陳育青，李秋靜，賴鐘雄，林美珍*

(1 漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院 藥學(xué)系，福建漳州 363000；2 福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福州 350002)

金線蓮(Anoectochilusroxburghii)是蘭科(Orchidaceae)多年生草本植物，主產(chǎn)于福建、浙江、云南等地。金線蓮具有祛風(fēng)利濕、平衡陰陽、扶正固本、消炎解毒、清熱涼血等功效，民間常煲湯、泡茶、煎煮等做成藥膳，用于潤肺止咳、保肝降脂、降血糖血壓、抗腫瘤及提高免疫力等治療，是一種經(jīng)濟(jì)價值較高的功能性藥食兩用植物[1]。目前市場上產(chǎn)業(yè)化栽培金線蓮均是組培苗繁殖，導(dǎo)致物種退化。探索金線蓮有性繁殖特性是保護(hù)金線蓮種質(zhì)資源、發(fā)展金線蓮產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵研究基礎(chǔ)。然而，有關(guān)金線蓮的有性繁殖研究極少報道，大多數(shù)基礎(chǔ)研究集中在其藥效成分和藥理作用。

鈣是植物生命中的基本元素，調(diào)控許多重要的生理代謝活動[2-3]。鈣離子在植物細(xì)胞中的生理功能已有報道[4-6]，高等植物有性生殖過程中鈣離子的分布特征和生理功能也有報道[7]?；ㄋ幨侵参镄坌云鞴?，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其發(fā)育是一個精確調(diào)控的生物學(xué)過程。大多數(shù)植物的花藥壁由4層藥壁細(xì)胞組成，它們緊密相連，但形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能不同?；ǚ?雄配子體)的發(fā)育伴隨著一系列細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化，有些變化顯示出鈣離子參與調(diào)控花藥發(fā)育，但因植物種類不同而異。前期作者團(tuán)隊(duì)已對金線蓮花藥發(fā)育的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了研究[8]，本研究對金線蓮花藥發(fā)育中鈣離子的分布特征及其生理功能進(jìn)行分析討論。

1 材料和方法

實(shí)驗(yàn)材料來自于福建省漳州市南靖草本養(yǎng)生生物科技有限公司的二年生組培苗，經(jīng)鑒定為蘭科金線蓮(Anoectochilusroxburghii)。金線蓮常在11-12月開花，總狀花序由2～6朵花組成，每星期取樣1次，共取樣8次，每次采集約20個花藥。先將花藥固定在由0.1 mol/L的磷酸緩沖液配制的2.5%(V/V)戊二醛固定液中[固定液中還加入1%焦銻酸鉀(K2H2Sb2O7·4H2O)固定鈣離子]。組織細(xì)胞中的鈣定位原理是銻可與鈣結(jié)合形成焦銻酸鈣沉淀顆粒，在電子顯微鏡觀察中，電子束不能穿過沉淀顆粒而形成黑色斑點(diǎn)[9]。各時期花藥在戊二醛前固定液中室溫固定3 h。用含1%焦銻酸鉀的0.1 mol/L磷酸緩沖液換洗3次，每次30 min。之后，已換洗的花藥在含1%鋨酸和1%焦銻酸鉀的后固定液中4 ℃再固定12 h。用雙蒸水換洗3次后，系列丙酮脫水，Epon 812樹脂滲透、包埋。包埋的花藥用Leica Ultracut R超薄切片機(jī)做70 nm厚的切片，用醋酸2%雙氧鈾染色20 min。切片干燥后用透射電子顯微鏡(日立HT-7800，日本)觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

金線蓮花冠為左右對稱，外形呈蜘蛛狀，唇瓣2裂，裂片舌狀條形，中間頸部的兩側(cè)各具5～6枚流蘇狀細(xì)裂條(圖版Ⅰ，A)。金線蓮每花有2個呈水滴狀的花藥，2個花藥下方基部相連(圖版Ⅰ，B)。剝開花藥，可見許多呈條形的花粉塊?；ǚ蹓K的形態(tài)大小不一，有的呈一端大一端小的鐮刀形，有的呈長條形或索狀，其體積相差較大(圖版Ⅰ，C)。

花藥包括花藥壁和藥室，在藥室中產(chǎn)生小孢子，并逐漸發(fā)育形成雄配子體，即花粉。本研究結(jié)果根據(jù)金線蓮花藥的發(fā)育過程，分別描述其鈣離子的分布特征。

2.1 花藥壁特征及鈣離子分布

在花藥發(fā)育早期，花藥壁結(jié)構(gòu)由外向內(nèi)為表皮(Ep)、藥室內(nèi)壁(En)、中層(ML)和絨氈層(T)組成。在造孢細(xì)胞時期，花藥壁細(xì)胞已明顯分化，表皮和藥室內(nèi)壁細(xì)胞開始液泡化，但中層和絨氈層細(xì)胞的液泡化程度很低。絨氈層以內(nèi)為造孢細(xì)胞(SC)，可見小液泡(圖版Ⅰ，D)。在開始液泡化的表皮細(xì)胞，其液泡(V)的表面上分布較多鈣沉淀顆粒(圖版Ⅰ，E)，顯示鈣離子與表皮細(xì)胞中的液泡形成有關(guān)。表皮細(xì)胞中一些質(zhì)體合成淀粉粒(S)的現(xiàn)象也很明顯?；ㄋ幈诘淖顑?nèi)層是絨氈層細(xì)胞(T)，這些細(xì)胞中有一個大的細(xì)胞核(n)，含有濃厚的細(xì)胞質(zhì)。雖然在絨氈層細(xì)胞之間的徑向壁中有一些鈣沉淀顆粒，但在絨氈層細(xì)胞內(nèi)鈣沉淀顆粒很少(圖版Ⅰ，F(xiàn))。在絨氈層內(nèi)切向面的藥室內(nèi)為造孢細(xì)胞(SC)。造孢細(xì)胞的細(xì)胞壁有差異，一些較厚的細(xì)胞壁(箭頭所示)已顯示條形花粉塊的界限(圖版Ⅰ，G)。在花粉塊內(nèi)造孢細(xì)胞之間的壁較薄，與花粉塊界壁有一定區(qū)別，顯示金線蓮花粉塊的形成在造孢細(xì)胞時期就已確定。

2.2 造孢細(xì)胞時期鈣的分布特征

造孢細(xì)胞的細(xì)胞核大，占據(jù)了細(xì)胞中央大部分空間。細(xì)胞核中的核仁清晰，染色質(zhì)無規(guī)律分布。造孢細(xì)胞的四周細(xì)胞壁厚薄不同，較厚的為花粉塊的界壁，較薄的為花粉塊內(nèi)部的細(xì)胞壁。造孢細(xì)胞中一些細(xì)胞器和小液泡分散在細(xì)胞核周圍(圖版Ⅰ，H)。在造孢細(xì)胞的細(xì)胞壁中鈣沉淀顆粒較大，細(xì)胞質(zhì)中鈣沉淀顆粒較小。造孢細(xì)胞中的鈣沉淀顆粒分布有一定特異性，細(xì)胞質(zhì)中的鈣沉淀顆粒主要分布在液泡(V)和質(zhì)體(P)表面(圖版Ⅰ，I)。當(dāng)質(zhì)體表面附有較多鈣沉淀顆粒時，質(zhì)體內(nèi)部開始出現(xiàn)淀粉粒(圖版Ⅱ，A)，暗示鈣離子可能與淀粉合成有關(guān)。在細(xì)胞核中有較多的鈣沉淀顆粒，主要分布在核質(zhì)部位，染色質(zhì)中鈣沉淀顆粒較少(圖版Ⅱ，B)，呈現(xiàn)出鈣沉淀顆粒特異分布。

圖版Ⅰ 金線蓮花和花藥結(jié)構(gòu)A.金線蓮花形態(tài)；B.金線蓮的花藥；C.金線蓮的花粉塊；D.金線蓮花藥橫切，示花藥壁結(jié)構(gòu)：表皮(Ep)、藥室內(nèi)壁(En)、中層(ML)、絨氈層(T)、造孢細(xì)胞(SC)；E.花藥表皮細(xì)胞(Ep)結(jié)構(gòu)和其中的鈣沉淀顆粒分布，淀粉粒(S)、液泡(V)；F.花藥絨氈層細(xì)胞(T)結(jié)構(gòu)和其中的鈣沉淀顆粒分布；G.花藥中部的造孢細(xì)胞(SC)出現(xiàn)了花粉塊的界限(箭頭)；H.示花粉塊中的造孢細(xì)胞(SC)和細(xì)胞核(n)；I.造孢細(xì)胞(SC)中的鈣沉淀顆粒分布在液泡(V)和質(zhì)體(P)表面Plate Ⅰ Flower and anther structure of Anoectochilus roxburghiiFig. A. Flower morphology of A.roxburghii; Fig.B. Anther of A.roxburghii; Fig.C. Pollinium of A.roxburghii; Fig.D. Cross section of the anthers shows anther wall structure: epidermis (Ep), endothecium (En), middle layer (ML), tapetum (T), sporogenous cell (SC); Fig.E. Structure of anther epidermal cells (Ep) and distribution of calcium precipitates in it. Starch (S), Vacuole (V); Fig.F. Anther tapetum cell (T) structure and distribution of calcium precipitates in it; Fig.G. The sporogenous cell (SC) in the middle of the anther appear the boundary of pollinium (arrow); Fig.H. Show the sporogenous cell (SC) in the pollinium and nucleus (n); Fig.I. Calcium precipitates distribution on the surface of vacuole (V) and plastid (P)

2.3 小孢子母細(xì)胞時期鈣的分布特征

由造孢細(xì)胞發(fā)育到花粉母細(xì)胞時期常有一些區(qū)分特征。但金線蓮是花粉塊發(fā)育，未觀察到植物經(jīng)典花粉母細(xì)胞的形態(tài)，只能根據(jù)取材時間和細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征來確定小孢子母細(xì)胞時期。金線蓮小孢子母細(xì)胞的明顯特征是分裂前染色質(zhì)(體)靠核膜分布(圖版Ⅱ，C)。與造孢細(xì)胞相比，小孢子母細(xì)胞的結(jié)構(gòu)沒有很大變化，細(xì)胞質(zhì)中質(zhì)體和液泡明顯，但其他細(xì)胞器難以區(qū)分；細(xì)胞中的鈣沉淀顆粒仍然較多分布在細(xì)胞核基質(zhì)中，在染色質(zhì)中較少，同時細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子顆粒也較少(圖版Ⅱ，D)。然而，分裂前的小孢子母細(xì)胞核中的鈣沉淀顆粒數(shù)量明顯增加，主要仍然分布在核基質(zhì)中(圖版Ⅱ，E)。伴隨著小孢子母細(xì)胞的分裂，核膜破裂，染色(質(zhì))體分為二組排列，之間有大量的鈣沉淀顆粒分布(圖版Ⅱ，F(xiàn))，暗示鈣離子可能參與調(diào)控小孢子母細(xì)胞的分裂過程。在小孢子母細(xì)胞的細(xì)胞壁中，鈣沉淀顆粒數(shù)量明顯增加。細(xì)胞中小液泡和質(zhì)體仍然明顯可見，其他細(xì)胞器則不多(圖版Ⅱ，G)。與造孢細(xì)胞相比，小孢子母細(xì)胞的質(zhì)體(P)表面鈣沉淀顆粒明顯增多，并伴隨著質(zhì)體內(nèi)淀粉粒的形成(圖版Ⅱ，H)。

圖版Ⅱ 金線蓮早期花藥中的鈣離子分布特征A.造孢細(xì)胞中的質(zhì)體(P)表面分布有較多的鈣沉淀顆粒；B.造孢細(xì)胞核(n)中有較多的鈣沉淀顆粒，但染色質(zhì)(C)中鈣沉淀顆粒較少；C.小孢子母細(xì)胞(MMC)時期，染色質(zhì)靠核膜分布；D.示小孢子母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中較少鈣沉淀顆粒；E.分裂前的小孢子母細(xì)胞核(n)中，鈣沉淀顆粒達(dá)到最多；F.分裂中的小孢子，二組染色體(c)之間分布大量的鈣沉淀顆粒；G.小孢子母細(xì)胞中的液泡(V)表面和細(xì)胞壁(W)分布一些鈣沉淀顆粒；H.小孢子母細(xì)胞中，一些質(zhì)體(P)表面出現(xiàn)鈣沉淀顆粒并形成淀粉粒Plate Ⅱ Characteristics of calcium distribution in the early anthers of Anoectochilus roxburghiiFig.A. Calcium precipitates distribution on the surface of the plastid (P) in sporogenous cells (SC); Fig.B. There are more calcium precipitates in the nucleus (n) of sporogenous cell, but less in chromatin (C); Fig.C. At the microspore mother cell (MMC) stage, chromatin is distributed along the nuclear membrane; Fig.D. A fewer calcium precipitates distribution in the cytoplasm of microspore mother cells; Fig.E. The maximum calcium precipitates were accumulated in the nucleus (n) of microspore mother cell before meiosis; Fig.F. When the microspore mother cell divided, a large number of calcium precipitates appeared between the two sets of chromosomes (C); Fig.G. Some calcium precipitates distributed on the vacuole (V) surface and the cell wall (W) of microspore mother cells; Fig.H. Calcium precipitates appeared on the surface of plastids (P) and formed starch granules in the microspore mother cells

2.4 小孢子時期鈣的分布特征

金線蓮小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂后形成的小孢子仍然聚集在一起，以花粉塊的方式發(fā)育。由于花粉塊由數(shù)十個甚至上百個花粉組成，位于花粉塊不同部位的花粉發(fā)育特性不同，最顯著的特征是位于花粉塊表面花粉和內(nèi)部花粉的胼胝質(zhì)壁和花粉外壁發(fā)育的差異性。金線蓮花粉母細(xì)胞時期在整個花粉塊表面形成了一層厚厚的含多糖的胼胝質(zhì)壁，但在花粉塊內(nèi)部的花粉母細(xì)胞表面則沒有胼胝質(zhì)壁的形成。減數(shù)分裂后，在早期花粉塊表面仍可看到厚厚的胼胝質(zhì)壁，但在小孢子徑向面和內(nèi)切向面，則沒有胼胝質(zhì)壁結(jié)構(gòu)。在花粉塊內(nèi)部的小孢子表面上也沒有胼胝質(zhì)壁。雖然在小孢子徑向壁部位胼胝質(zhì)壁分叉，但沒有繼續(xù)長入(箭頭)(圖版Ⅲ，A)。顯微放大后清晰顯示在小孢子和胼胝質(zhì)壁之間已開始形成花粉外壁結(jié)構(gòu)(箭頭)。這一結(jié)構(gòu)特征也是確定小孢子的依據(jù)。在花粉外壁和胼胝質(zhì)壁之間，有1層片狀網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，可能是胼胝質(zhì)壁開始降解的產(chǎn)物。在胼胝質(zhì)壁表面，有少量體積較大的鈣沉淀顆粒，在胼胝質(zhì)壁(CW)中，鈣沉淀顆粒較小，數(shù)量較多。在花粉外壁部位，也有一些鈣沉淀顆粒，但在小孢子細(xì)胞質(zhì)中，鈣沉淀顆粒很少(圖版Ⅲ，B)。在花粉塊內(nèi)部，小孢子細(xì)胞壁中有較多的鈣沉淀顆粒，而在細(xì)胞質(zhì)中的鈣沉淀顆粒依然很少(圖版Ⅲ，C)。隨著小孢子的發(fā)育，在小孢子細(xì)胞壁中鈣沉淀顆粒明顯增加，小孢子細(xì)胞質(zhì)中鈣沉淀顆粒也增加(圖版Ⅲ，D)。從小孢子時期的鈣沉淀顆粒分布動態(tài)來看，鈣離子呈現(xiàn)移入小孢子中的趨勢。

2.5 二胞花粉時期鈣的分布特征

金線蓮花粉為二胞型，成熟花粉中含1個生殖細(xì)胞和1個營養(yǎng)細(xì)胞。小孢子分裂后，二胞花粉開始積累淀粉和脂滴的營養(yǎng)物質(zhì)[8]。本實(shí)驗(yàn)中，可看到成熟花粉的外形不規(guī)則，在花粉中積累了許多淀粉粒。在花粉塊表層上已形成了完整的花粉外壁，與其他植物的孢粉素花粉外壁相似，但花粉塊內(nèi)部的花粉則沒有花粉外壁結(jié)構(gòu)，或者花粉外壁不完整(圖版Ⅲ，E)。在成熟花粉塊表面的花粉外壁上(Ex)分布了1層鈣沉淀物(箭頭所示)，在外壁的空隙中也積累了一些鈣沉淀顆粒?；ǚ壑杏写罅康矸哿?S)(圖版Ⅲ，F(xiàn))。在成熟花粉的細(xì)胞質(zhì)中鈣沉淀顆粒主要分布在淀粉粒附近(圖版Ⅲ，G)，或被聚集在小泡中(箭頭所示)(圖版Ⅲ，H)。金線蓮成熟花粉中呈現(xiàn)較豐富的鈣離子。

圖版Ⅲ 金線蓮?fù)砥诨ㄋ幹械拟}離子分布特征A.減數(shù)分裂后的小孢子(M)，示花粉塊表面的胼胝質(zhì)壁(CW)，箭頭示花粉徑向壁部位；B.小孢子(M)合成花粉外壁(箭頭)，在胼胝質(zhì)壁(CW)中分布一些鈣沉淀顆粒；C.花粉塊內(nèi)小孢子(M)之間的壁中出現(xiàn)一些鈣沉淀顆粒；D.隨著花粉塊的發(fā)育，小孢子(M)之間的壁中鈣沉淀顆粒明顯增加；E.開花時，花粉塊中的成熟花粉積累了大量的淀粉粒；在花粉塊的表面有一層花粉外壁，但塊內(nèi)花粉之間無花粉外壁；F.在花粉外壁(Ex)表面附有一層鈣沉淀顆粒(箭頭)，花粉中有大量淀粉粒(s)；G.成熟花粉，鈣沉淀顆粒分布在淀粉粒(S)附近；H.成熟花粉，鈣沉淀顆粒聚集在細(xì)胞質(zhì)小泡中(箭頭)Plate Ⅲ Characteristics of calcium distribution in the late anthers of Anoectochilus roxburghiiFig.A. Shows the callose wall (CW) on the surface of pollinia and the arrows show the radial wall of pollen in the microspore (M) after meiosis; Fig.B. Microspores (M) synthesize the outer wall of pollen (arrow) and distribute some calcium precipitates in the callose wall (CW); Fig.C. Some calcium precipitates appear in the wall between microspores (M) inside pollinia; Fig.D. With the development of pollinia, calcium precipitates increased significantly in the walls between microspores (M); Fig.E. At flowering, the mature pollen in pollinia accumulated a large number of starch grains. There is a layer of pollen outer wall on the surface of pollinia, but there is no pollen outer wall between the pollens within pollinia; Fig.F. There is a layer of calcium precipitates (arrow) on the outer wall (Ex) of the pollen and there are a large number of starch grains (S) in the pollen; Fig.G. There are many calcium precipitates near starch granules of mature pollen; Fig.H. Calcium precipitates gather in cytoplasmic vesicles (arrow) of mature pollen

3 討 論

我們已在前期報道了金線蓮花藥發(fā)育的特殊性，即金線蓮花藥以花粉塊的形式發(fā)育[8]，在造孢細(xì)胞時期確定了花粉塊的輪廓；在造孢細(xì)胞向小孢子母細(xì)胞轉(zhuǎn)變過程中，花粉塊內(nèi)細(xì)胞之間發(fā)生細(xì)胞器和細(xì)胞核的穿壁現(xiàn)象，且在花粉塊表面形成了胼胝質(zhì)壁,但在花粉塊內(nèi)部的小孢子母細(xì)胞之間沒有胼胝質(zhì)壁。減數(shù)分裂后，以花粉塊為單位在其表面形成孢粉素花粉外壁，但在花粉塊內(nèi)部的花粉沒有花粉外壁結(jié)構(gòu)[8]。這些金線蓮花粉發(fā)育的特異性顯示與其他游離花粉發(fā)育有很大差異。本研究進(jìn)一步探索其花藥發(fā)育過程中的鈣離子分布特征，進(jìn)而討論鈣離子在金線蓮花粉發(fā)育中的生理功能。

花藥是植物的雄性器官，其發(fā)育的調(diào)控機(jī)制還不清楚。在小麥[10]中，可育花藥在特定時期和特定部位聚集了較多的鈣離子，而在不育花藥中鈣離子的分布呈現(xiàn)異常，表明花粉發(fā)育與鈣離子有特定的關(guān)系。在萵苣[11]和油茶[12]花粉發(fā)育的鈣離子分布研究中，表明鈣離子含量最高的時期是小孢子時期，尤其在液泡中，顯示鈣離子與液泡的代謝有關(guān)。對羊蹄甲[13]花粉發(fā)育的深入研究證實(shí)，小孢子細(xì)胞質(zhì)中線粒體積累鈣離子后，其內(nèi)膜(嵴)分解，轉(zhuǎn)變?yōu)樾∫号?，這些小液泡膨大最終融合形成一個大液泡，占據(jù)小孢子絕大部分空間并將細(xì)胞核擠到邊緣，形成單核靠邊小孢子。這些研究結(jié)果表明鈣離子在植物花粉發(fā)育的某些環(huán)節(jié)中具有重要的生理功能。

其他植物花藥發(fā)育中鈣離子的分布特征可見報道[10-13]，但蘭科植物花粉發(fā)育中鈣離子的分布特征和生理功能研究尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)金線蓮花藥以花粉塊形式發(fā)育，其鈣離子呈現(xiàn)特異性的分布特征：造孢細(xì)胞時期，在花藥表皮細(xì)胞和藥室內(nèi)壁細(xì)胞的液泡中分布較多的鈣沉淀顆粒，顯示鈣離子與植物細(xì)胞中的液泡發(fā)生和形成有關(guān)；在減數(shù)分裂前期，小孢子母細(xì)胞核中聚集了較多的鈣沉淀顆粒，當(dāng)小孢子母細(xì)胞分裂時，大量的鈣沉淀顆粒分布在二組染色體之間，顯示鈣離子與細(xì)胞分裂有關(guān)；同時，在合成淀粉的質(zhì)體表面覆蓋了較多的鈣沉淀顆粒，顯示鈣離子與花粉細(xì)胞中的質(zhì)體糖代謝功能有關(guān)；開花時，花粉塊表面的花粉外壁上附有1層鈣沉淀顆粒，成熟花粉細(xì)胞質(zhì)中仍有大量的鈣沉淀顆粒被聚集到小泡中，提示成熟花粉中的鈣沉淀顆粒作為儲備鈣離子，為以后花粉萌發(fā)時提供鈣離子。金線蓮花粉發(fā)育中鈣離子的特異時空分布暗示其參與花粉發(fā)育的代謝活動。