朱雄萌，蔣昕晨，席克勇，楊 靜,3，尹軍良，朱永興*

(1 長江大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖北荊州 434000；2 長江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖北荊州 434000；3 重慶工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，重慶 402260)

近年來，工礦業(yè)的迅速發(fā)展，以及化肥、農(nóng)藥的大量使用，導(dǎo)致中國土壤中重金屬含量不斷增加，土壤重金屬污染日趨嚴(yán)重[1]。部分金屬元素，如銅、鐵、鋅、錳等，是植物生長發(fā)育所必需的微量元素，常作為酶的重要輔因子，參與植物的生理生化活動以及代謝過程[2]。但是，必需微量元素積累過高也會對植物細(xì)胞造成毒害，影響植物的生長發(fā)育。例如，過量的錳、銅和鋅會影響植物光合作用的正常進(jìn)行，導(dǎo)致植株黃化，也會造成植物細(xì)胞損傷以及干擾植株對其他離子的吸收[3-4]。此外，還有一些植物生命活動非必需的金屬元素，如鎘、汞和鉛，即使在低濃度下也會對植物體產(chǎn)生毒害，可影響細(xì)胞膜透性、破壞植物抗氧化防御系統(tǒng)以及光合系統(tǒng)；同時，這些非必需金屬元素會在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)并富集到作物的可食用部分，最終威脅人們的身體健康[5-6]。因此，如何提高植物，尤其是農(nóng)作物耐受重金屬脅迫的能力，已經(jīng)引起科研工作者的廣泛關(guān)注。

為應(yīng)對重金屬脅迫，植物逐漸形成了多種重金屬脅迫耐受機(jī)制，通過吸收、排出、螯合和轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬離子以維持生物體內(nèi)金屬離子穩(wěn)態(tài)，降低重金屬離子毒性[7]。植物中存在多個與金屬轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白家族，如重金屬ATP酶(heavy metal ATPase，HMA)、NRAMP家族(natural resistance associated macrophage protein)、CDF家族(cation diffusion facilitator)及ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ZRT-IRT-like protein)等[1]。其中陽離子擴(kuò)散促進(jìn)家族(CDF)是一類廣泛存在于酵母、細(xì)菌、擬南芥等原核和真核生物中的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[3]，其功能是將重金屬離子運(yùn)入特定的細(xì)胞器或運(yùn)出細(xì)胞質(zhì)，維持生物體細(xì)胞中金屬離子穩(wěn)態(tài)[3,8]。

植物CDF轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也被稱為金屬耐受蛋白(metal tolerance protein，MTP)，在植物響應(yīng)重金屬脅迫的調(diào)控過程中起著關(guān)鍵作用。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析以及金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)特異性，可將CDF家族成員分為Mn-CDFs、Fe/Zn-CDFs和Zn-CDFs三個亞家族[8]。三個亞家族可進(jìn)一步細(xì)分為7個組，其中G1(Group 1)、G5和G12屬于Zn-CDF，G8和G9屬于Mn-CDF，G6和G7屬于Fe/Zn-CDF[8-9]。截至目前，已對擬南芥、水稻、小麥、甜橙、蕪菁、茶樹和楊樹等物種進(jìn)行了基因家族分析，分別鑒定到12、10、20、12、18、13和22個MTP基因。部分MTP蛋白的功能也得到初步解析，包括Zn-CDFs亞家族的MTP1、MTP3、MTP4和MTP12，以及Mn-CDF亞家族的MTP8、MTP9和MTP11。其中MTP1、MTP3和MTP4的主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)Zn2+，也可以轉(zhuǎn)運(yùn)Cd2+、Co2+以及Fe2+[8]。MTP5與MTP12可形成蛋白復(fù)合體，將Zn2+轉(zhuǎn)運(yùn)到擬南芥的高爾基體中[15]。MTP8蛋白與Mn2+的穩(wěn)態(tài)維持密切相關(guān)[16]。MTP9定位于質(zhì)膜上，參與黃瓜根系細(xì)胞Mn2+和Cd2+的外排[17]。在擬南芥和水稻中，MTP11轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可增強(qiáng)植物對Mn2+的耐受性[18]。此外，盡管MTP9和MTP10屬于Mn-CDF亞家族，目前尚缺乏關(guān)于MTP9蛋白和MTP10蛋白提高植物對Mn2+的耐受性或參與錳離子轉(zhuǎn)運(yùn)的確切證據(jù)。此外，MTP蛋白G6組和G7組成員的具體功能均不明確，且關(guān)于植物金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族成員的具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究[19-20]。

目前，國內(nèi)外有關(guān)植物MTP的功能研究主要圍繞水稻、擬南芥等模式物種開展，其他物種中MTP參與植物重金屬響應(yīng)的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。黃瓜(CucumissativusL.)是世界范圍內(nèi)重要蔬菜作物，也是中國設(shè)施栽培面積大、種植范圍廣的主要蔬菜作物之一。但由于黃瓜根系分布較淺，再生能力弱，對脅迫環(huán)境敏感，一旦遭受金屬毒害會嚴(yán)重影響黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，系統(tǒng)鑒定黃瓜的MTP基因家族成員，揭示其對重金屬脅迫的響應(yīng)特征，對深入研究MTP在黃瓜抗重金屬毒害中的作用以及利用MTP增強(qiáng)黃瓜對重金屬脅迫的耐受能力，均具有重要的理論和實踐意義。本研究利用生物信息學(xué)方法對黃瓜MTP基因家族成員進(jìn)行鑒定和基因組注釋，并對其基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、蛋白質(zhì)序列、保守結(jié)構(gòu)域和表達(dá)模式等進(jìn)行分析，以期為進(jìn)一步開展黃瓜MTP基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 黃瓜MTP基因家族的鑒定

從黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(http://cucurbitgenomics.org/organism/2)下載黃瓜的全基因組序列。以模式植物擬南芥[9]、水稻[9]、玉米中的MTP蛋白序列為種子序列，BLASTp比對到黃瓜蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(e-value≤1e-10)。同時，利用關(guān)鍵詞“metal tolerance protein”搜索黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫。將得到的序列提交到InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)，確認(rèn)是否含有MTP家族特有的結(jié)構(gòu)域(IPR002524)。

1.2 方 法

1.2.1 多重序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析利用ClustalW2(v2.1)對黃瓜、擬南芥、水稻和玉米的MTP蛋白序列進(jìn)行多重序列比對。通過MEGA7基于LG模型使用鄰接法構(gòu)建無根系統(tǒng)發(fā)育樹，校驗參數(shù)bootstrap值設(shè)置為1 000次[21]，其他參數(shù)為默認(rèn)值。使用IToL(Interactive Tree of Life)在線工具美化系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 染色體分布及跨膜結(jié)構(gòu)域分析從黃瓜基因組注釋文件(GFF3)中提取MTP基因的染色體位置信息，使用MapInspect，根據(jù)位置信息繪制MTP在7條染色體上的分布圖[22]。用ExPaSy提供的在線工具ProtParam對MTP的蛋白質(zhì)特征進(jìn)行分析，包括等電點(diǎn)、相對分子質(zhì)量、蛋白質(zhì)平均疏水性和氨基酸組成。使用在線軟件WoLF PSORT預(yù)測黃瓜MTP蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.2.3 基因結(jié)構(gòu)和motif分析利用在線工具GSDS(Gene Structure Display Server，http://gsds. cbi.pku.edu.cn/)分析黃瓜MTP基因的外顯子和內(nèi)含子組成及分布情況[23]。使用MEME motif搜索工具(http://meme-suite.org/index.html)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)識別黃瓜MTP蛋白的保守基序。除允許識別的motif個數(shù)最大值設(shè)定為5外，其余均使用參數(shù)默認(rèn)。利用TBtools軟件(https://github.com/CJ-Chen/TBtools)繪制基因結(jié)構(gòu)和motif結(jié)構(gòu)圖。

1.2.4 表達(dá)特征分析為初步揭示黃瓜MTP基因的表達(dá)模式，從黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫收集MTP基因在不同發(fā)育階段、不同組織以及多種處理條件下，通過RNA-seq獲得的基因表達(dá)水平FPKM(Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped values)值。用R軟件的pheatmap包繪制熱圖。

1.2.5 熒光定量PCR分析‘津優(yōu)1號’黃瓜種子經(jīng)55 ℃溫水浸泡15 min后，置于28 ℃培養(yǎng)箱避光催芽。出芽后播種于穴盤，放置于人工氣候室中培養(yǎng)，晝夜溫度設(shè)置為25 ℃/18 ℃，相對濕度60%。待植株長到兩葉一心時，移栽到營養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。營養(yǎng)液選用1/2Hoagland營養(yǎng)液，詳細(xì)配方組成參考Zhu等[24]。緩苗5 d后，對植株進(jìn)行重金屬脅迫處理，向營養(yǎng)液中分別添加100 μmol/L ZnSO4·7H2O、100 μmol/L CdCl2、400 μmol/L MnSO4·H2O、40 μmol/L CuSO4·5H2O、50 μmol/L EDTAFeNa·3H2O和45 μmol/L Na2MoO4。經(jīng)3 d的重金屬處理后，每個處理以及對照分別取根系和葉片的樣品，液氮速凍后于-80 ℃冰箱中保存直至使用。

提取植物根系和葉片組織的RNA，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(南京諾唯贊生物科技有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋后作為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR分析。熒光定量PCR使用SYBR qPCR Master Mix試劑(南京諾唯贊生物科技有限公司)，熒光定量反應(yīng)總體系為20 μL，包括SYBR Premix 10 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 2 μL，加水至終體積20 μL，充分混勻離心后于Bio-Rad CFX96實時定量PCR儀上擴(kuò)增(Bio-Rad，Hercules，USA)。每個樣品均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，以Actin基因作為內(nèi)參，引物信息見表1。采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達(dá)量[25]。用SPSS19.0軟件分析差異顯著性并利用Sigmaplot繪圖。

表1 黃瓜MTP基因引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜MTP家族成員的全基因組鑒定

通過本BLASTp比對、關(guān)鍵詞搜索和InterProScan確認(rèn)，從黃瓜基因組中鑒定出10個CsMTP基因家族成員，結(jié)構(gòu)域分析表明它們均屬于陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族(cation efflux)(表2)。根據(jù)擬南芥AtMTP的分類標(biāo)準(zhǔn)以及同源關(guān)系，10個CsMTPs可分為3個亞家族和7個組，分別命名為CsMTP3～CsMTP12。Zn-CDFs亞家族包括G1(Group 1，CsMTP3、CsMTP4a、CsMTP4b)、G5(CsMTP5)和G12(CsMTP12)三個組的5個基因；Fe/Zn-CDF亞家族包括G6(CsMTP7)和G7(CsMTP6)兩個組的2個基因；Mn-CDF亞家族包括G8(CsMTP8)和G9(CsMTP11、CsMTP9)兩個組的3個基因。

2.2 黃瓜MTP蛋白的理化參數(shù)及結(jié)構(gòu)特征

如表2所示，CsMTP基因編碼蛋白的氨基酸序列長度在313(CsMTP7)至876(CsMTP12)之間，相對分子質(zhì)量為33.8～98.5 kD，等電點(diǎn)pI為5.54～8.33。CsMTP的亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，黃瓜Zn-CDFs和Zn/Fe-CDF中的所有成員均定位于液泡膜上。其中2個Mn-CDF成員CsMTP8和CsMTP9被預(yù)測定位于細(xì)胞膜或液泡上。跨膜保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，除CsMTP7存在4個跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD)，CsMTP12存在11個TMD外，其他8個黃瓜CsMTP均具有6個典型的TMD結(jié)構(gòu)域。

表2 黃瓜CsMTP基因鑒定和基本分子特征分析

2.3 黃瓜MTP的系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，黃瓜大多數(shù)CsMTP基因是擬南芥AtMTP的同源基因(圖1)。屬于Zn-CDF亞家族的CsMTP3、CsMTP4和CsMTP5分別與AtMTP3、AtMTP4和AtMTP5有較高的相似性；屬于Mn-CDF亞家族的CsMTP11和CsMTP8分別與AtMTP11和AtMTP8有較高的相似性；而屬于Fe/Zn-CDF亞家族的CsMTP6和CsMTP7與AtMTP6和AtMTP7/OsMTP7有較高的相似性。此外，在黃瓜中未鑒定到與擬南芥AtMTP1、AtMTP2和AtMTP10同源的基因。

2.4 黃瓜MTP保守基序、基因結(jié)構(gòu)和染色體分布分析

本研究對CsMTP中保守基序組成進(jìn)行了分析。根據(jù)黃瓜MTP的結(jié)構(gòu)域組成，共鑒定出10個保守motif(Motif 1～10；圖2，A)。其中，Motif 2由殘基“WFTAFAMRKPNPYRYPIGKKRMQPVGIIVFASVMATLGLQ”組成，與陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(Cation efflux；PF01545)相關(guān)。而由“NHHPEIKHIDTVRAYTFGVHYFVE”殘基組成的Motif 8與鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白二聚體結(jié)構(gòu)域(ZT_dimer；PF16916)相關(guān)。

G1、G5、G6、G7、G8、G9和G12分別代表歸屬于相應(yīng)組(Group)的基因家族成員；At.擬南芥；Os.水稻；Zm.玉米；Cs.黃瓜圖1 黃瓜、擬南芥、玉米和水稻MTP基因的系統(tǒng)發(fā)育分析G1, G5, G6, G7, G8, G9 and G12 represent genes belonging to corresponding group; At. Arabidopsis thaliana; Os. Oryza sativa; Zm. Zea mays; Cs. Cucumis sativusFig.1 Phylogenetic relationship of MTP gene in Cucumis sativus, Arabidopsis, maize and rice

前人研究結(jié)果顯示，所有屬于Zn-CDF的CsMTP蛋白都含有保守的Motif 1、3、4和7，但CsMTP5只含有Motif 1和3(圖2，A)。Mn-CDF亞家族基因的motif數(shù)量以及排布基本相同(Motif 9、2、10、5和2)，這說明它們可能具有相似的生物學(xué)功能(圖2，A)。研究表明，Mn-CDF通常含有保守序列DxxxD(x為任意氨基酸)，而Zn-CDF常含有保守序列HxxxD。本研究中，在Mn-CDF亞家族的CsMTP8、CsMTP11、CsMTP9中識別到基序DxxxD，而在Zn-CDF和Zn/Fe-CDFs亞家族的CsMTP3、4、5和CsMTP7中識別到HxxxD基序的存在(圖3)。

基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析表明，黃瓜CsMTP的內(nèi)含子數(shù)量在1～12個之間。5個Zn-CDF亞家族成員中，除了CsMTP5含有9個內(nèi)含子外，其他4個均含有1個內(nèi)含子(圖2，B)；Zn/Fe-CDF亞家族成員的內(nèi)含子數(shù)目最多，其中，CsMTP6和CsMTP7分別含有11和12個內(nèi)含子；Mn-CDF亞家族的成員CsMTP4a和CsMTP4b中分別含有5和6個內(nèi)含子?；蚍蔷幋a區(qū)(UTR)分析發(fā)現(xiàn)，除CsMTP4a、CsMTP4b和CsMTP8的3′端不含UTR，CsMTP12和CsMTP9的5′端不含UTR外，其他CsMTP兩端均含有UTR區(qū)域。染色體分布分析發(fā)現(xiàn)，除第2和4號染色體上沒有基因外，第1、3、5、6、7號染色體上分別存在3、2、1、2、2個CsMTP基因(圖4)。

2.5 黃瓜MTP的表達(dá)特征分析

為系統(tǒng)認(rèn)識CsMTP的表達(dá)特征，從黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫收集已有的RNA-seq數(shù)據(jù)，對黃瓜MTP基因在不同組織及處理下的表達(dá)模式進(jìn)行了初步分析。由圖5可知，CsMTPs在不同組織和處理下均表達(dá)，但各基因的表達(dá)水平差別較大。其中CsMTP11、CsMTP3、CsMTP7在不同組織和處理下均表現(xiàn)較高的表達(dá)水平；CsMTP8、CsMTP9、CsMTP12、CsMTP4、CsMTP6、CsMTP5的表達(dá)水平普遍偏低，沒有組織或者處理特異性響應(yīng)的現(xiàn)象。

A. 保守基序分析；B. 基因結(jié)構(gòu)分析；Motif. 基序；CDS. 蛋白質(zhì)編碼區(qū)；UTR. 非編碼區(qū)；Intron. 內(nèi)含子圖2 CsMTP基因家族的保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析A. Motif analysis；B. Gene structure analysis; CDS. Sequence coding for amino acids in protein; UTR. Untranslated regionFig.2 Gene structure and motif analysis of CsMTP gene family

橙色框為Mn-CDF含有的保守序列DxxxD；黃色框為Zn-CDF含有保守序列HxxxD (x為任意氨基酸)；標(biāo)尺代表氨基酸殘基數(shù)目圖3 黃瓜MTP蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Orang boxes represent for conserved sequence DxxxD belongs to Mn-CDF; Yellow boxes represent for conserved sequence DxxxD belongs to Zn-CDF; The rule represents the amino acid residuesFig.3 Conserved protein domain analysis of Cucumis sativus MTP

2.6 黃瓜MTP對重金屬脅迫的響應(yīng)特征分析

為了深入了解CsMTP基因在重金屬脅迫下的響應(yīng)特征，我們借助實時熒光定量PCR分析了黃瓜根系和葉片在不同重金屬離子(包括Zn、Cd、Mn、Cu、Fe和Mo)脅迫下的表達(dá)變化。由圖6可知，黃瓜MTP基因家族在不同重金屬處理下的不同組織表達(dá)水平存在一定差異。每種重金屬離子至少可以誘導(dǎo)一個或幾個CsMTP基因的差異表達(dá)。根系中，Zn脅迫處理顯著提高了CsMTP3的表達(dá)水平，而CsMTP4、CsMTP5、CsMTP7、CsMTP8、CsMTP11的表達(dá)水平則顯著降低。Cd脅迫處理后，除了CsMTP3和CsMTP9的表達(dá)水平顯著升高外，其他CsMTP基因的表達(dá)水平均顯著降低。

Chr 1～7代表1～7號染色體圖4 黃瓜CsMTP基因的染色體分布Chr1-7 represent the chromosome 1 to 7Fig.4 Chromosomal distribution of CsMTP genes

圖中Vlas Mock、PI88_Mock、SSL508-28分別代表不同的黃瓜品種圖5 黃瓜MTP基因表達(dá)水平熱圖Vlas Mock, PI88_Mock and SSL508-28 represent for different cucumber cultivars; The changes of color indicates different levels of log2-transformed gene expression levelFig.5 Expression pattern profiling of cucumber MTP genes

Mn脅迫處理下，除了CsMTP5和CsMTP6之外，其他基因的表達(dá)水平均顯著上調(diào)(CsMTP4和CsMTP9)或者下調(diào)表達(dá)。Cu脅迫顯著誘導(dǎo)了根系中CsMTP3、CsMTP4、CsMTP6、CsMTP9、CsMTP11的表達(dá)，抑制了CsMTP8和CsMTP11的表達(dá)。Fe處理下，CsMTP4的表達(dá)水平基本沒有變化，其他基因的表達(dá)水平均顯著上調(diào)(CsMTP9)或者下調(diào)。Mo處理下，大部分基因的表達(dá)水平顯著降低，而CsMTP4和CsMTP9的表達(dá)水平則顯著升高。

葉片中，除了CsMTP11的表達(dá)水平顯著提高之外，Zn脅迫處理顯著降低了所有CsMTP基因的表達(dá)水平。Cd處理顯著提高了CsMTP9的表達(dá)水平，顯著降低了除CsMTP4和CsMTP7之外的大部分基因的表達(dá)水平。Mn處理下，CsMTP3、CsMTP5、CsMTP8、CsMTP12的表達(dá)水平顯著降低，而CsMTP7、CsMTP9和CsMTP11的表達(dá)水平則顯著升高。Cu脅迫處理后，CsMTP7和CsMTP11的表達(dá)水平有所升高，其他基因的表達(dá)水平均顯著降低。Fe處理顯著提高了CsMTP6和CsMTP11的表達(dá)。Mo處理下，CsMTP4、CsMTP7和CsMTP9的表達(dá)水平基本沒有變化，其他基因的表達(dá)水平均顯著降低(圖6)。

*和**分別表示處理與對照在根和葉中的顯著差異(n = 3，P < 0.05)圖6 重金屬脅迫下黃瓜MTP基因在根系和葉片中的表達(dá)水平* and ** indicate significant differences between the treatment and the control in root and leaf, respectively (n = 3, P < 0.05)Fig.6 Expression level of cucumber MTP gene in roots and leaves under heavy metal stress

3 討 論

土壤中高濃度的重金屬影響植物正常生長發(fā)育，甚至導(dǎo)致植株死亡。金屬耐受蛋白(MTP)在重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用。目前，水稻[27]、擬南芥[28]、黃瓜[29]、山茶[30]、遏藍(lán)菜[31]和芥菜[32]等植物中金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能已有所研究。但很多物種中MTP基因家族成員組成以及其重金屬響應(yīng)機(jī)制尚不清楚。本研究共鑒定到10個黃瓜CsMTP基因家族成員，分別命名為CsMTP3至CsMTP12。前人研究表明，MTPs通常包含6個跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD)，以及C端陽離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及N端信號肽序列[10]。黃瓜CsMTP蛋白除了CsMTP7(4個)和CsMTP12(11個)之外均含有6個TMDs。類似的，在小麥中MTP蛋白具有4～14個TMD?？招纳徸硬葜写蟛糠諱TP蛋白具有2～6個TMD，ApMTP12-1含有14個TMDs[33]。本研究中，黃瓜CsMTP蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)目差異較大，長度為313～876個氨基酸不等(表2)。類似結(jié)果在其他物種中也有報道，例如擬南芥MTP的氨基酸數(shù)目為398個(AtMTP1)[34]至789個(AtMTP12)[15]。這些結(jié)果暗示這些CsMTP基因可能具有功能上的多樣性。

目前已發(fā)現(xiàn)的CDF蛋白大部分定位于細(xì)胞膜上，但也有些存在液泡膜、高爾基體膜等細(xì)胞器膜上[25]。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，黃瓜Zn-CDFs和Zn/Fe-CDF亞家族中的所有成員均定位于液泡膜上。兩個Mn-CDF成員CsMTP8和MTP9被預(yù)測定位于細(xì)胞膜或液泡上。類似的，12個甜橙CitMTP中，分別有5個和4個CitMTP被預(yù)測定位在液泡膜和細(xì)胞膜上[11]。這些結(jié)果暗示不同的CDF蛋白可能在不同的細(xì)胞器中發(fā)揮其功能。但是CsMTP基因的亞細(xì)胞定位情況仍需通過實驗進(jìn)行驗證，以便更好地解釋其在重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的功能。外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)多樣性通常能夠在基因家族進(jìn)化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并可以為系統(tǒng)發(fā)育分類提供依據(jù)[35]。甜橙、水稻、擬南芥和黃瓜MTP基因中包含的內(nèi)含子數(shù)量在1～13之間。且黃瓜CsMTP不同亞家族內(nèi)含子-外顯子數(shù)目差異較大，Zn-CDF亞家族成員除了內(nèi)含子數(shù)目普遍較少，而Zn/Fe-CDF亞家族成員所含內(nèi)含子數(shù)目最多。但是外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)在CsMTP的功能和進(jìn)化過程中所發(fā)揮的作用還需要進(jìn)一步的分析和驗證。

同擬南芥同源關(guān)系分析結(jié)果顯示，黃瓜中大多數(shù)MTP基因存在AtMTP的同源基因。但是本研究在黃瓜中未鑒定到擬南芥同源基因MTP1、MTP2和MTP10(圖1)。此外，AtMTP2和AtMTP10的同源基因在玉米和水稻中也沒有鑒定到，這可能是由于黃瓜、玉米和水稻中這些基因在進(jìn)化過程中丟失，或者是擬南芥通過近期獨(dú)立的進(jìn)化事件而產(chǎn)生的新基因。此外，MTP8、6、7和9在單子葉植物玉米、小麥和雙子葉植物黃瓜和擬南芥中均被鑒定到，表明這些基因進(jìn)化上具有一定的保守性。擬南芥中，AtMTP8是定位于液泡膜生的Mn轉(zhuǎn)運(yùn)體，參與調(diào)控缺鐵脅迫，以及種子中Mn和Fe的分布[36]。黃瓜中，定位于液泡膜的CsMTP8在黃瓜根系中特異性表達(dá)，并且表達(dá)水平可以被高錳或者缺錳脅迫誘導(dǎo)[37]。OsMTP8在水稻莖中表達(dá)豐度最高，其主要功能是將多余的Mn2+轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中，降低水稻地上部的Mn毒害[38]。Zhang等[13]克隆到一個膜定位的Mn轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CsMTP8.2，且擬南芥中的異源表達(dá)結(jié)果表明該基因可將多余的Mn2+轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外。這些結(jié)果可為其他物種中MTP8的功能研究提供一定的參考。

為了解CsMTPs基因的表達(dá)水平，借助已經(jīng)發(fā)表的RNA-seq數(shù)據(jù)，對黃瓜MTP基因表達(dá)水平和表達(dá)模式進(jìn)行了初步分析，結(jié)果表明CsMTPs在不同組織和處理下均有表達(dá)，但不同CsMTP基因表達(dá)水平差別較大。其中CsMTP11、CsMTP3、CsMTP7的表達(dá)水平在不同組織和處理下普遍較高(圖5)。為進(jìn)一步揭示黃瓜CsMTPs基因?qū)χ亟饘倜{迫的響應(yīng)，本研究對黃瓜進(jìn)行了包括Zn、Cd、Mn、Cu、Fe和Mo在內(nèi)的5種金屬處理，并借助qRT-PCR對根系和葉片中9個CsMTPs的表達(dá)水平進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，CsMTPs的表達(dá)水平可被不同金屬誘導(dǎo)，即使有些金屬不是MTP家族潛在的重金屬底物。例如Cu可以誘導(dǎo)CsMTP4、CsMTP5、CsMTP6、CsMTP8、CsMTP9、CsMTP11和CsMTP12在根系和葉片中的差異表達(dá)。此外，CsMTP基因也可能不受其潛在的轉(zhuǎn)運(yùn)底物的誘導(dǎo)，例如Zn-ZDF亞家族的CsMTP6、CsMTP9和CsMTP12，在黃瓜葉片中均未受到Zn離子處理的顯著誘導(dǎo)。類似的結(jié)果在楊樹[13]和甜橙[11]中也有報道。這一結(jié)果可能與重金屬濃度以及處理時間有關(guān)，后續(xù)實驗應(yīng)該設(shè)置更多重金屬濃度梯度以及取樣時間點(diǎn)，以便于更好地揭示CsMTP基因?qū)Σ煌饘匐x子的響應(yīng)模式。

研究黃瓜CsMTP基因家族成員對不同重金屬處理的響應(yīng)情況可為其進(jìn)一步的功能研究奠定基礎(chǔ)。在擬南芥、水稻和黃瓜中，AtMTP1[34]、AtMTP3[28]以及CsMTP4[29]蛋白被證實不僅可以轉(zhuǎn)運(yùn)Zn離子，還能夠?qū)d離子(OsMTP1[39]、CsMTP1[29]和CsMTP4[29])、Co離子(OsMTP1[40]、HvMTP1[41]和AtMTP3[28])或Fe離子(OsMTP1[40])轉(zhuǎn)運(yùn)到植物細(xì)胞的液泡中。本研究中CsMTP3和CsMTP4的表達(dá)也受到Zn、Cd和Fe處理的誘導(dǎo)。擬南芥中，MTP5與MTP12可形成蛋白復(fù)合體，將Zn2+轉(zhuǎn)運(yùn)到擬南芥的高爾基體中[15]。本研究中，黃瓜根系MTP5與MTP12的表達(dá)水平在Zn2+處理后均顯著下調(diào)，表明其表達(dá)受到Zn2+的誘導(dǎo)，但是其在黃瓜中的具體作用機(jī)制尚不清楚。擬南芥MTP8蛋白與Mn2+的穩(wěn)態(tài)維持密切相關(guān)[16]，Mn2+處理后，黃瓜葉片MTP8的表達(dá)水平顯著下調(diào)。MTP9定位于質(zhì)膜上，參與黃瓜根系細(xì)胞Mn2+和Cd2+的外排[17]，類似的，本研究中，黃瓜根系CsMTP9的表達(dá)水平受到Mn2+和Cd2+處理的誘導(dǎo)，其表達(dá)水平在Mn2+和Cd2+處理后顯著上調(diào)。在擬南芥和水稻中，MTP11轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可增強(qiáng)植物對Mn2+的耐受性[18]。Mn2+處理后，CsMTP11的表達(dá)水平在葉片和根系中分別顯著上調(diào)和下調(diào)表達(dá)。這些結(jié)果表明，不同物種MTP基因的表達(dá)模式和功能存在一定的差異，且MTP基因?qū)χ亟饘偬幚淼捻憫?yīng)可能受到金屬處理濃度和處理時期的影響。另外，也有研究顯示，重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)也受到翻譯水平的影響，包括MTP蛋白含量、定位等。由此可見，植物MTP對金屬脅迫的響應(yīng)十分復(fù)雜，受到轉(zhuǎn)錄和翻譯等多個水平的影響。鑒于葫蘆科物種的重要性，后續(xù)亟需對葫蘆科物種MTP進(jìn)行更加深入的研究。