肖蕾 伍善東 劉東華

(湖南省微生物研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410009)

引言

植物內(nèi)生菌是指能夠定殖在植物組織內(nèi)部，對(duì)宿主植物不造成任何感染或負(fù)面影響的一類微生物。實(shí)驗(yàn)室在對(duì)從油菜植株中分離得到的內(nèi)生菌進(jìn)行功能篩選時(shí)，發(fā)現(xiàn)1株具備多種生物功能的優(yōu)秀內(nèi)生菌株4-3。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

油菜內(nèi)生菌：從健壯油菜根、莖的韌皮部分離得到；核盤菌ACCC37701(源自油菜)引自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 PDA加富培養(yǎng)基

20%土豆(煮汁)，2.0%葡萄糖，0.2%酵母膏，0.05%硫酸鎂，0.1%磷酸二氫鉀，1.8%瓊脂，1.0mg V-B1，pH自然，27℃培養(yǎng)。

1.2.2 基本發(fā)酵培養(yǎng)基

1%玉米淀粉，2%葡萄糖，1%豆餅粉，0.1%硫酸鎂，0.2%磷酸二氫鉀，0.4%酵母膏，1.0mg V-B1，pH自然。裝量100mL/500mL三角瓶。

1.2.3 PKO培養(yǎng)基

Ca3(PO4)25.0g，蔗糖10g，(NH4)SO40.5g，NaCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.1g，KCl 0.2g，酵母粉0.5g，1% MnSO43mL，1% FeSO4·7H2O 3mL，pH 7.0±0.2，蒸餾水1000mL。

1.2.4 蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基

葡萄糖10.0g，(NH4)SO40.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，F(xiàn)eSO40.03g，MnSO40.03g，Lecithin 0.3g，CaCO35.0g，酵母粉0.4g，pH 7.0±0.2，蒸餾水1000mL。

1.2.5 解鉀培養(yǎng)基

蔗糖1.5g，MgSO4·7H2O 0.02g，CaSO4·7H2O 0.01g，NaCl 0.02g，鉀長(zhǎng)石粉0.5g，pH7.0～7.5，去離子水1000mL。

鉀長(zhǎng)石粉處理方法：將鉀長(zhǎng)石粉加入10%的HCl浸泡8～10h(期間每隔1～2h充分?jǐn)嚢?次)，浸泡過(guò)夜。棄去上清液后用去離子水浸洗，充分?jǐn)嚢?，靜止后棄上清液，再加入去離子水浸洗；如此重復(fù)多次，直至pH值檢測(cè)無(wú)變化為止。將處理好的鉀長(zhǎng)石粉烘干后碾磨，過(guò)100目篩后裝入瓶中備用。

1.3 油菜內(nèi)生菌的分離方法

取油菜植株→沖洗→削取健壯白皙的根須及韌皮部→完全洗凈后用濾紙吸干水分→75%乙醇浸泡12min→無(wú)菌水浸洗6次→0.2%HgCl2浸泡18min→無(wú)菌水浸洗9次(最后1次浸洗液留作對(duì)照)→將樣品放入滅菌碾砵中→加無(wú)菌水4.5mL→碾磨成漿→去木質(zhì)粗纖維→加無(wú)菌水4.5mL、繼續(xù)碾磨成漿(20～30min)→吸取漿液0.5mL于裝有4.5mL的無(wú)菌水試管中做系列稀釋至5階→倒序吸取0.5mL稀釋液及對(duì)照浸洗液于倒好培養(yǎng)基的平皿中(平行3皿)→涂布均勻→于28℃恒溫、正置培養(yǎng)(第2天倒置)3～5d→挑取不同形態(tài)的單個(gè)內(nèi)生菌落。

挑取內(nèi)生菌時(shí)應(yīng)注意觀察，選取不同菌落形態(tài)的菌株并根據(jù)對(duì)照平皿有無(wú)菌落生長(zhǎng)決定是否挑取菌株。對(duì)照平皿一般無(wú)菌落生長(zhǎng)，如有菌落出現(xiàn)則應(yīng)視為污染菌或外生菌落，此時(shí)選取菌株應(yīng)慎挑或不挑。

1.4 拮抗核盤病菌內(nèi)生菌株的選擇

1.4.1 對(duì)峙法初選拮抗菌株

將核盤菌ACCC37701斜面菌種用接種鉤挑取少量菌絲點(diǎn)接種于倒好PDA加富瓊脂培養(yǎng)基的直徑為9cm的平皿中心。23℃恒溫培養(yǎng)2d，待核盤菌絲萌發(fā)生長(zhǎng)至直徑為2cm大小菌落時(shí)；將所有第1批內(nèi)生菌29株用接種環(huán)涂抹在周邊的6個(gè)位點(diǎn)上，每個(gè)位點(diǎn)呈正六面體，間距為3cm，平行3皿。25℃恒溫培養(yǎng)3d。挑選出7株內(nèi)生菌對(duì)核盤菌ACCC37701具明顯拮抗作用。

1.4.2 牛津杯法復(fù)篩拮抗菌株

挑取核盤菌絲ACCC37701斜面(帶瓊脂塊)于倒好PDA加富瓊脂培養(yǎng)基的直徑為12cm的生化平皿中心。23℃恒溫培養(yǎng)3d，待核盤菌絲萌發(fā)生長(zhǎng)至直徑為2～3cm(約銅錢大小)菌落時(shí)；將牛津杯3枚呈品字型放在核盤菌絲生長(zhǎng)圈外(牛津杯外徑5.0mm)。將在28℃、180r·min-1恒溫培養(yǎng)了5d的初篩菌株菌液加注到牛津杯中，置無(wú)鼓風(fēng)水隔式恒溫箱中23℃恒溫培養(yǎng)3d。觀察到抑菌透明圈,并用游標(biāo)卡尺測(cè)量記錄抑菌透明圈直徑。

1.5 內(nèi)生菌株降解不溶性磷的生物功能選擇、鑒定

1.5.1 降解無(wú)機(jī)磷內(nèi)生菌株的選擇

1.5.1.1 劃線法

將所有分離的內(nèi)生菌株用接種環(huán)在倒好PKO培養(yǎng)基的瓊脂平板上劃線，平行2皿。置無(wú)鼓風(fēng)水隔式恒溫箱中26℃恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)6d后檢查并記錄結(jié)果。

1.5.1.2 點(diǎn)種法

初篩：將在劃線培養(yǎng)中生長(zhǎng)良好的34個(gè)菌株(呈等邊三角形品字分布)點(diǎn)種在倒好PKO培養(yǎng)基的瓊脂平板上，平皿直徑為9cm，平行3皿。置無(wú)鼓風(fēng)水隔式恒溫箱中26℃恒溫培養(yǎng)。5d后每天檢查記錄結(jié)果直至第8天。

復(fù)篩：將篩選出的7個(gè)菌株(呈等邊三角形品字分布)點(diǎn)種在倒好PKO瓊脂培養(yǎng)基的直徑為12cm生化實(shí)驗(yàn)平皿上，平行3皿。置無(wú)鼓風(fēng)水隔式恒溫箱中26℃恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)8d后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄溶磷透明圈以及菌圈的大小，計(jì)算D/d比值。

1.5.2 降解有機(jī)磷內(nèi)生菌株的選擇

1.5.2.1 點(diǎn)種法初篩

將所有分離的內(nèi)生菌株用接種環(huán)在倒好蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基的瓊脂平板上點(diǎn)種，平皿直徑為9cm，平行3皿。置無(wú)鼓風(fēng)水隔式恒溫箱中26℃恒溫、倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)5d后，每天檢查結(jié)果并記錄直至第8天。

1.5.2.2 點(diǎn)種法復(fù)篩

將篩選出的6個(gè)菌株(呈等邊三角形品字分布)點(diǎn)種在倒好蒙金娜有機(jī)磷瓊脂培養(yǎng)基的直徑為12cm生化實(shí)驗(yàn)平皿上，平行3皿。置無(wú)鼓風(fēng)水隔式恒溫箱中26℃恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)9d后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄溶磷透明圈以及菌圈的大小，計(jì)算D/d比值。

1.6 降解不溶性鉀內(nèi)生菌株的選擇

1.6.1 點(diǎn)種法初篩

用接種環(huán)將所有分離的內(nèi)生菌株點(diǎn)種在倒好解鉀培養(yǎng)基的瓊脂平板上，呈等邊三角形分布，平皿直徑為9cm，平行3皿。置無(wú)鼓風(fēng)水隔式恒溫箱中28℃恒溫、倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)5d后，每天檢查并記錄結(jié)果直至第8天。

1.6.2 有效鉀的檢測(cè)

將篩選出的16株解鉀菌株接種于液體解鉀培養(yǎng)基中，以在液體培養(yǎng)基中不接入菌種的作為對(duì)照。500mL三角瓶裝量80mL，28℃，180r·min-1培養(yǎng)15d。將培養(yǎng)液經(jīng)過(guò)4000rpm離心處理15min取其上清液送至湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)化檢測(cè)中心采用火焰分光光度計(jì)檢測(cè)發(fā)酵上清液中速效鉀的含量，根據(jù)速效鉀的測(cè)定值≥4.0ug·mL-1，篩選出9株優(yōu)良的解鉀菌株按相同的培養(yǎng)條件和方法進(jìn)行復(fù)篩。

1.6.3 菌肥的小面積施用試驗(yàn)

1.6.3.1 播種

于2013年10月21日準(zhǔn)備好1m2土壤3塊，平整后，2塊地分別均勻鋪撒1#、2#菌肥2.5kg；對(duì)照地不施肥。撒播油菜籽“灃油958”；用耙齒稍稍耙動(dòng)，用噴壺灑水使土壤濕潤(rùn)。

1#菌肥為4-3；2#菌肥為4-3、18-2；配比為1∶1。

1.6.3.2 移栽

于2013年11月19日將3塊地上生長(zhǎng)的種苗分別帶土移栽到挖整好的試驗(yàn)地，盡量選取健壯、生長(zhǎng)一致的菜苗，澆定根水后任其生長(zhǎng)。3塊試驗(yàn)地面積均等，1#地9行67畦135單株；2#地9行65畦132單株；CK地9行70畦136單株。

1.6.3.3 中途施肥

分別于2013年12月24日和2014年1月23日普遍施肥。方法及用量：50g脲加5g硼酸以水完全溶解后加30L水用噴壺普遍均衡噴灑。

1.6.3.4 收割、純凈、烘干、稱重

于2014年5月19日將3組試驗(yàn)地油菜分別收割，先在3組地中分別隨機(jī)抽取10個(gè)單株樣本(測(cè)量株高、數(shù)分支、測(cè)單株產(chǎn)量)經(jīng)曬干，脫粒，純凈、烘干后稱重。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗內(nèi)生菌對(duì)核盤菌的抑菌效果

2.1.1 對(duì)峙法初選拮抗菌株的結(jié)果

挑選出7株內(nèi)生菌對(duì)核盤菌ACCC37701具有明顯拮抗作用。

2.1.2 牛津杯法復(fù)篩拮抗菌株的結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4-3菌號(hào)對(duì)核盤菌的抑菌能力最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)19.3mm。抑菌圈直徑大小依序?yàn)?-3>1-9>4-2>1-4>7-2>4-4>1-3；除1-3和4-4(放線菌)抑菌圈很小外，其余5株拮抗菌抑菌圈都很大，很明顯。經(jīng)穿刺法感染核盤菌試驗(yàn)證實(shí)，油菜定植拮抗菌后獲得對(duì)核盤菌的綜合抗感染率為98.5%，綜合抗致病率為100%，見(jiàn)表1。

表1 拮抗內(nèi)生菌對(duì)核盤菌的抑菌圈

2.2 降解無(wú)機(jī)磷內(nèi)生菌株復(fù)篩的結(jié)果

2.2.1 劃線法初篩降解無(wú)機(jī)磷內(nèi)生菌株結(jié)果

有34個(gè)菌株生長(zhǎng)良好，10個(gè)菌株不生長(zhǎng)，5個(gè)菌株生長(zhǎng)不好。

2.2.2 點(diǎn)種法初篩降解無(wú)機(jī)磷內(nèi)生菌株結(jié)果

挑選出具有明顯解磷透明圈，且透明圈帶寬在2mm以上的優(yōu)良菌株7株進(jìn)行復(fù)篩。

2.2.3 點(diǎn)種法復(fù)篩降解無(wú)機(jī)磷內(nèi)生菌株結(jié)果

按溶磷透明圈直徑與菌圈直徑大小的比值(D/d)排列順序?yàn)?8-2>11-1>4-3>8-2>1-3>6-1>1-9，實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)具體見(jiàn)表2。

表2 降解無(wú)機(jī)磷內(nèi)生菌株復(fù)篩結(jié)果

2.3 降解有機(jī)磷內(nèi)生菌株復(fù)篩的結(jié)果

2.3.1 點(diǎn)種法初篩降解有機(jī)磷內(nèi)生菌株結(jié)果

培養(yǎng)8d后，檢查到生長(zhǎng)良好且在菌苔周邊有明顯降解有機(jī)磷透明圈的菌株有9株。從中挑選解磷透明圈帶寬在2mm以上的菌株6株進(jìn)入復(fù)篩。

2.3.2 降解有機(jī)磷內(nèi)生菌株復(fù)篩結(jié)果

按溶磷透明圈直徑與菌圈直徑大小的比值(D/d)排列順序?yàn)?0-1>18-2>7-1>18-1>4-3>13-1，具體見(jiàn)表3。

表3 降解有機(jī)磷內(nèi)生菌株復(fù)篩結(jié)果

2.4 降解不溶性鉀內(nèi)生菌株的結(jié)果

2.4.1 點(diǎn)種法初篩降解不溶性鉀內(nèi)生菌株結(jié)果

菌落長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株30株；菌落長(zhǎng)勢(shì)不是很好的菌株9株；10株菌落不能生長(zhǎng)。從30株在解鉀培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的菌株中選擇具油滴狀、菌苔凸起、有粘狀膜、表面具光澤、菌體柔軟、長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)盛的解鉀菌株16株。按其菌落長(zhǎng)勢(shì)大小順序排列為3-1>17-1>16-2>19-4>1-3>12-2>19-6>15-3>4-2>1-4>4-3>7-2>1-9>2-2>7-1>13-1。

2.4.2 復(fù)篩檢測(cè)降解不溶性鉀內(nèi)生菌株有效鉀結(jié)果

以2次測(cè)定值平均值的大小順序排列為4-3>19-4>4-2>1-3>16-2>3-1>17-1>19-6>1-4，具體結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 發(fā)酵上清液中有效鉀含量

2.5 菌肥的小面積施用試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 抽樣結(jié)果

從抽取的10個(gè)樣品結(jié)果可以看出，1#菌肥的單株平均產(chǎn)量比對(duì)照高13.9%；2#菌肥的單株平均產(chǎn)量比對(duì)照高21.5%，具體見(jiàn)表5。

表5 各處理平均分枝數(shù)、平均株高、平均單株產(chǎn)量結(jié)果

2.5.2 完整試驗(yàn)結(jié)果

表6 各處理總產(chǎn)量

小面積試驗(yàn)結(jié)果表明，1#菌肥和2#菌肥均比對(duì)照增產(chǎn)明顯。4-3單獨(dú)使用的效果不如與18-2合用的效果好。

3 討論

從上述4項(xiàng)功能菌的排序中能夠看出，某些菌株號(hào)重復(fù)出現(xiàn)在序列中。在2項(xiàng)序列出現(xiàn)的菌株有1-9，拮抗核盤菌和降解無(wú)機(jī)磷；4-2，拮抗和解鉀；1-4，拮抗和解鉀；18-2，降解無(wú)機(jī)磷和降解有機(jī)磷。在3項(xiàng)序列出現(xiàn)的菌株有1株，為1-3，具拮抗、降解無(wú)機(jī)磷和解鉀，其在序列排序中比較靠后。只有4-3菌株在這4項(xiàng)功能菌的排序中均有出現(xiàn)，且3項(xiàng)靠前；拮抗和解鉀居首、解無(wú)機(jī)磷排第3，解有機(jī)磷排序稍靠后。4-3作為1株野生型的油菜內(nèi)生菌具備優(yōu)良的解磷、解鉀和拮抗核盤病菌的多項(xiàng)生物功能，無(wú)疑是很優(yōu)秀的菌株。