周芳

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)管理部，遼寧 沈陽(yáng) 110032)

糖尿病腎病是糖尿病的重要并發(fā)癥之一，其病理特征主要為腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化等，腎纖維化是指腎內(nèi)細(xì)胞纖維化、硬化，進(jìn)而造成腎實(shí)質(zhì)硬化，形成瘢痕的過(guò)程[1]。目前臨床上僅以控制血糖、血壓，應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等來(lái)減緩糖尿病腎病的發(fā)展，尚無(wú)明確、有效的治療腎纖維化的藥物或手段，因此，尋找有效的治療腎纖維化的方法非常重要。吡非尼酮是一種細(xì)胞因子抑制劑，具有防止瘢痕形成的作用，其常用于治療神經(jīng)纖維瘤、子宮平滑肌瘤等疾病，且療效顯著[2]。但關(guān)于吡非尼酮應(yīng)用于糖尿病腎病的研究尚少。本實(shí)驗(yàn)旨在探討吡非尼酮對(duì)糖尿病腎病小鼠腎纖維化的改善作用及相關(guān)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)，ICR雄性小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量20～22 g，購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(浙)2019-0001。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品試劑及儀器 吡非尼酮膠囊(北京康蒂尼藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20133376，規(guī)格：100 mg)；1%羧甲基纖維素鈉溶液(美國(guó)Sigma公司)；鏈尿佐菌素(美國(guó)Sigma公司)；尿蛋白定量測(cè)試盒(上海雅吉生物科技有限公司)；Masson染色液(武漢博士德生物工程有限公司)；小鼠抗大鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)單克隆抗體、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)抗體(英國(guó)Abcam公司)，Ⅰ型膠原(Col Ⅰ)抗體(美國(guó)Gene Tex公司)等。Couvter型高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；HM525冷凍切片機(jī)(德國(guó)MICROM公司)；STM6-LM型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；BDNM-9602G自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司)等。

1.3方法 將30只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組，各10只。三組均正常進(jìn)食、進(jìn)水。模型組與實(shí)驗(yàn)組小鼠給予鏈尿佐菌素腹腔注射，以80 mg/kg一次性干預(yù)，建立糖尿病腎病模型。造模成功后，將250 mg吡非尼酮溶于1%羧甲基纖維素鈉溶液，給予實(shí)驗(yàn)組小鼠灌胃，1次/d；正常組與模型組小鼠給予1%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃給藥，1次/d；均連續(xù)灌胃7 d。

1.4觀察指標(biāo) 比較三組小鼠腎功能水平，分別收集三組小鼠處死前24 h尿液，使用尿蛋白定量測(cè)試盒檢測(cè)所有小鼠24 h尿蛋白含量；分別采集三組小鼠眼球血100 μL，3 000 r/min離心10 min，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)小鼠血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)水平。比較三組小鼠腎組織Masson染色情況，采血后，頸椎脫臼法處死小鼠，解剖收集腎組織，取腎組織于10%中性甲醛固定，依次經(jīng)脫水、包埋、脫蠟等制備病理切片，切成2 μm切片，行常規(guī)Masson染色，透明、封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠腎組織病理學(xué)變化。比較三組小鼠腎組織TGF-β、α-SMA、Col Ⅰ蛋白相對(duì)表達(dá)水平，取液氮中保存的腎組織，提取總蛋白并測(cè)定蛋白濃度，以50 μg蛋白/泳道上樣，經(jīng)常規(guī)電泳并電轉(zhuǎn)，以5%牛血清白蛋白進(jìn)行封閉2 h，一抗(1：500)4℃孵育過(guò)夜，二抗(1：5 000)37℃孵育1 h，顯色。采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件測(cè)量各蛋白條帶光密度(A)值，目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平為該蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH的比值。

2 結(jié) 果

2.1腎功能水平 與對(duì)照組比，模型組小鼠24 h尿蛋白含量、BUN、SCr水平均升高，且實(shí)驗(yàn)組顯著低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 三組小鼠腎功能水平比較

2.2腎臟組織Masson染色情況 對(duì)照組小鼠腎小管間質(zhì)無(wú)明顯纖維化，未見(jiàn)增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等；模型組小鼠腎小管間質(zhì)有明顯增生、纖維化，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等；實(shí)驗(yàn)組小鼠腎小管間質(zhì)有輕微纖維化，且僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等。見(jiàn)圖1。

注：A.對(duì)照組；B.模型組；C.實(shí)驗(yàn)組。圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織Masson染色(×100)

2.3TGF-β、α-SMA、Col Ⅰ蛋白相對(duì)表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，模型組小鼠腎組織TGF-β、α-SMA、Col Ⅰ蛋白相對(duì)表達(dá)水平均升高，且實(shí)驗(yàn)組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

注：A.對(duì)照組；B.模型組；C.實(shí)驗(yàn)組。圖2 蛋白免疫印跡法檢測(cè)小鼠腎組織α-SMA、TGF-β、Col Ⅰ蛋白表達(dá)

3 討 論

鏈尿佐菌素是一種氨基葡萄糖—亞硝基脲，其屬于廣譜抗菌素的一種，具有良好的抗腫瘤及抗菌的作用[3]，但其可通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，對(duì)β細(xì)胞的毒性進(jìn)行誘導(dǎo)釋放，且對(duì)陽(yáng)性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞具有毒性作用，進(jìn)而升高機(jī)體血糖水平，且可對(duì)腎臟造成損傷[4]。本實(shí)驗(yàn)以鏈尿佐菌素對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃干預(yù)，成功建立糖尿病腎病小鼠模型[5]。

腎纖維化的病理特征為纖維結(jié)締組織增生、腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少、細(xì)胞外基質(zhì)沉積等，若未采取及時(shí)有效的治療，其可進(jìn)一步發(fā)展為腎衰竭，進(jìn)而對(duì)患者的生命健康造成嚴(yán)重影響[6-7]。激素類(lèi)藥物是目前臨床治療機(jī)體器官纖維化常用方法，但長(zhǎng)期使用激素治療可出現(xiàn)庫(kù)欣綜合征、水腫、低血鉀等不良反應(yīng)，影響其療效[8]。吡非尼酮是一種吡啶酮類(lèi)化合物，具有廣譜的抗纖維化作用，對(duì)上皮—間質(zhì)的轉(zhuǎn)化具有誘導(dǎo)作用，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化，且對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)沉積起促進(jìn)作用，且可誘導(dǎo)其他纖維化因子表達(dá)[9]。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠24 h尿蛋白含量、BUN、SCr水平均低于模型組，且實(shí)驗(yàn)組小鼠腎小管間質(zhì)纖維化及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度均優(yōu)于對(duì)照組，提示吡非尼酮可改善糖尿病腎病小鼠的腎功能，并可改善腎纖維化，與權(quán)曉娟等[10]研究結(jié)果基本相符。TGF-β是一種中樞因子，具有放大炎癥的作用，且其水平升高可刺激成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育，進(jìn)而促進(jìn)腎纖維化的發(fā)展；α-SMA可反映腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，其表達(dá)水平與腎纖維化程度密切相關(guān)；Col Ⅰ在機(jī)體受到高糖刺激后，由腎小球系膜細(xì)胞大量釋放，其表達(dá)可直接反映腎纖維化的程度[11]。吡非尼酮可清除活性氧，減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成，進(jìn)而減輕腎損傷，控制腎纖維化進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠腎組織TGF-β、α-SMA、Col Ⅰ蛋白相對(duì)表達(dá)水平相較于模型組均降低，提示吡非尼酮可減少糖尿病腎病小鼠腎組織TGF-β、α-SMA、Col Ⅰ蛋白表達(dá)水平，從而控制腎纖維化的發(fā)展進(jìn)程，與徐建華等[12]研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，吡非尼酮可改善糖尿病腎病小鼠腎功能及腎纖維化，同時(shí)減少小鼠腎組織TGF-β、α-SMA、Col Ⅰ蛋白表達(dá)水平，從而控制腎纖維化的發(fā)展進(jìn)程，可為臨床治療糖尿病腎病提供新的思路，但本實(shí)驗(yàn)樣本量較少，值得大樣本量進(jìn)一步研究。