的趨勢[3-4]，而本研究發(fā)現(xiàn)土壤中濕傘屬真菌的相對豐度值隨海拔的變化呈現(xiàn)出與植物體內(nèi)次生代謝物含量變化趨勢一致的現(xiàn)象，因此，對于西北小檗植株內(nèi)次生代謝物與生境中土壤微生物兩者之間的具體關(guān)系研究將作為今后探究的方向。

4 結(jié) 論

西北小檗生境土壤中，細菌群落組成包括放線菌門、變形菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、硝化螺旋菌門、擬桿菌門、厚壁菌門等，真菌群落由子囊菌門、擔子菌門等組成。

在其6個樣點中，低海拔位置的海東樂都1號樣點(hdld1)0～20 cm土層的細菌群落豐富性及多樣性均最高，黃南澤庫樣點(hnzk)0～20 cm土層的真菌群落豐富性最高，西寧大通樣點(xndt)0～20 cm土層的真菌群落多樣性最高。隨著海拔升高，西北小檗生境土壤0～20 cm、40～60 cm土層的細菌群落豐富度及多樣性呈現(xiàn)出先降低再升高再降低的趨勢，20～40 cm土層的細菌群落豐富度及多樣性則呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢；0～20 cm、20～40 cm土層土壤微生物真菌群落豐富度隨著海拔的升高呈現(xiàn)出先升高再降低再升高的趨勢，生境中0～20 cm、40～60 cm土層真菌群落多樣性隨海拔升高呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，40～60 cm土層的真菌豐富度及20～40 cm土層的真菌多樣性的變化趨勢不明顯。在同一樣點不同土層，表層土壤的細菌群落豐富性和多樣性均高于中、深層，真菌群落的豐富性和多樣性漸變趨勢則不明顯；在不同樣點其細菌、真菌的相似程度均較低。硝態(tài)氮、速效磷和速效鉀對土壤微生物群落的影響較明顯。同時還發(fā)現(xiàn)，土壤深度比海拔因素對土壤化學性質(zhì)的影響程度要更明顯。

本研究揭示了青海高原鄉(xiāng)土樹種西北小檗在不同海拔的生境中土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)及多樣性的差異，為今后土壤微生物對西北小檗存活的維持機制的研究以及將鄉(xiāng)土樹種用作高海拔城鎮(zhèn)綠化的先鋒樹種生態(tài)適應(yīng)性研究提供理論指導，同時也可為三江源區(qū)高海拔城鎮(zhèn)生態(tài)修復工作的順利開展奠定一定的理論基礎(chǔ)。