張睿 張郭亮 王飛娟

(銅川市人民醫(yī)院，陜西 銅川 727000)

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對患者健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，預(yù)后極差，其中晚期非小細(xì)胞肺癌占所有肺癌的80%[1]。有研究[2]表明，從分子水平研究，非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生機(jī)制與其驅(qū)動基因突變相關(guān)。原癌基因1蛋白酪氨酸激酶ROS(ROS1)是一個(gè)單體型受體酪氨酸激酶，可融合形成非小細(xì)胞肺癌的致癌性驅(qū)動基因。針對ROS1融合基因陽性的靶向藥物(ALK抑制劑)，如克唑替尼在改善患者生存質(zhì)量，延長生命周期方面有良好療效，但最終所有患者都會出現(xiàn)耐藥[3]。因此探討ALK抑制劑發(fā)生耐藥的機(jī)制，是指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌進(jìn)一步治療的關(guān)鍵。本文分析14例ALK抑制劑治療后繼發(fā)耐藥的非小細(xì)胞肺癌重癥呼吸衰竭患者的基因情況，探討其與耐藥機(jī)制的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年1月至2018年10月我院腫瘤科收治的接受克唑替尼治療后出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥的非小細(xì)胞肺癌重癥呼吸衰竭患者14例。其中男4例，女10例；平均(65±8.7)歲；吸煙4例，不吸煙10例；TNM分期：Ⅰ～Ⅲa期1例，Ⅲb～Ⅳ期13例；病理分型：腺癌12例，非腺癌2例；EGFR基因狀態(tài)：野生型13例，未知型1例；送檢樣本類型：穿刺組織切片4例，外周血7例，胸水3例。納入及排除標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)臨床病理確診為非小細(xì)胞肺癌，且年齡≥18歲；經(jīng)RT-PCR、NGS或 FISH技術(shù)檢測提示ROS1基因陽性；均接受克唑替尼口服治療，且治療時(shí)間超過4周；出現(xiàn)疾病進(jìn)展，即出現(xiàn)新病灶或基線病灶徑總和增加20%左右[4]；神志清楚，無言語功能及認(rèn)知功能障礙；無系統(tǒng)性免疫性疾病、嚴(yán)重感染或其他潛在嚴(yán)重性疾?。慌R床資料完整，無失訪情況；患者及其監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書，同意參加本次研究。

1.2方法 所有送檢樣本均采用NGS技術(shù)進(jìn)行檢測。血漿樣本檢測：抽取患者10 mL外周血置于EDTAD抗凝管中，輕柔顛倒6～8次充分混勻，在4～6 h內(nèi)于4℃下對樣本進(jìn)行離心，1 600 g 10 min；將離心后的上清血漿分別置于1.5 mL或2 mL離心管中，離心1 600 g 10 min，去除殘余細(xì)胞，將離心完的上清血漿置于新的1.5 mL或2 mL離心管中，將其與剩余血細(xì)胞同置于-80℃冰箱冷凍保存；按照Qiagen提取試劑說明書對分離血漿(2～3 mL)進(jìn)行血漿ctDNA提??；依據(jù)QIAamp DNA Blood Mini Kit提取試劑說明書對血細(xì)胞樣本進(jìn)行基因組DNA提取，并采用Qubit對其進(jìn)行定量處理。胸水樣本檢測：將提取到的胸水樣本10～15 mL保存于2管10 mL無菌管中，并將其置于-20℃或-80℃冰箱中冷凍保存；按照QIAamp DNA Blood Mini Kit提取試劑說明書對胸水樣本進(jìn)行基因組DNA提取，并采用Qubit對進(jìn)行定量處理。測序方法：制備測序文庫，按照建庫試劑盒推薦步驟建立行ctDNA和基因組DNA文庫；上機(jī)測序，按照操作說明書進(jìn)行上機(jī)測序；分析測序數(shù)據(jù)的生物信息，使用比對軟件BWA對測序序列進(jìn)行比對，MuTect進(jìn)行SNP變異分析，GATK進(jìn)行InDel變異分析，contra.py進(jìn)行拷貝數(shù)變異分析。

1.3觀察指標(biāo) 基因改變情況(基因數(shù)目、類型、改變位點(diǎn))；有效性指標(biāo)(血?dú)庵笜?biāo)、呼吸頻率、心率)；安全性指標(biāo)(住院時(shí)間、并發(fā)癥)。

2 結(jié) 果

2.1腦轉(zhuǎn)移情況 8例患者以腦轉(zhuǎn)移為主要進(jìn)展部位，約占57.1%，6例腦轉(zhuǎn)移患者在出現(xiàn)腦部病灶進(jìn)展時(shí)肺部情況穩(wěn)定且有所改善，約占75.0%，且6例患者仍存活，占75%。

2.2基因改變情況 3例患者出現(xiàn)1個(gè)基因改變，4例患者出現(xiàn)2個(gè)基因改變，2例患者出現(xiàn)3個(gè)基因改變，2例患者4個(gè)基因改變，1例患者出現(xiàn)5個(gè)基因改變，2例患者出現(xiàn)6個(gè)基因改變，共出現(xiàn)剪切位點(diǎn)(2%)，讀框內(nèi)插入缺失(3%)，基因多樣性改變(3%)，基因截?cái)喔淖?3%)，移碼突變改變(5%)，基因拷貝數(shù)變改變異占(6%)，基因融合改變(25%)，錯(cuò)義突變改變(53%)，8類基因突變類型見圖3。

圖1 基因改變類型

2.3ROS1獲得性突變陽性及突變陰性的基因改變情況 14例耐藥的非小細(xì)胞肺癌患者共發(fā)現(xiàn)51個(gè)基因改變，平均每個(gè)患者約出現(xiàn)3.6個(gè)基因改變。其中13例患者出現(xiàn)ROS1基因融合改變，約占比92.9%；2例患者出現(xiàn)CDKN2A基因突變，約占14.3%；4例患者出現(xiàn)G2032R點(diǎn)基因突變，約占28.6%；2例患者出現(xiàn)TP53點(diǎn)突變，約占14.3%，均存在于獲得性ROS1基因突變陽性患者中；3例患者出現(xiàn)TP53點(diǎn)突變，約占21.4%，均存在于獲得性ROS1基因突變陰性患者中，還在此類患者中發(fā)現(xiàn)TERT、NEF2L2、PTPRD、OR5L2等罕見基因及K-RAS、EGFR、KIT、BRAF、PIK3CA等常見基因突變。

3 討 論

手術(shù)治療、化療及放療在改善晚期非小細(xì)胞肺癌的生存率方面無顯著作用，且存在較多嚴(yán)重并發(fā)癥[5]。因此應(yīng)用新型的高效的抗癌藥物則尤為重要。

近年來，多種病理類型的肺癌中都可見到驅(qū)動基因的改變，但兩種以上驅(qū)動基因突變在同種類型的肺癌中少見[6]。針對基因突變的靶向藥物治療具有療效好，生存率明顯提高，預(yù)后改善及并發(fā)癥少的優(yōu)點(diǎn)，但存在耐藥率極高的局限性[7]。EGFR是肺癌中最常見的致癌驅(qū)動基因，而ALK是一種跨膜受體酪氨酸激酶，可激活多個(gè)細(xì)胞通路，是非小細(xì)胞肺癌的新型致癌驅(qū)動基因，是目前臨床常見的治療靶點(diǎn)[8]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)的ROS1融合基因?qū)儆谝葝u素受體家族，也被證實(shí)為新的肺癌治療靶點(diǎn)，在0.9%～2.0%的非小細(xì)胞肺癌患者中可檢測該基因[9]，其基因陽性患者多為年齡偏小，但其與EGFR及ALK融合基因等突變并不能共存于肺癌患者體內(nèi)，在EFGR和ALK融合基因陰性的非小細(xì)胞肺癌患者中ROS1基因的檢測率明顯提高[10]。

本文研究采用NGS檢測技術(shù)對患者的血液樣本、胸水樣本及組織切片樣本進(jìn)行檢測，具有高度敏感性和特異性。綜上所述，筆者認(rèn)為，ROS1融合基因陽性的非小細(xì)胞肺癌重癥呼吸衰竭患者耐藥發(fā)生機(jī)制相對復(fù)雜，可能與多種基因突變相關(guān)，可以采用NGS檢測技術(shù)測定耐藥基因，以指導(dǎo)臨床用藥，但由于本文樣本量較少，且采用的血液樣本是否只代表影響疾病進(jìn)展的最主要DNA基因突變?nèi)源嬉?，需要進(jìn)一步深入研究。