馮 猜，周娜娜，孫世宇，周潔羽，孫 威,2*

(1 貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/植物生理與發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽(yáng) 550025;2 西南喀斯特山地生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽(yáng) 550025)

花色苷作為一種天然安全無(wú)毒的水溶性色素，廣泛存在于植物的花、果實(shí)、根、莖、葉等器官的細(xì)胞中，通過(guò)賦予植物由紅、紫紅到藍(lán)等不同的色調(diào)來(lái)吸引昆蟲(chóng)對(duì)其花粉進(jìn)行傳播。研究顯示，植物中的花色苷除具有以上功能外，還具有一定的醫(yī)療藥用價(jià)值，例如，降低血脂、抗氧化、預(yù)防糖尿病，同時(shí)還可用于心腦血管等疾病的治療[1-3]。

二氫黃酮醇(dihydroflavonol) 是花色苷和黃酮醇合成途徑的中間產(chǎn)物，同時(shí)也是二氫黃酮醇4-還原酶與黃酮醇合成酶的底物[4]。二氫黃酮醇4-還原酶 (DFR) 具有底物特異性，它以不同的二氫黃酮醇為底物將催化形成不同的花色苷，并且其功能的缺失將直接導(dǎo)致花色苷無(wú)法形成[5-7]。

日本蛇根草是一種直立的多年生草本植物，花冠近似漏斗形，莖為圓柱形，基部節(jié)上具少數(shù)須根。在中國(guó)四川、江西、臺(tái)灣、貴州、云南等地均有分布。全草皆可藥用，有止咳和祛痰的功效，對(duì)支氣管炎、咯血、扭傷等治療有顯著效果[8-11]。但是，花色苷作為日本蛇根草重要的藥用成分之一，關(guān)于其合成代謝的研究很少，并且關(guān)于其二氫黃酮醇4-還原酶的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

因此，本研究對(duì)日本蛇根草花色苷合成途徑中的關(guān)鍵酶——二氫黃酮醇4-還原酶進(jìn)行研究，成功克隆獲得其基因的全長(zhǎng)cDNA序列，構(gòu)建該基因原核表達(dá)載體，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)完成其重組蛋白的制備與純化，研究結(jié)果可為后續(xù)解析日本蛇根草二氫黃酮醇4-還原酶的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

日本蛇根草(Ophiorrhizajaponica)采自貴州省施秉縣山區(qū)。

1.2 方 法

1.2.1 日本蛇根草總RNA提取與cDNA合成將日本蛇根草置于預(yù)冷的研缽中研磨成粉末，利用OminiPlant RNA Kit(DNase I)試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司)，參照說(shuō)明書(shū)完成其總RNA的提取，采用瓊脂糖凝膠電泳以及核酸定量?jī)x對(duì)RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。檢測(cè)合格后，取1 μg總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒完成其cDNA的合成。

1.2.2OjDFR3基因的克隆以cDNA為模板，利用PCR儀對(duì)OjDFR3進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?94 ℃預(yù)變性 8 min； 94 ℃變性 30 s， 54 ℃退火30 s， 72 ℃延伸65 s，33 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 8 min。將PCR產(chǎn)物利用Gel Extraction Kit試劑盒回收預(yù)期目的片段后連接于pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109后，經(jīng)菌液PCR及酶切驗(yàn)證后，送公司測(cè)序，以確認(rèn)日本蛇根草OjDFR3基因的核苷酸序列。

1.2.3OjDFR3基因生物信息學(xué)分析首先利用ORF finder在線分析軟件預(yù)測(cè)OjDFR3基因的開(kāi)放閱讀框；通過(guò)Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行分析；蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位通過(guò)PSORT(https://psort.hgc.jp/)進(jìn)行分析；利用EXPASY(https://swissmodel.expasy.org/)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及親疏水性的分析；通過(guò)SignalP 5.0 Server(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。

1.2.4 pET32a-OjDFR3原核表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)OjDFR3基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)含有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的上下游引物F (CGGAATTC ATGAAAGATGTCAATGGT)和R(CGGAATTCATGAAAGATGTCAATGGT)，進(jìn)行原核表達(dá)載體的構(gòu)建。首先利用上述引物克隆獲得含有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的基因，然后將基因構(gòu)建到pMD18-T載體上，測(cè)序確認(rèn)無(wú)突變后，將該質(zhì)粒對(duì)應(yīng)的菌種及pET32a菌種擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行質(zhì)粒提取。隨后對(duì)pET32a質(zhì)粒和T+OjDFR3質(zhì)粒進(jìn)行酶切與瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，回收目的片段；將pET32a和OjDFR3膠回收產(chǎn)物，利用T4-DNA 連接酶在16 ℃金屬浴中連接16 h。次日進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)菌液 PCR、酶切驗(yàn)證無(wú)誤后，將陽(yáng)性質(zhì)粒送公司測(cè)序，并利用相關(guān)生物學(xué)軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，以pET32a-OjDFR3命名測(cè)序正確的質(zhì)粒。

1.2.5 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的確定1)pET32a-OjDFR3轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3)。將測(cè)序正確的 pET32a-OjDFR3質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日挑取單克隆培養(yǎng)進(jìn)行菌液PCR和雙酶切鑒定，將陽(yáng)性克隆送公司測(cè)序，測(cè)序成功后用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2)pET32a-OjDFR3在大腸桿菌BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá) 取驗(yàn)證正確的單克隆菌液，接種于4 mL 氨芐霉素(Amp+)LB培養(yǎng)基中，將空菌BL21(DE3)、pET32a-BL21(DE3)和不加異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)的重組菌pET32a-OjDFR3-BL21(DE3)做空白和陰性對(duì)照，37 ℃搖床，200 r/min，振蕩培養(yǎng)約2.5 h。加入4 μL 1 mol/L IPTG至其終濃度為1 mmol/L，37 ℃，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。誘導(dǎo)結(jié)束后，從各管取出500 μL菌液于1.5 mL EP管中，離心棄上清。用80 μL 8 mol/L尿素重懸沉淀，置于4 ℃冰箱過(guò)夜處理，加入20 μL 5×上樣緩沖液，混勻，于沸水中煮沸5 min，離心，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)。

1.2.6 OjDFR3重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的確定1)誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的確定 取200 μL pET32a-OjDFR3-BL21(DE3)單克隆菌液接種于4管裝有8 mL Amp+抗性LB培養(yǎng)基的離心管中，同時(shí)以pET32a-BL21(DE3)以及BL21(DE3)菌液做對(duì)照，置于37 ℃搖床，200 r/min，振蕩培養(yǎng)約2.5 h后，向含pET32a-OjDFR3-BL21(DE3)菌液的3管離心管中，加入8 μL IPTG至終濃度為1 mmol/L，標(biāo)記，將離心管置于37 ℃搖床分別培養(yǎng)4、6和8 h。將培養(yǎng)完成的菌4 ℃ 5 000 r/min 離心15 min，收集菌體后加入2 mL細(xì)胞裂解液將菌體懸浮，冰浴30 min，在冰浴條件下進(jìn)行細(xì)胞超聲破碎。離心后將沉淀用尿素充分溶解，室溫過(guò)夜。次日以BL21(DE3)、pET32a-BL21(DE3)空載體、pET32a-OjDFR3-BL21(DE3)未誘導(dǎo)表達(dá)菌株做對(duì)照，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

2)誘導(dǎo)劑濃度的確定 在37 ℃最佳誘導(dǎo)時(shí)間下將重組菌分別在IPTG終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mmol/L條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)束后收集菌體，樣品處理方法同上，SDS-PAGE電泳檢測(cè)確定最佳誘導(dǎo)劑濃度。

1.2.7 OjDFR3重組蛋白的分離與純化按照1%接菌量，在最佳誘導(dǎo)條件下進(jìn)行重組蛋白的大量制備。誘導(dǎo)結(jié)束后用50 mL離心管分裝，4 ℃、6 000 r/min離心15 min，棄上清；每100 mL菌體中加入10 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)重懸菌液，隨后冰浴30 min，超聲破碎細(xì)胞。4 ℃、6 000 r/min 離心20 min，加入10 mL 8 mol/L尿素重懸并溶解菌體，室溫過(guò)夜。次日4 ℃、6 000 r/min離心30 min，將上清過(guò)濾后用于過(guò)柱純化。按照填料說(shuō)明書(shū)完成鎳柱的填裝，分別稱(chēng)取0.040 848、0.102 12、0.204 24、0.408 48和1.021 20 g咪唑溶于30 mL 8 mol/L尿素中，將pH調(diào)至7.4，完成各個(gè)濃度咪唑洗脫緩沖液的配置。

首先用20 mmol/L PBS平衡鎳柱，然后將10 mL含有目的蛋白的上清上樣于鎳柱中，重復(fù)上樣3次，分別用濃度為20、50、100、200 和500 mmol/L咪唑洗脫緩沖液各洗10 mL，每個(gè)梯度每2 mL洗脫液收集1管，利用SDS-PAGE電泳驗(yàn)證后，收集電泳條帶大小符合預(yù)期且條帶較為單一的樣品，隨后分別用含有6、4、2 mol/L尿素的透析緩沖液，以及20 mmol/L PBS對(duì)蛋白進(jìn)行透析，以除去尿素，使蛋白緩慢復(fù)性。透析完成后，將透析袋包埋于處于低溫環(huán)境下的變色硅膠中，完成蛋白的濃縮。

2 結(jié)果與分析

2.1 OjDFR3基因的克隆

以cDNA為模板，對(duì)OjDFR3基因進(jìn)行擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物回收后進(jìn)行跑膠驗(yàn)證，片段大小與目的基因大小一致。隨后將回收產(chǎn)物連接于pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化，挑取克隆進(jìn)行菌液PCR及酶切驗(yàn)證，結(jié)果顯示，電泳條帶與目的基因大小一致 (圖1)。

M. Marker Ⅲ; 1. T+OjDFR3質(zhì)粒; 2. T+OjDFR3質(zhì)粒酶切圖1 OjDFR3基因的克隆M. Marker Ⅲ; 1. T + OjDFR3 plasmid; 2. T + OjDFR3 plasmid digestionFig.1 Cloning of OjDFR3 gene

同時(shí)測(cè)序結(jié)果顯示，已成功克隆獲得OjDFR3基因(圖2)，該基因開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1 071 bp，可編碼356個(gè)氨基酸，蛋白分子量為39.52 kD。

圖2 OjDFR3基因核苷酸序列及其編碼氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and amino acid sequence of OjDFR3 gene

2.2 OjDFR3的序列分析

利用Protparam對(duì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，OjDFR3蛋白由20種氨基酸組成，其中亮氨酸含量最多。隨后，利用SignalP5.0Server對(duì)OjDFR3進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，該蛋白不存在信號(hào)肽；二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，其二級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋、延伸鏈、無(wú)規(guī)則卷曲組成，分別占比32.87%、10.96%，56.18%。

利用ProtScale對(duì)蛋白的親水性與疏水性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，OjDFR3蛋白是一種親水性蛋白；同時(shí)亞細(xì)胞定位分析表明，該蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)的可能性最大，占比為45%，而在其他部位定位的概率均低于細(xì)胞質(zhì)；蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，OjDFR3主要以不規(guī)則卷曲為主，占最大比率，其次是α螺旋，而延伸鏈占比最小，以上結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)相一致。

2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將成功引入酶切位點(diǎn)的T載體質(zhì)粒及pET32a質(zhì)粒進(jìn)行酶切與膠回收，隨后用T4-DNA連接酶進(jìn)行連接，過(guò)夜培養(yǎng)后，進(jìn)行菌液 PCR、酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖3所示，酶切條帶大小符合預(yù)期，并且測(cè)序結(jié)果也表明OjDFR3已成功插入pET32a原核表達(dá)載體。

2.4 重組質(zhì)粒pET32a-OjDFR3在 BL21(DE3)中的表達(dá)驗(yàn)證

將測(cè)序正確的pET32a-OjDFR3質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，過(guò)夜培養(yǎng)后挑取克隆進(jìn)行菌液PCR及酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證無(wú)誤后，取BL21(DE3)、pET32a-BL21(DE3)和pET32a-OjDFR3-BL21(DE3)菌液各40 μL，接種于4 mL相應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基。37 ℃、200 r/min，振蕩培養(yǎng)2.5 h后，向各菌液中加IPTG誘導(dǎo)，陰性對(duì)照不加。樣品處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，加IPTG誘導(dǎo)后，目的蛋白條帶明顯變粗，表明pET32a-OjDFR3可以在BL21(DE3)中表達(dá)蛋白。

2.5 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的確定

pET32a-OjDFR3-BL21(DE3)加入IPTG后，分別在37 ℃條件下誘導(dǎo) 4、6、8 h。結(jié)果如圖4，A所示，不同誘導(dǎo)時(shí)間下均產(chǎn)生明顯的目的蛋白，且表達(dá)量差異不明顯，所以確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間為4 h。隨后，進(jìn)行不同IPTG濃度摸索，由圖4，B可以看出，37 ℃誘導(dǎo)4 h終濃度為0.8 mmol/L IPTG的孔道蛋白條帶較粗，所以選擇在該濃度下對(duì)蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。綜上，pET32a-OjDFR3-BL21(DE3)重組蛋白最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為37 ℃、4 h，IPTG濃度為0.8 mmol/L。

M. Marker Ⅲ; 1. pET32a-OjDFR3質(zhì)粒; 2. pET32a-OjDFR3質(zhì)粒酶切圖3 重組質(zhì)粒 pET32a-OjDFR3的構(gòu)建M. Marker Ⅲ; 1. pET32a-OjDFR3 plasmid; 2. pET32a-OjDFR3 plasmid enzyme digestionFig.3 Construction of recombinant plasmid pET32a-OjDFR3

M. 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；A. 1. BL21(DE3)加IPTG; 2. pET32a加IPTG; 3. pET32a-OjDFR3 未加IPTG; 4-6. pET32a-OjDFR3加IPTG誘導(dǎo)4、6 和8 h；B. 1-3. 與A相同; 4-8. IPTG濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L圖4 重組蛋白OjDFR3不同時(shí)間(A)及不同IPTG濃度(B)誘導(dǎo)表達(dá)M. Protein molecular weight marker; A. 1. BL21(DE3) with IPTG; 2. pET32a with IPTG; 3. pET32a-OjDFR3 without IPTG; 4-6. pET32a-OjDFR3 with IPTG induced for 4, 6, 8 h); B. 1-3. The same to A; 4-8. IPTG concentration 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mmol/LFig.4 Expression of OjDFR3 recombinant protein induced at different time points (A) and IPTG concentration (B)

2.6 OjDFR3重組蛋白的分離及純化

確定最佳誘導(dǎo)條件后對(duì)重組菌進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，隨后進(jìn)行目的蛋白的分離與純化。結(jié)果如圖5所示，在100和200 mmol/L咪唑濃度洗脫液下，蛋白純度最好，所以在此基礎(chǔ)上收集條帶單一的目的蛋白洗脫液，利用透析袋及變色硅膠對(duì)重組蛋白進(jìn)行透析和濃縮。結(jié)果顯示，成功制備并純化獲得濃度和純度較好的重組蛋白(圖6)。

M. Blue Plus III; A. 1. pET32a; 2. pET32a-OjDFR3 (未加IPTG); 3. 上樣前; 4. 上樣后; 5-6. PBS洗脫流出液；7-8. 20 mmol/L咪唑脫流出液; 9. 沉淀對(duì)照; B. 1-3、4-8. 分別為20、50 mmol/L咪唑洗脫流出液; 9. 沉淀對(duì)照; C. 1-5、6-8. 分別為100、200 mmol/L咪唑洗脫流出液; 9. 沉淀對(duì)照; D. 1-2、3-7.分別為200、500 mmol/L咪唑洗脫流出液; 8. 沉淀對(duì)照?qǐng)D5 重組蛋白OjDFR3不同咪唑濃度梯度洗脫M. Blue Plus III; A. 1. pET32a; 2. pET32a-OjDFR3 (without IPTG); 3. Before sample loading; 4. After sample loading; 5-6. PBS eluents; 7-8. 20 mmol/L imidazole eluents; 9. Precipitation control; B. 1-3, 4-8. 20 and 50 mmol/L imidazole eluents; 9. Precipitation control; C. 1-5, 6-8. 100 and 200 mmol/L imidazole eluents; 9. Precipitation control; D. 1-2, 3-7. 200 and 500 mmol/L imidazole elution, respectively; 8. Precipitation controlFig.5 Gradient elution of OjDFR3 recombinant protein with different imidazole concentrations

M. 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1. pET32a加IPTG; 2. pET32a-OjDFR3未加IPTG; 3. pET32a-OjDFR3純化前; 4. 純化濃縮后的pET32a-OjDFR3圖6 重組蛋白OjDFR3的純化與濃縮M. Protein molecular weight marker; 1. pET32a with IPTG; 2. pET32a-OjDFR3 without IPTG; 3. Before purification of pET32a-OjDFR3; 4. Purified and concentrated pET32a-OjDFR3Fig.6 Purification and concentration of OjDFR3 recombinant protein

3 討 論

DFR屬于NADPH依賴(lài)性的短鏈還原酶家族，關(guān)于DFR基因的分離要追溯到20世紀(jì)80年代，其最初是由OReilly等[12]采用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法從玉米和金魚(yú)草中分離出來(lái)的。隨后，其他研究者又利用金魚(yú)草DFR表型突變基因作為探針，從矮牽牛中將DFR基因分離出來(lái)[13-14]。研究顯示，二氫黃酮醇4-還原酶在很多植物中已被研究，如穗醋栗[15]、羽衣甘藍(lán)[16]、鳳丹牡丹[17]、毛白楊[18]等。研究?jī)?nèi)容主要包括基因克隆、表達(dá)分析、功能鑒定等，但對(duì)日本蛇根草二氫黃酮醇4-還原酶的研究卻未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)成功克隆獲得日本蛇根草OjDFR3基因，其cDNA全長(zhǎng)為1 071 bp，可編碼356個(gè)氨基酸，翻譯形成蛋白的分子量為39.52 kD。蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析顯示，其理論等電點(diǎn)為5.96，共由20種氨基酸組成，亮氨酸含量最多。同時(shí)PSORT Ⅱ在線軟件分析表明，該蛋白亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)的可能性最大，這一分析結(jié)果與花色苷在細(xì)胞質(zhì)中合成后，轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中發(fā)揮作用的理論相吻合；但卻與芥藍(lán)DFR的定位研究結(jié)果不同，表明不同物種中相同基因編碼的蛋白質(zhì)發(fā)揮作用的位置可能存在差異。

隨后，本實(shí)驗(yàn)在成功克隆獲得日本蛇根草OjDFR3基因的基礎(chǔ)上完成了其重組蛋白的制備。研究顯示，要對(duì)某種蛋白的結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行研究，首先要確保實(shí)驗(yàn)所制備的蛋白是可溶、穩(wěn)定、且折疊正確的。所以在制備OjDFR3重組蛋白時(shí)，首先嘗試通過(guò)低溫誘導(dǎo)、更換表達(dá)菌株、在培養(yǎng)基中添加葡萄糖等方法獲得可溶性重組蛋白，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果均不理想，該蛋白始終以包涵體形式存在。相關(guān)研究表明，蛋白在包涵體中表達(dá)時(shí)，雖然制備過(guò)程中會(huì)變性，但可以在透析時(shí)使用含有不同梯度濃度尿素的透析液，通過(guò)逐步降低變性劑的濃度消除變性劑對(duì)蛋白活性的影響，使蛋白重新折疊復(fù)性。所以參照上述方法，通過(guò)透析復(fù)性與濃縮，成功完成了OjDFR3重組蛋白的制備。但所制備的重組蛋白是否具有活性，還需要進(jìn)一步的酶活實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

前期研究顯示，日本蛇根草中缺失天竺葵素類(lèi)花色苷，所以本研究在成功制備OjDFR3重組蛋白后，將對(duì)其底物特異性，催化效率等進(jìn)行分析，以此來(lái)驗(yàn)證日本蛇根草天竺葵素類(lèi)花色苷的缺失是否與二氫黃酮醇4-還原酶的底物選擇性有關(guān)。綜上，本研究結(jié)果一方面將為日本蛇根草DFR基因的功能解析奠定基礎(chǔ)，另一方面將有助于更好地研究蛇根草，為揭示日本蛇根草花色苷的合成代謝及其他茜草目植物的花色苷代謝研究提供參考。