萬紅兵，李海鵬，雷元華，謝 鵬，張松山，豐永紅，劉 璇，王 歡，孫寶忠

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，畜產(chǎn)品質(zhì)量安全研究室，北京 100193）

牛肉具有多種烹調(diào)方式，其中煎制牛排深受肉食消費(fèi)者的青睞，并逐漸成為高檔餐飲產(chǎn)品的代表[1]。熟度是指食物烹煮到可吃的一種程度，是形成菜肴風(fēng)味的重要保障措施，同時(shí)也是影響消費(fèi)者滿意度和消費(fèi)黏性的重要指標(biāo)。烹飪界常用成熟度或成熟程度來表示菜肴的烹飪終點(diǎn)，與中式烹飪相比，西式烹飪對(duì)肉制品的成熟度，特別是對(duì)牛排的成熟度進(jìn)行了詳細(xì)的描述。為保證牛排特有的嫩度，根據(jù)熟制程度的不同，西餐通常將牛排分為一分熟、三分熟、五分熟、七分熟、全熟和過熟6 種成熟度，并對(duì)其終點(diǎn)溫度進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定，分別為52～55、55～60、60～65、65～69、70～80 ℃和大于90 ℃[2-3]。近年來，隨著我國肉牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和東西方飲食文化交流的日益深入，歐美國家所崇尚的三分熟、五分熟牛肉逐漸被我國消費(fèi)者接受，但目前我國居民對(duì)牛肉的烹調(diào)方式仍以燉煮為主[4-5]。

肌原纖維蛋白是肌肉中一類重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，主要由肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、肌動(dòng)球蛋白、原肌球蛋白、肌鈣蛋白等多種蛋白組成，約占肌肉蛋白質(zhì)總量的50%～55%[6]，除了參與肌肉收縮、影響肌肉嫩度外，其對(duì)肉品品質(zhì)和功能特性都有重要的影響。加熱是使生肉變熟的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是食品加工過程中的重要工藝。加熱過程是一個(gè)殺菌過程，不僅可以延長產(chǎn)品貨架期，同時(shí)還可賦予產(chǎn)品特有的色澤和風(fēng)味，決定產(chǎn)品質(zhì)地和出品率，而這些品質(zhì)的變化主要取決于肌原纖維蛋白的熱變化。近年來，國內(nèi)外對(duì)肌原纖維蛋白在加熱過程中的特性研究多集中在火腿腸、魚糜等肉糜類產(chǎn)品，而在烹飪熟度對(duì)牛肉制品及其肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的影響研究方面鮮有報(bào)道。本研究以牛背最長肌肌原纖維蛋白為研究對(duì)象，通過研究烹飪熟度對(duì)蛋白聚集特性、氧化程度及其分子結(jié)構(gòu)的影響，探究肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)在烹飪過程中的變化規(guī)律，以期為西餐牛排煎制的烹飪工藝優(yōu)化和品質(zhì)控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

挑選6 頭36 月齡相同方式飼養(yǎng)的本地黃牛，按照GB/T 19477—2018《畜禽屠宰操作規(guī)程 ?！愤M(jìn)行屠宰。宰后在0～4 ℃的冷庫中吊掛排酸48 h，然后取左半胴體背最長肌，剔除多余的脂肪和結(jié)締組織，而后切成100 g左右的肉塊，真空包裝后放入－28 ℃以下的冷庫中，使肉塊的中心溫度在48 h內(nèi)達(dá)到－18 ℃以下，最后冰運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，貯存于－18 ℃低溫冰箱中備用。肌原纖維蛋白提取前，肉樣在0～4 ℃下解凍12 h。

氯化鈉、氯化鉀、尿素、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、溴酚藍(lán)、乙酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether) tetraacetic acid，EGTA）、2,4-二硝基苯肼、三氯乙酸、甘氨酸、鹽酸胍、5,5’-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙烯酰胺、四甲基乙二胺、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺、β-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、考馬斯亮藍(lán)R-250 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TENSOR 27傅里葉變換紅外光譜儀 德國布魯克光譜儀器公司；Avanti J-26S XP高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司；UltraTurraxT25 BASIS高速勻漿機(jī) 德國IKA公司；HI99163酸度計(jì) 意大利Hanna儀器設(shè)備公司；SIM-F124制冰機(jī) 日本三洋公司；BS214D型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH-4型可調(diào)恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；DYCZ-24EN雙垂直電泳儀 北京六一生物科技有限公司；GS-900校準(zhǔn)型光密度儀 美國Bio-Rad公司；S3500激光粒度儀 美國麥奇克儀器有限公司；UV-6100型紫外-可見分光光度計(jì)上海元析儀器有限公司；F-2500熒光分光光度計(jì) 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 牛肉肌原纖維蛋白的提取與熱處理

肌原纖維蛋白提取參考Doerscher等[7]的方法并作適當(dāng)修改。取一定質(zhì)量的牛肉，剔除脂肪和結(jié)締組織，切碎，加入4 倍體積緩沖液（0.1 mol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EGTA、0.05 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0），勻漿60 s，用60 目濾布過濾，除去結(jié)締組織，2 000×g冷凍離心15 min，棄上清液，取沉淀重復(fù)上述步驟兩次，得到粗提的肌原纖維蛋白。然后取此沉淀加入4 倍體積的0.1 mol/L NaCl，勻漿30 s，2 000×g冷凍離心15 min，重復(fù)兩次，最后一次用4 層紗布過濾，收集濾液，用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0，2 000×g冷凍離心15 min，沉淀即為提純的肌原纖維蛋白。以上操作均在4 ℃下進(jìn)行。蛋白質(zhì)量濃度采用雙縮脲法進(jìn)行測(cè)定，提取的蛋白質(zhì)在4 ℃下保存，24 h內(nèi)用完。

用0.6 mol/L NaCl、0.05 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4。pH 7.0的緩沖溶液將肌原纖維蛋白調(diào)至需要的質(zhì)量濃度，取10 mL加入到試管中，室溫下保持2 h，而后分別置于54（一分熟）、58（三分熟）、63（五分熟）、68（七分熟）、72（全熟）、100 ℃（過熟）的水浴鍋中保溫15 min，以未經(jīng)加熱處理的樣品作為對(duì)照，保溫結(jié)束后，立即取出置于0～4 ℃的冰浴中存放過夜，第二天進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 熟度對(duì)肌原纖維蛋白聚集特性的影響分析

1.3.2.1 肌原纖維蛋白濁度測(cè)定

用0.6 mol/L NaCl、0.05 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0的緩沖溶液將肌原纖維蛋白溶液質(zhì)量濃度調(diào)整為1 mg/mL，按1.3.1節(jié)方式加熱處理后，參考孔保華等[8]的方法，于600 nm波長處測(cè)定吸光度，以0.6 mol/L NaCl、0.05 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0的緩沖溶液為空白。

1.3.2.2 肌原纖維蛋白粒徑測(cè)定

用0.6 mol/L NaCl、0.05 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0的緩沖溶液將蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整為10 mg/mL，按1.3.1節(jié)方式加熱處理后，用激光粒度儀對(duì)不同加熱處理的肌原纖維蛋白進(jìn)行粒徑測(cè)定。采用體積分布法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，分別選取d0.1、d0.5、d0.9平均粒徑及分布寬度進(jìn)行表示，其中，d0.1、d0.5、d0.9分別表示樣品的累計(jì)粒徑分布數(shù)達(dá)到10%、50%、90%時(shí)所對(duì)應(yīng)的粒徑，峰的分布寬度為（d0.9－d0.1）/d0.5。

1.3.3 熟度對(duì)肌原纖維蛋白氧化程度的影響分析

1.3.3.1 肌原纖維蛋白表面疏水性測(cè)定

用0.6 mol/L NaCl、0.05 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0的緩沖溶液將肌原纖維蛋白溶液質(zhì)量濃度調(diào)整為1 mg/mL，按1.3.1節(jié)方式加熱處理后，參考Chelh等[9]的方法進(jìn)行測(cè)定。取1 mL懸浮液加入40 μL 1 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液，空白對(duì)照為1 mL該緩沖液加入40 μL 1 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液，漩渦振蕩混勻10 min，4 ℃、4 000×g離心15 min，取上清液稀釋10 倍后，測(cè)定595 nm波長處的OD值，按公式（1）計(jì)算溴酚藍(lán)結(jié)合量，以溴酚藍(lán)結(jié)合量表示表面疏水性。

1.3.3.2 肌原纖維蛋白羰基含量測(cè)定

用0.6 mol/L NaCl、0.05 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0的緩沖溶液將肌原纖維蛋白溶液質(zhì)量濃度調(diào)整為10 mg/mL，按1.3.1節(jié)方式加熱處理后，參考趙冰等[10]的方法，采用2,4-二硝基苯肼法進(jìn)行測(cè)定。從不同熟度的肌原纖維蛋白溶液中取1 mL加入到50 mL離心管中，再加入4 mL含10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼的2 mol/L HCl溶液，以不含2,4-二硝基苯肼的2 mol/L HCl溶液為空白，25 ℃反應(yīng)1 h。然后每個(gè)樣品中加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的三氯乙酸溶液，振蕩混合均勻，在4 ℃條件下，于11 000×g離心5 min，棄上清液，沉淀部分用2 mL體積比為1∶1的乙醇-乙酸乙酯溶液洗滌4 次，以完全洗去未反應(yīng)的2,4-二硝基苯肼，氮吹除去殘留的有機(jī)溶液，然后加入2 mL 6 mol/L的鹽酸胍溶液（pH 2.3），37 ℃保溫30 min，然后在370 nm波長處測(cè)定吸光度，蛋白質(zhì)溶液的質(zhì)量濃度采用雙縮脲法測(cè)定，用于計(jì)算蛋白質(zhì)羰基含量的摩爾吸光系數(shù)為22 000 L/（mol·cm）。

1.3.3.3 肌原纖維蛋白巰基含量測(cè)定

用0.6 mol/L NaCl、0.05 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0的緩沖溶液調(diào)整肌原纖維蛋白溶液質(zhì)量濃度為10 mg/mL，按1.3.1節(jié)方式加熱處理后，參照Ellman[11]的試劑法并稍作修改測(cè)定活性巰基含量：取1 mL不同熟度的肌原纖維蛋白溶液加入5 mL Tris-甘氨酸溶液（pH 8.0），然后加入50 μL含質(zhì)量濃度4 mg/mL DTNB的Tris-甘氨酸溶液，25 ℃放置60 min，2 000×g冷凍離心15 min，取上清液，在412 nm波長處測(cè)定吸光度。蛋白質(zhì)溶液的質(zhì)量濃度采用雙縮脲法測(cè)定。按照公式（2）計(jì)算活性巰基含量。

式中：X為活性巰基含量/（nmol/mg），即每毫克蛋白質(zhì)中所含巰基物質(zhì)的量；A為吸光度；ρ為待測(cè)液蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；C為摩爾吸光系數(shù)（13 600 L/（mol·cm））；DF為稀釋倍數(shù)。

總巰基含量測(cè)定：取1 mL不同熟度的肌原纖維蛋白溶液加入5 mL含8 mol/L尿素的Tris-甘氨酸溶液（pH 8.0），然后加入50 μL含質(zhì)量濃度4 mg/mL DTNB的Tris-甘氨酸溶液，25 ℃放置60 min，2 000×g冷凍離心15 min，取上清液，在412 nm波長處測(cè)定吸光度。蛋白質(zhì)溶液的質(zhì)量濃度采用雙縮脲法測(cè)定。按公式（2）計(jì)算總巰基含量。

1.3.3.4 二酪氨酸熒光強(qiáng)度測(cè)定

用0.6 mol/L NaCl、0.05 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0的緩沖溶液將肌原纖維蛋白溶液質(zhì)量濃度調(diào)整為0.5 mg/mL，按1.3.1節(jié)方式加熱處理后參考Davies等[12]的方法并稍作修改。將不同加熱處理的肌原纖維蛋白溶液11 000×g離心10 min，取上清液，采用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)二酪氨酸的熒光強(qiáng)度。測(cè)定條件：發(fā)射波長420 nm，狹縫寬度10 nm；激發(fā)波長325 nm，狹縫寬度10 nm。最終結(jié)果用熒光強(qiáng)度除以蛋白質(zhì)量濃度，表示為相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.3.4 熟度對(duì)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的影響分析

1.3.4.1 肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光光譜分析

用0.6 mol/L NaCl、0.05 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0的緩沖溶液將肌原纖維蛋白溶液質(zhì)量濃度調(diào)整為1 mg/mL，按1.3.1節(jié)方式加熱處理后參考康懷彬等[13]的方法并稍作修改。將不同加熱處理的肌原纖維蛋白溶液11 000×g離心10 min，取上清液進(jìn)行分析。測(cè)定條件：以0.6 mol/L NaCl、0.05 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0的緩沖溶液作為空白，采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描，光譜激發(fā)波長295 nm、發(fā)射波長300～400 nm、波長掃描范圍300～500 nm、激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。

1.3.4.2 肌原纖維蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

用0.6 mol/L NaCl、0.05 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0的緩沖溶液將肌原纖維蛋白溶液質(zhì)量濃度調(diào)整為10 mg/mL，按1.3.1節(jié)方式加熱處理后參考倪娜[14]的方法進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。電泳條件：分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%、濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、上樣量10 μL。采用直流恒壓電源，濃縮膠電壓80 V、分離膠電壓120 V。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色30 min，然后用脫色液脫色，直至背景為無色，使用掃描儀掃描并通過Quantity one 4.6.2軟件分析圖像。

1.3.4.3 衰減全反射傅里葉變換紅外光譜分析

用0.6 mol/L NaCl、0.05 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0的緩沖溶液將肌原纖維蛋白溶液質(zhì)量濃度調(diào)整為10 mg/mL，按1.3.1節(jié)方式加熱處理后，參考Gangidi等[15]的方法并稍作修改。取適量不同加熱處理的肌原纖維蛋白溶液置于衰減全反射附件上進(jìn)行掃描，通過扣除0.6 mol/L NaCl、0.05 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0的緩沖溶液背景進(jìn)行基線校準(zhǔn)，掃描范圍4 000～400 cm－1、信號(hào)掃描累加64 次、掃描分辨率4 cm－1，每種處理圖譜重復(fù)掃描3 次。

圖譜處理：首先采用儀器自帶的OPUS 7.0軟件對(duì)圖譜進(jìn)行預(yù)處理，然后采用PeakFit 4.12軟件對(duì)酰胺I帶（1 700～1 600 cm－1）圖譜進(jìn)行分析，估計(jì)各疊加子峰個(gè)數(shù)及峰位，確定各子峰歸屬，根據(jù)各子峰積分面積計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用Origin 8.5軟件進(jìn)行圖表繪制，采用SAS 8.1統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，顯著性差異使用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 熟度對(duì)肌原纖維蛋白聚集特性的影響

2.1.1 熟度對(duì)肌原纖維蛋白濁度的影響

由圖1可知，熟度對(duì)肌原纖維蛋白濁度影響顯著（P＜0.05），隨著熟度的增加，濁度整體呈升高趨勢(shì)。蛋白熟度從對(duì)照到七分熟時(shí)，溶液濁度顯著增大（P＜0.05），表明蛋白發(fā)生聚集，濁度越大其聚集程度就越大；從七分熟開始，隨著熟度的增加，溶液濁度顯著下降（P＜0.05），表明聚集的蛋白在熱作用下開始發(fā)生解聚，導(dǎo)致濁度下降。上述變化主要與肌原纖維蛋白的組成有關(guān)。肌原纖維蛋白主要由肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白組成，不同的蛋白質(zhì)具有不同的變性溫度，其中，肌球蛋白的變性溫度為50～60 ℃；肌動(dòng)蛋白的變性溫度為70～80 ℃[16-17]。在七分熟時(shí)，蛋白的終點(diǎn)溫度為68 ℃左右，此時(shí)的肌球蛋白已完全變性，分子之間發(fā)生了充分聚集，導(dǎo)致濁度上升，這與Boyer[18]、李清正[19]和潘錦鋒[20]等研究結(jié)果相一致。隨著熟度的繼續(xù)增加，肌原纖維蛋白已完全變性，變性的蛋白破壞了凝膠聚集體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的完整性，在熱的作用下蛋白聚集體發(fā)生了明顯的降解，形成大量的小分子蛋白片段，從而導(dǎo)致濁度下降[21]。

圖1 熟度對(duì)肌原纖維蛋白濁度的影響Fig. 1 Effect of degree of doneness on the turbidity of myofibrillar protein

2.1.2 熟度對(duì)肌原纖維蛋白粒徑的影響

由表1可知，從一分熟到全熟，隨著熟度的增加，肌原纖維蛋白d0.1、d0.5、d0.9和平均粒徑均總體呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢(shì)，并在五分熟時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到最大；而后呈現(xiàn)隨熟度的增加而減小的趨勢(shì)，上述現(xiàn)象與圖1蛋白濁度的變化趨勢(shì)相似，進(jìn)一步說明在烹飪過程中，蛋白在熱的作用下首先發(fā)生了聚集；此外，在熟制后期，隨著蛋白熟度的增加，蛋白聚集體發(fā)生部分解聚，從而導(dǎo)致粒徑變小，峰分布寬度變窄。

表1 熟度對(duì)肌原纖維蛋白粒徑的影響Table 1 Effect of degree of doneness on particle diameter of myofibrillar protein

2.2 熟度對(duì)肌原纖維蛋白氧化程度的影響

2.2.1 熟度對(duì)肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

由圖2可知，熟度對(duì)肌原纖維蛋白表面疏水性影響顯著（P＜0.05），其中，一分熟與過熟，五分熟與全熟之間表面疏水性差異不顯著（P＞0.05）。從對(duì)照組到過熟，隨著熟度的增加，蛋白表面疏水性逐漸增大，并在七分熟時(shí)達(dá)到最大，而后又隨熟度的增加而減小，這與李清正[19]、呂彤[22]和Promeyrat[23]等的研究結(jié)果相一致。有研究指出，大多數(shù)表面疏水性基團(tuán)位于肌球蛋白的頭部，且加熱過程中肌原纖維蛋白疏水性均呈上升趨勢(shì)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，從對(duì)照組到七分熟，表面疏水性持續(xù)升高，繼續(xù)升溫則表面疏水性降低，其原因可能在于從對(duì)照組到七分熟，隨著熟度的增加，蛋白疏水性側(cè)鏈暴露程度增大，使蛋白水溶環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷原h(huán)境，從而導(dǎo)致表面疏水性升高；隨著熟度進(jìn)一步增加，肌球蛋白會(huì)發(fā)生變性而肌原纖維蛋白會(huì)發(fā)生聚集和側(cè)鏈間的反應(yīng)，出現(xiàn)沉淀，隨著蛋白聚集程度增加，少量疏水基團(tuán)又被重新包埋于肌球蛋白內(nèi)部而導(dǎo)致其表面疏水性降低[19,25]。

圖2 熟度對(duì)肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig. 2 Effect of degree of doneness on surface hydrophobicity of myofibrillar protein

2.2.2 熟度對(duì)肌原纖維蛋白羰基含量的影響

蛋白質(zhì)中羰基含量是蛋白氧化的重要指標(biāo)之一，羰基的形成是蛋白質(zhì)發(fā)生氧化的明顯標(biāo)記，反映了蛋白質(zhì)氧化破壞的程度，一般來說，羰基含量越高，蛋白氧化程度越大。由圖3可知，熟度對(duì)蛋白羰基含量影響顯著（P＜0.05），隨著熟度的增加，蛋白羰基含量呈逐漸增大趨勢(shì)，其中，七分熟與全熟的蛋白羰基含量差異不顯著（P＞0.05）。Srinivasan等[26]研究表明，通常蛋白質(zhì)氧化會(huì)同時(shí)伴隨脂肪的氧化，而脂肪的氧化反過來又會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)發(fā)生氧化。本研究所提取的肌原纖維蛋白，不可避免地會(huì)含有少量脂肪。有研究發(fā)現(xiàn)，肌原纖維蛋白中殘余脂肪約占其干質(zhì)量的0.49%，主要來源于肌肉細(xì)胞膜中的磷脂[27]。磷脂中富含的不飽和脂肪酸極易發(fā)生氧化而生成醛、酮、醇、酸等物質(zhì)，其中，醛類物質(zhì)可進(jìn)一步與蛋白氨基酸側(cè)鏈發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化。

圖3 熟度對(duì)肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig. 3 Effect of degree of doneness on carbonyl group content of myofibrillar protein

2.2.3 熟度對(duì)肌原纖維蛋白巰基含量的影響

肌原纖維蛋白富含巰基，其暴露于氧化條件下易轉(zhuǎn)化為二硫鍵，導(dǎo)致巰基含量降低，因此巰基含量也是表征蛋白氧化程度的重要指標(biāo)。由圖4可知，隨著蛋白熟度的增加，活性巰基、總巰基含量均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)（P＜0.05）。研究表明，加熱溫度顯著影響肌動(dòng)球蛋白的解離程度，較低的加熱溫度（50～60 ℃）對(duì)肌動(dòng)球蛋白的解離有不同程度的促進(jìn)作用，其中60 ℃是促進(jìn)肌動(dòng)球蛋白解離的最佳溫度[28-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，肌原纖維蛋白從對(duì)照組到三分熟，活性巰基含量上升，表明肌動(dòng)球蛋白分子發(fā)生解離，原因在于三分熟時(shí)，蛋白的終點(diǎn)溫度為58 ℃左右，正好位于肌動(dòng)球蛋白解離的最佳溫度范圍；隨著熟度增加，肌動(dòng)球蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，活性巰基被氧化成二硫鍵，從而導(dǎo)致巰基含量減少。

圖4 熟度對(duì)肌原纖維蛋白活性巰基和總巰基含量的影響Fig. 4 Effect of degree of doneness on active sulfhydryl and total sulfhydryl contents of myofibrillar protein

2.2.4 熟度對(duì)二酪氨酸熒光強(qiáng)度的影響

酪氨酸是自由基氧化攻擊的敏感氨基酸，易被氧化形成二酪氨酸，因此，檢測(cè)二酪氨酸熒光強(qiáng)度的變化可以反映蛋白質(zhì)的氧化程度[31]。由圖5可知，熟度對(duì)肌原纖維蛋白二酪氨酸熒光強(qiáng)度的影響顯著（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，隨著熟度的增加，二酪氨酸熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先升高后降低、然后又升高的變化趨勢(shì)，且在一分熟時(shí)達(dá)到最高，七分熟時(shí)達(dá)到最低，恰與前文表面疏水性、羰基含量和巰基含量的變化趨勢(shì)相反，這可能與熟制過程中蛋白的聚集狀態(tài)有關(guān)。熟制初期（一分熟）蛋白終點(diǎn)溫度為54 ℃左右，此時(shí)肌動(dòng)球蛋白受熱發(fā)生解離[28-30]，蛋白分子結(jié)構(gòu)逐漸展開，使酪氨酸側(cè)鏈基團(tuán)的暴露程度增大，增加自由基攻擊的概率，產(chǎn)生較多的酪氨酰自由基和酪氨酸殘基，形成較多的二酪氨酸，導(dǎo)致二酪氨酸熒光強(qiáng)度較大；隨著烹飪熟度的增加，七分熟時(shí)蛋白終點(diǎn)溫度為68 ℃左右，肌原纖維蛋白在熱的作用下會(huì)發(fā)生變性、聚集并形成凝膠網(wǎng)絡(luò)，此時(shí)部分酪氨酸側(cè)鏈和生成的二酪氨酸被包埋于蛋白內(nèi)部，不僅降低了自由基攻擊概率，而且也減弱了二酪氨酸的熒光強(qiáng)度，從而使檢測(cè)結(jié)果降低；在熟制后期，從七分熟到過熟，此階段蛋白終點(diǎn)溫度較高，蛋白體系中產(chǎn)生較多的自由基，此外，蛋白聚集體在熱的作用下發(fā)生裂解，破壞了蛋白空間結(jié)構(gòu)的完整性[8,13,21]，增加自由基攻擊酪氨酸側(cè)鏈的概率，從而導(dǎo)致二酪氨酸熒光強(qiáng)度上升。

圖5 熟度對(duì)肌原纖維蛋白二酪氨酸熒光強(qiáng)度的影響Fig. 5 Effect of degree of doneness on fluorescence intensity of dityrosine from myofibrillar protein

綜上所述，肌原纖維蛋白在熟制過程中，隨著蛋白熟度的增加，羰基含量呈逐漸增大的趨勢(shì)，表面疏水性、巰基含量呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，二酪氨酸熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先升高后降低而后又升高的U字型變化趨勢(shì)。綜合分析表面疏水性、羰基含量、巰基含量和二酪氨酸熒光強(qiáng)度等指標(biāo)在熟制過程中的變化趨勢(shì)發(fā)現(xiàn)，熟制過程對(duì)肌原纖維蛋白的氧化程度影響顯著。

2.3 熟度對(duì)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 內(nèi)源熒光光譜分析結(jié)果

蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要來源于芳香族氨基酸殘基，主要是色氨酸殘基，采用295 nm作為激發(fā)波長，可以只激發(fā)色氨酸殘基，排除酪氨酸殘基的干擾；因此，將該激發(fā)波長處的內(nèi)源熒光全部歸于色氨酸殘基的貢獻(xiàn)[32]。色氨酸熒光發(fā)射光譜主要反映色氨酸微環(huán)境極性的變化，是監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)分子三級(jí)結(jié)構(gòu)的重要技術(shù)手段之一[33]。由圖6和表2可知，熟度對(duì)肌原纖維蛋白最大吸收波長（λmax）影響明顯（P＜0.05）。對(duì)照組的肌原纖維蛋白的λmax位于334 nm波長附近，當(dāng)?shù)鞍资於冗_(dá)到一分熟時(shí)，λmax向長波方向紅移至335 nm波長附近，最大熒光強(qiáng)度由1 177 AU升高至1 353 AU，說明在此階段，蛋白分子受熱伸展，色氨酸殘基暴露程度增大；從一分熟到三分熟，λmax紅移2 nm至337 nm附近，此時(shí)最大熒光強(qiáng)度下降至1 031 AU，這可能是由于肌球蛋白受熱發(fā)生凝集[34]，蛋白分子表面性質(zhì)發(fā)生改變，導(dǎo)致蛋白熒光發(fā)射減弱，熒光強(qiáng)度減?。粡娜质斓轿宸质?，熒光強(qiáng)度下降至840 AU，由于λmax未發(fā)生變化，故無法確定蛋白結(jié)構(gòu)的變化[35]；從五分熟到七分熟，λmax藍(lán)移2 nm至335 nm波長處，最大熒光強(qiáng)度由840 AU升高至865 AU，表明蛋白分子受熱發(fā)生聚集，構(gòu)象發(fā)生改變，色氨酸殘基逐漸暴露；從七分熟到全熟，λmax紅移2 nm至337 nm波長處，最大熒光強(qiáng)度繼續(xù)增大，這可能是蛋白分子受熱發(fā)生降解，增加了色氨酸殘基的暴露程度，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增大；繼續(xù)增加熟度至過熟，蛋白完全變性且構(gòu)象趨于穩(wěn)定，λmax保持不變，蛋白分子降解程度增加[8,13,21]，使色氨酸殘基暴露程度增大，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增大。

表2 熟度對(duì)肌原纖維蛋白λmax和最大熒光強(qiáng)度的影響Table 2 Effect of degree of doneness on λmax and fluorescence intensity of myofibrillar protein

圖6 熟度對(duì)肌原纖維蛋白熒光光譜的影響Fig. 6 Effect of degree of doneness on fluorescence spectrum of myofibrillar protein

2.3.2 肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化

由表3可知，對(duì)照組的肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-折疊為主，相對(duì)含量約為36.37%，其次是α-螺旋（29.43%）、無規(guī)卷曲（20.32%）、β-轉(zhuǎn)角（13.88%）。隨著熟度的增加，β-折疊相對(duì)含量呈現(xiàn)逐步降低而后又升高的變化趨勢(shì)，其中在五分熟時(shí)，相對(duì)含量達(dá)到最低；無規(guī)卷曲相對(duì)含量在五分熟之前保持相對(duì)穩(wěn)定，然后隨熟度增加而逐漸下降；α-螺旋相對(duì)含量在五分熟之前也保持相對(duì)穩(wěn)定，從五分熟到全熟，相對(duì)含量逐漸增大，到過熟時(shí)，其相對(duì)含量開始下降；β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量在熟制過程中一直保持相對(duì)增加的趨勢(shì)。

表3 不同熟度肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量變化Table 3 Changes in secondary structure relative contents of myofibrillar protein with different degrees of doneness

α-螺旋結(jié)構(gòu)是通過分子內(nèi)氫鍵維持的蛋白質(zhì)分子內(nèi)的有序排列；β-折疊是通過分子間氫鍵維持的蛋白質(zhì)分子間的有序排列。在加熱條件下，α-螺旋相對(duì)含量降低表示蛋白質(zhì)分子內(nèi)氫鍵作用減弱，蛋白質(zhì)分子展開程度增加；β-折疊相對(duì)含量增加表明蛋白質(zhì)分子間氫鍵作用增強(qiáng)，蛋白質(zhì)分子間聚集程度增加[36]。上述結(jié)果表明，五分熟是肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量變化的拐點(diǎn)。蛋白從對(duì)照到五分熟，β-折疊相對(duì)含量降低，α-螺旋相對(duì)含量保持穩(wěn)定，推測(cè)此時(shí)蛋白分子主要靠分子內(nèi)氫鍵維持；從五分熟開始，β-折疊相對(duì)含量逐漸增加，α-螺旋相對(duì)含量先增加后降低，表明蛋白分子間聚集程度逐漸增大。這可能與肌原纖維蛋白的解離及其凝膠機(jī)制有關(guān)。肌動(dòng)球蛋白是肌原纖維蛋白的主要成分，肉品加熱會(huì)引起肌動(dòng)球蛋白發(fā)生解離[37]，當(dāng)?shù)鞍走_(dá)到五分熟時(shí)，終點(diǎn)溫度為63 ℃左右，能夠促進(jìn)肌動(dòng)球蛋白的解離[29]，肌球蛋白分子此時(shí)發(fā)生變性，尾部結(jié)構(gòu)全部消失，相互凝集成球狀，熟度繼續(xù)增加至全熟，終點(diǎn)溫度超過了肌球蛋白的變性溫度，分子結(jié)構(gòu)變得松散，暴露出活性基團(tuán)并使之交聯(lián)[38]；此外，肌動(dòng)蛋白開始發(fā)生變性會(huì)促進(jìn)蛋白分子進(jìn)一步聚集，此時(shí)蛋白凝膠效果最好[8,39]，從全熟以后，蛋白分子開始發(fā)生分解。

2.3.3 肌原纖維蛋白組分的變化

為了分析熟度對(duì)蛋白組分的影響，對(duì)不同熟度的肌原纖維蛋白溶液進(jìn)行離心，然后對(duì)上清液進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果見圖7。在不同熟度肌原纖維蛋白泳道上存在多條共同的條帶，主要包括肌鈣蛋白T、原肌球蛋白、肌球蛋白輕鏈1、肌鈣蛋白I亞基、肌球蛋白輕鏈2和肌球蛋白輕鏈3共6 種，說明這6 種蛋白均未參與熱誘導(dǎo)凝膠的形成。而肌球蛋白重鏈、α-肌動(dòng)素和肌動(dòng)蛋白3 種蛋白只在對(duì)照組和一分熟的泳道對(duì)應(yīng)位置出現(xiàn)條帶，在其他熟度相應(yīng)位置均未發(fā)現(xiàn)條帶，說明這3 種蛋白參與了熱誘導(dǎo)凝膠的形成，這與文獻(xiàn)[40-41]研究結(jié)果相一致。由圖7、8可知，隨著蛋白熟度的增加，肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白的灰度均呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(shì)，其中，從對(duì)照組到三分熟，肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白灰度緩慢上升，表明肌原纖維蛋白受熱發(fā)生聚集，繼續(xù)加熱到過熟狀態(tài)，蛋白分子完全變性，在熱的作用下蛋白聚集體開始降解，導(dǎo)致灰度緩慢下降；而對(duì)于α-肌動(dòng)素來說，在烹調(diào)過程中，其灰度整體呈增大趨勢(shì)，具體原因未知。

3 結(jié) 論

本研究以牛背最長肌肌原纖維蛋白為研究對(duì)象，研究了蛋白在熟制過程中聚集特性、氧化特性和結(jié)構(gòu)特性的變化規(guī)律，結(jié)果表明：烹飪過程顯著影響肌原纖維蛋白的聚集特性、氧化特性和結(jié)構(gòu)特性。從對(duì)照組到過熟，肌球蛋白重鏈、α-肌動(dòng)素和肌動(dòng)蛋白3 種蛋白參與了肌原纖維蛋白的熱聚集行為，隨著烹飪熟度的增加，肌原纖維蛋白在溶液中的狀態(tài)逐漸由聚集向解聚轉(zhuǎn)化；在烹飪過程中，蛋白羰基含量逐漸增大，表面疏水性、巰基含量呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)；二酪氨酸熒光強(qiáng)度、內(nèi)源熒光強(qiáng)度隨熟度的增加呈現(xiàn)先升高后降低然后又升高的U型變化趨勢(shì)；五分熟是肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量發(fā)生變化的拐點(diǎn)，蛋白從對(duì)照組到五分熟，β-折疊相對(duì)含量降低，α-螺旋相對(duì)含量保持穩(wěn)定，蛋白主要以分子內(nèi)聚集為主，從五分熟到過熟，β-折疊相對(duì)含量逐漸增加，α-螺旋相對(duì)含量先增加后降低，蛋白以分子間聚集為主。本研究結(jié)果可為西餐牛排煎制工藝優(yōu)化和品質(zhì)控制提供理論依據(jù)。