閆玉卿，張一敏，董鵬程，毛衍偉，梁榮蓉，朱立賢,*，羅 欣,2

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

沙門(mén)氏菌（Salmonellaspp.）是一種可以使人畜患病的革蘭氏陰性腸道桿菌[1]，在肉類食品中的污染率較高[2]。沙門(mén)氏菌易引起高暴發(fā)率食源性疾病，威脅著人類的健康，2008—2015年間，我國(guó)因微生物導(dǎo)致的食物中毒事件占62.02%，其中沙門(mén)氏菌所引起中毒事件占比為23%，居于首位[3]。生物被膜是一種附著在接觸表面上，由細(xì)菌和細(xì)菌分泌的細(xì)胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS）共同形成的致密網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[4]。研究發(fā)現(xiàn)生物被膜是引起細(xì)菌污染的重要原因之一，由食源性致病菌引起的食物變質(zhì)和生物被膜的形成已成為食品工業(yè)中的嚴(yán)重問(wèn)題[5]。一般而言，生物被膜中的細(xì)菌比懸浮狀態(tài)的浮游菌具有更高的抵抗環(huán)境脅迫（如干燥、紫外線或消毒劑）的能力[6]，因而對(duì)生物被膜的控制更加困難。沙門(mén)氏菌可以分為不同的血清型，不同地區(qū)的沙門(mén)氏菌血清型的流行程度不同，到目前為止，已經(jīng)鑒定出2 600多種沙門(mén)氏菌血清型[7]。本課題組在2014年報(bào)道了我國(guó)肉牛屠宰環(huán)節(jié)沙門(mén)氏菌的檢出率是6.5%，S. Derby是分離的野生菌株中主要的血清型之一[8]，且研究發(fā)現(xiàn)S. Derby在25 ℃條件下有較高的生物被膜形成能力[9]，因而本實(shí)驗(yàn)選取野生菌株S. Derby作為實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行生物被膜的探究。

生物被膜的形成機(jī)制復(fù)雜，與細(xì)菌的黏附、EPS產(chǎn)生、生物被膜內(nèi)細(xì)胞代謝活性等密切相關(guān)。次氯酸鈉具有良好的廣譜殺菌活性，因其高功效和低成本成為食品工業(yè)中廣泛使用的消毒劑[10]，在水中，次氯酸鈉發(fā)生水解反應(yīng)生成次氯酸，在滅活細(xì)菌方面比ClO－更有效[11]。據(jù)報(bào)道，次氯酸鈉可氧化細(xì)菌蛋白質(zhì)并導(dǎo)致細(xì)菌死亡[12]。深入了解次氯酸鈉脅迫條件下沙門(mén)氏菌生物被膜的形成及其機(jī)制有助于提出更好的減少和消除食品行業(yè)生物被膜的策略。此前已有研究發(fā)現(xiàn)次氯酸鈉對(duì)于生物被膜具有一定的控制效果[13-15]，但其作用機(jī)制尚不完全清楚，目前缺少定量評(píng)估次氯酸鈉影響沙門(mén)氏菌生物被膜EPS含量、運(yùn)動(dòng)性以及微觀結(jié)構(gòu)等的報(bào)道。

因此，本研究將不同體積分?jǐn)?shù)的次氯酸鈉作用于S. Derby及其生物被膜，探究其對(duì)浮游菌的抑制作用以及對(duì)生物被膜的抑制和清除效果。此外，從生物被膜內(nèi)細(xì)胞的代謝活性、細(xì)菌的泳動(dòng)能力、EPS含量和微觀結(jié)構(gòu)方面分析不同體積分?jǐn)?shù)次氯酸鈉對(duì)它們的影響，以探究次氯酸鈉對(duì)沙門(mén)氏菌生物被膜的抑制機(jī)制。本研究結(jié)果可以為肉類企業(yè)中生物被膜的消減提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

S. Derby分離自山東省肉牛屠宰廠[8]，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院畜產(chǎn)品加工實(shí)驗(yàn)室保存。

胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）液體培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）培養(yǎng)基、D/E中和肉湯培養(yǎng)基、葡萄糖、細(xì)菌瓊脂粉、LB培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；氯化鈉、結(jié)晶紫染料 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；10%次氯酸鈉、95%乙醇 天津凱通化學(xué)試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.2～7.4）、CCK-8試劑盒、刃天青 北京索萊寶科技有限公司；96 孔板、24 孔板、細(xì)菌培養(yǎng)板 美國(guó)康寧公司；BCA蛋白定量試劑盒 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；LIVE/DEAD熒光染液 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

G154DWS滅菌鍋 廈門(mén)致微公司；多道移液槍德國(guó)Eppendorf公司；Epoch2型酶標(biāo)儀 美國(guó) BioTek公司；HF safe-MJQ1型紅外線滅菌器 上海力申科學(xué)儀器有限公司；LSM880激光共聚焦掃描顯微鏡 德國(guó)Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及生物被膜定量

將凍存于－20 ℃的S. Derby融解，接種于新鮮的TSB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃下過(guò)夜培養(yǎng)18 h進(jìn)行活化，經(jīng)2 次活化后菌液濃度約為9（lg（CFU/mL）），備用。

將上述菌液在8 000×g、4 ℃下離心10 min，去上清液，無(wú)菌生理鹽水重復(fù)洗滌沉淀2 次，使用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度至7（lg（CFU/mL）），在96 孔板中加入100 μL TSB培養(yǎng)液并接種100 μL上述菌液，以只加200 μL的新鮮TSB培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照。每個(gè)樣本重復(fù)6 個(gè)孔。96 孔板加蓋后，放置在25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，期間每天對(duì)S. Derby生物被膜進(jìn)行定量。

采用結(jié)晶紫染色法對(duì)生物被膜定量：棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，用PBS沖洗3 次除去浮游菌，在室溫下自然風(fēng)干45 min。避光條件下每個(gè)孔中加200 μL結(jié)晶紫染液，避光染色30 min。棄去孔內(nèi)染液，用PBS沖洗3 次除去多余染料，在室溫下自然風(fēng)干45 min。向每個(gè)孔中加200 μL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，洗脫與生物被膜定量結(jié)合的染液。30 min后使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD570nm[16-17]。

采用平板菌落計(jì)數(shù)法對(duì)生物被膜進(jìn)行定量：棄去孔中的培養(yǎng)液，用200 μL無(wú)菌生理鹽水清洗3 次后，用刮刀將生物被膜細(xì)菌刮下，200 μL無(wú)菌生理鹽水重懸被膜，梯度稀釋，用TSA平板計(jì)數(shù)[18]。

1.3.2S. Derby的最小抑菌濃度與最小殺菌濃度測(cè)定

使用TSB培養(yǎng)液通過(guò)二倍稀釋法得到不同體積分?jǐn)?shù)的次氯酸鈉溶液，分別取100 μL添加到96 孔板中。采用1.3.1節(jié)中的方法將活化的菌液濃度調(diào)整為5（lg（CFU/mL）），取100 μL該菌懸液加入96 孔板中與次氯酸鈉溶液混合，使次氯酸鈉溶液的終體積分?jǐn)?shù)分別為0.32%、0.16%、0.08%、0.04%、0.02%、0.01%、0，每個(gè)樣本重復(fù)6 個(gè)孔。將96 孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。向每孔中加入10 μL 6.75 g/L的刃天青溶液（藍(lán)色），然后在37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。孔中溶液顏色由藍(lán)變紅即為有細(xì)菌生長(zhǎng)，未發(fā)生顏色變化的最低體積分?jǐn)?shù)即為最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）[19]。將孔中混合菌液均勻涂布于TSA平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后無(wú)菌體生長(zhǎng)的最低體積分?jǐn)?shù)即為最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）[15]。

1.3.3 次氯酸鈉抑制S. Derby生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

在96 孔板中加入100 μL TSB培養(yǎng)液，加入100 μL體積分?jǐn)?shù)0.32%的次氯酸鈉后依次二倍稀釋。采用1.3.1節(jié)中的方法將菌液稀釋至7（lg（CFU/mL）），并接種菌液至96 孔板內(nèi)，使得孔中的次氯酸鈉終體積分?jǐn)?shù)分別為0（對(duì)照）、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC，每個(gè)樣本重復(fù)6 個(gè)孔。將96 孔板置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每1 h取出使用酶標(biāo)儀測(cè)其在600 nm波長(zhǎng)處的OD值，收集數(shù)據(jù)，繪制生長(zhǎng)曲線[20]。

1.3.4 次氯酸鈉對(duì)S. Derby生物被膜的抑制率與清除率測(cè)定

按照1.3.3節(jié)中的方法制備含不同體積分?jǐn)?shù)次氯酸鈉的混合菌液，于25 ℃培養(yǎng)4 d。利用結(jié)晶紫染色法測(cè)得每個(gè)處理組在570 nm波長(zhǎng)處的OD值，記為OD1，不含次氯酸鈉的對(duì)照組記為OD0。次氯酸鈉對(duì)生物被膜的抑制率按公式（1）計(jì)算[21]。

采用1.3.1節(jié)中的方法將活化的菌液濃度調(diào)整為7（lg（CFU/mL）），在96 孔板中加入100 μL TSB培養(yǎng)液并接種100 μL上述菌液，以只加200 μL的新鮮TSB培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照。于25 ℃培養(yǎng)4 d（生物被膜達(dá)到成熟），棄去孔中的培養(yǎng)液，使用200 μL無(wú)菌生理鹽水清洗3 次。分別加入200 μL體積分?jǐn)?shù)為0（對(duì)照）、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、2 MIC的次氯酸鈉溶液靜置處理15 min，吸出上清液；加入D/E中和肉湯培養(yǎng)基處理5 min后吸出上清液。使用刮刀將生物被膜細(xì)菌刮下，200 μL無(wú)菌生理鹽水重懸被膜，梯度稀釋，用TSA平板計(jì)數(shù)。每個(gè)樣本重復(fù)6 個(gè)孔。次氯酸鈉處理組計(jì)數(shù)為N1，對(duì)照組記為N0，次氯酸鈉對(duì)生物被膜的清除率按公式（2）計(jì)算[22-23]。

1.3.5S. Derby泳動(dòng)能力的測(cè)定

菌株泳動(dòng)能力的測(cè)定采用軟瓊脂平板法，單一泳動(dòng)平板的配方：質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%瓊脂、2.5 g/L葡萄糖、5 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨。群集泳動(dòng)平板的配方：質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%瓊脂粉、0.5 g/L葡萄糖、25 g/L LB培養(yǎng)基。制作平板時(shí)加入次氯酸鈉溶液，使得平板中次氯酸鈉的最終體積分?jǐn)?shù)分別是0（對(duì)照）、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC。將1.3.1節(jié)中活化的菌液取3 μL接種于兩種平板的中心表面，在室溫下放置20 min使菌液充分吸收；將單一泳動(dòng)平板置于25 ℃下培養(yǎng)24 h，將群集泳動(dòng)平板置于25 ℃下培養(yǎng)48 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)定菌株擴(kuò)散圈的直徑，每種平板重復(fù)3 次[24]。

1.3.6S. Derby生物被膜內(nèi)細(xì)胞代謝活性的測(cè)定

按照1.3.3節(jié)中的方法制備含不同體積分?jǐn)?shù)次氯酸鈉的混合菌液，于25 ℃培養(yǎng)4 d。用PBS沖洗3 次，去除表面浮游菌，再向每孔加入100 μL PBS和10 μL CCK-8試劑，37 ℃培養(yǎng)4 h，測(cè)其在450 nm波長(zhǎng)處的OD值。次氯酸鈉處理組記為OD1，對(duì)照組記為OD0，次氯酸鈉對(duì)S. Derby生物被膜內(nèi)細(xì)胞代謝活性的抑制率計(jì)算見(jiàn)公式（3）[25]。

1.3.7S. Derby生物被膜胞外多糖、蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定

按照1.3.3節(jié)中的方法在24 孔板中制備含不同體積分?jǐn)?shù)次氯酸鈉的混合菌液共1 mL，于25 ℃培養(yǎng)2～4 d。收集24 孔板中生物被膜并重懸于1 mL無(wú)菌去離子水中，加入0.4 mL 1 mol/L NaOH溶液，在4 ℃條件下培養(yǎng)3 h，加入0.6 mL 0.85 g/100 mL NaCl溶液，6 000×g、4 ℃下離心20 min，使用0.45 μm濾膜過(guò)濾得上清液，對(duì)濾液進(jìn)行EPS分析[26]。用苯酚-硫酸法測(cè)定胞外多糖質(zhì)量濃度，建立葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。利用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定胞外蛋白質(zhì)量濃度，建立蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，在562 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色分析。

1.3.8 激光共聚焦掃描顯微鏡觀察

按照1.3.3節(jié)中的方法在細(xì)菌培養(yǎng)皿中制備含不同體積分?jǐn)?shù)次氯酸鈉的混合菌液，于25 ℃培養(yǎng)4 d。用無(wú)菌去離子水洗滌3 次去除浮游菌，晾干。在避光條件下，對(duì)生物被膜進(jìn)行染色，避光染色30 min。試劑盒中的探針SYTO-9（激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)498 nm）與PI（激發(fā)波長(zhǎng)535 nm、發(fā)射波長(zhǎng)637 nm）能分別使活、死細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡下呈現(xiàn)綠、紅熒光。而后使用無(wú)菌去離子水洗去多余的熒光染料，避光自然干燥，使用激光共聚焦掃描顯微鏡在63×油鏡下觀察[27]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

EPS采用SAS 9.0軟件的混合模型進(jìn)行交互作用分析。采用SPSS 20.0軟件方差分析法對(duì)生物被膜定量、抑制率、清除率、代謝活性、泳動(dòng)能力進(jìn)行單因素方差分析。差異顯著水平為P＜0.05，數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用Sigma Plot 12.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 S. Derby生物被膜的形成能力

生物被膜黏附于食品加工器械表面會(huì)產(chǎn)生交叉污染，造成巨大的損失。有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在微孔表面形成生物被膜的量與其在食品加工器械表面的生物被膜形成量呈顯著正相關(guān)[28-29]，因此，本研究通過(guò)結(jié)晶紫染色法和平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定S. Derby在微孔表面生物被膜的形成情況。

圖1A、B分別為通過(guò)結(jié)晶紫染色法、平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)得的生物被膜形成能力。生物被膜形成量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增多。在1～4 d生物被膜處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，生物被膜形成量顯著增加（P＜0.05），在第4天進(jìn)入穩(wěn)定期，達(dá)到最大黏附量（8.40（lg（CFU/mL））），生物被膜達(dá)到成熟，因此以第4天作為培養(yǎng)生物被膜成熟的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 S. Derby生物被膜在培養(yǎng)7 d過(guò)程中的形成量Fig. 1 Biofilm formation capacity of Salmonella Derby during 7-day cultivation

結(jié)果顯示兩種測(cè)定方法下生物被膜的變化趨勢(shì)存在差異，這是由于生物被膜分泌的EPS易與結(jié)晶紫結(jié)合，因而結(jié)晶紫染色法主要以EPS的量來(lái)衡量被膜的生成量[30]；而平板菌落計(jì)數(shù)法是通過(guò)測(cè)定生物被膜中細(xì)菌的黏附量來(lái)衡量生物被膜的形成量。通過(guò)兩種方法從不同角度來(lái)衡量生物被膜的形成能力，但均能得到隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，S. Derby生物被膜的形成量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)的結(jié)論，這與Díez-García等[31]的研究結(jié)果一致。

2.2 次氯酸鈉對(duì)S. Derby的MIC與MBC

由圖2可以看出，當(dāng)次氯酸鈉體積分?jǐn)?shù)為0.32%、0.16%、0.08%時(shí)，孔內(nèi)的液體顏色沒(méi)有變化，仍為藍(lán)色，而體積分?jǐn)?shù)為0.04%、0.02%、0.01%、0的4 個(gè)孔內(nèi)液體明顯變紅，孔中沒(méi)有顏色變化的次氯酸鈉最小體積分?jǐn)?shù)（MIC）為0.08%。通過(guò)將孔內(nèi)菌液涂布平板計(jì)數(shù)后的結(jié)果得到次氯酸鈉對(duì)S. Derby的MBC為0.08%（平板上單菌落小于5 個(gè)）。

圖2 含不同體積分?jǐn)?shù)次氯酸鈉的S. Derby培養(yǎng)孔板Fig. 2 The culture plate of S. Derby with different concentration of sodium hypochlorite

本研究發(fā)現(xiàn)，次氯酸鈉對(duì)S. Derby的MIC為0.08%，Rodríguez-Melcón等[15]研究發(fā)現(xiàn)次氯酸鈉對(duì)于單增李斯特菌的MIC為0.32%，說(shuō)明次氯酸鈉對(duì)于不同的菌MIC不同。在工業(yè)上使用次氯酸鈉消毒時(shí)體積分?jǐn)?shù)通常為0.005%～0.020%，低于本實(shí)驗(yàn)所測(cè)的數(shù)值，這是由于本實(shí)驗(yàn)在稀釋次氯酸鈉時(shí)所用的是TSB液體培養(yǎng)基，而工業(yè)上是將次氯酸鈉在水中稀釋，TSB具有與次氯酸鈉相互作用的有機(jī)成分，但是水不具有有機(jī)成分，因此次氯酸鈉在水中的可用性更高[30]。

2.3 次氯酸鈉對(duì)S. Derby生長(zhǎng)曲線的影響

加入不同體積分?jǐn)?shù)次氯酸鈉后S. Derby在0～24 h的生長(zhǎng)曲線如圖3所示，MIC次氯酸鈉能完全抑制浮游菌的生長(zhǎng)，亞MIC（1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC）次氯酸鈉處理組與對(duì)照組的生長(zhǎng)曲線均在約4 h時(shí)從遲滯期進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，其中次氯酸鈉處理組浮游菌的增長(zhǎng)速度與對(duì)照組相比較為緩慢。說(shuō)明亞最小抑菌濃度次氯酸鈉對(duì)于浮游菌的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，反映了浮游菌對(duì)低濃度常用消毒劑的敏感性，結(jié)果為食品工業(yè)控制微生物提供了優(yōu)化策略。

圖3 不同體積分?jǐn)?shù)次氯酸鈉處理后S. Derby的生長(zhǎng)曲線Fig. 3 Growth curves of S. Derby treated with different concentrations of sodium hypochlorite

2.4 次氯酸鈉對(duì)S. Derby生物被膜的抑制和清除作用

如圖4所示，加入不同體積分?jǐn)?shù)的次氯酸鈉后，S. Derby生物被膜的形成受到抑制。在MIC、1/2 MIC下，次氯酸鈉對(duì)S. Derby生物被膜的抑制率分別達(dá)到了91.76%、90.26%，顯著高于1/4 MIC、1/8 MIC次氯酸鈉處理組（P＜0.05）；隨著次氯酸鈉體積分?jǐn)?shù)的降低，其對(duì)生物被膜的抑制效果也逐漸減弱，當(dāng)次氯酸鈉為1/8 MIC時(shí)，其對(duì)S. Derby生物被膜的抑制率降為61.45%。Bansal等[30]的研究同樣發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鼠傷寒沙門(mén)氏菌暴露于體積分?jǐn)?shù)0.03%的次氯酸鈉溶液中時(shí)，其生物被膜形成能力下降。在本研究中，MIC和亞MIC的次氯酸鈉均對(duì)S. Derby生物被膜具有很強(qiáng)的抑制作用，其中次氯酸鈉體積分?jǐn)?shù)為MIC和1/2 MIC時(shí)的抑制率并無(wú)顯著差異。浮游菌的生長(zhǎng)僅在次氯酸鈉體積分?jǐn)?shù)為MIC時(shí)受到完全抑制，1/2 MIC條件下浮游菌保持較好的生長(zhǎng)趨勢(shì)，但生物被膜形成仍被明顯抑制，可以推測(cè)次氯酸鈉并非僅靠抑制浮游菌的生長(zhǎng)來(lái)抑制生物被膜，需從細(xì)菌代謝活性、泳動(dòng)能力、胞外物質(zhì)等角度探明其抑制機(jī)制。此外，本研究旨在探究次氯酸鈉對(duì)成熟階段生物被膜的抑制效果，而生物被膜的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程。浮游細(xì)菌首先可逆地附著在接觸表面，然后不可逆地結(jié)合在一起，這就導(dǎo)致了細(xì)菌細(xì)胞在表面的群落形成。在群體感應(yīng)和其他信號(hào)分子的幫助下，生物被膜逐漸成熟并穩(wěn)定。隨后，生物被膜破裂，膜內(nèi)的微生物釋放分散到新的表面黏附定植[32]。因此，在確定抑制效果的基礎(chǔ)上，將對(duì)次氯酸鈉發(fā)揮抑制作用的具體階段展開(kāi)進(jìn)一步的研究。

圖4 不同體積分?jǐn)?shù)次氯酸鈉對(duì)S. Derby生物被膜的抑制率Fig. 4 Inhibitory rates of different concentrations of sodium hypochlorite on S. Derby biofilm

當(dāng)前對(duì)于次氯酸鈉抑制生物被膜的研究相對(duì)較少，更多的是對(duì)次氯酸鈉清除生物被膜的研究。圖5顯示了不同體積分?jǐn)?shù)次氯酸鈉對(duì)于成熟S. Derby生物被膜的清除作用。次氯酸鈉的清除效果隨著體積分?jǐn)?shù)的降低而減弱，2 MIC下清除率最高，達(dá)到了52.60%，顯著高于1/4 MIC次氯酸鈉處理組（P＜0.05），1/4 MIC下的清除效果顯著低于其他3 個(gè)體積分?jǐn)?shù)處理組（P＜0.05），清除率為22.03%。Gkana等[33]也證明了次氯酸鈉對(duì)沙門(mén)氏菌生物被膜及沙門(mén)氏菌與金黃色葡萄球菌的混合生物被膜具有顯著的清除作用（P＜0.05）。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)次氯酸鈉對(duì)于單增李斯特菌、大腸桿菌、熒光假單胞菌的生物被膜也具有清除作用，其中體積分?jǐn)?shù)0.35%的次氯酸鈉對(duì)單增李斯特菌生物被膜的清除率能達(dá)到90%以上[34]。本研究中次氯酸鈉對(duì)S. Derby生物被膜清除率較低，也反映了生物被膜對(duì)于消毒劑的抗性。導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是成熟的生物被膜具有較強(qiáng)的三維結(jié)構(gòu)，并且EPS在膜內(nèi)細(xì)菌中形成了一層保護(hù)屏障，因此更能耐受次氯酸鈉處理[35]。在后續(xù)的研究中可以考慮將次氯酸鈉與胞外物質(zhì)分解酶類或植物精油等抑菌劑相結(jié)合，協(xié)同作用于生物被膜，以達(dá)到更好的抑制或清除效果[35-36]。

圖5 不同體積分?jǐn)?shù)次氯酸鈉對(duì)S. Derby生物被膜的清除率Fig. 5 Scavenging rates of different concentrations of sodium hypochlorite on S. Derby biofilm

2.5 次氯酸鈉對(duì)S. Derby生物被膜的抑制機(jī)制

2.5.1 次氯酸鈉對(duì)S. Derby泳動(dòng)能力的影響

生物被膜的形成經(jīng)歷了初始黏附、微菌落形成、成熟和分散4 個(gè)階段。浮游細(xì)菌可逆地附著在接觸表面稱為初始黏附[32]，細(xì)菌的泳動(dòng)能力在初始黏附過(guò)程中起著重要作用。泳動(dòng)能力分為單一泳動(dòng)和群集泳動(dòng)，群集泳動(dòng)是細(xì)菌的多細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，它們以緊密結(jié)合的細(xì)胞群在固體基質(zhì)上移動(dòng)[37]。

表1顯示了添加不同體積分?jǐn)?shù)的次氯酸鈉后S. Derby單一泳動(dòng)和群集泳動(dòng)能力的變化，經(jīng)次氯酸鈉處理后S.Derby單一泳動(dòng)能力顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），由此可見(jiàn)次氯酸鈉對(duì)于S. Derby單一泳動(dòng)能力并無(wú)抑制作用，反而存在一定的促進(jìn)作用；對(duì)于S. Derby的群集泳動(dòng)，僅MIC下的群集泳動(dòng)能力顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明次氯酸鈉除體積分?jǐn)?shù)為MIC時(shí)對(duì)S. Derby群集泳動(dòng)有一定的抑制作用外，其他體積分?jǐn)?shù)下均對(duì)群集泳動(dòng)無(wú)顯著影響（P＞0.05）?？傮w來(lái)說(shuō)，次氯酸鈉對(duì)于S. Derby的泳動(dòng)能力沒(méi)有抑制作用，因而可以推斷次氯酸鈉并未通過(guò)影響S. Derby的泳動(dòng)能力來(lái)抑制其生物被膜的形成。

表1 不同體積分?jǐn)?shù)次氯酸鈉對(duì)S. Derby生物被膜泳動(dòng)能力的影響Table 1 Effects of different concentrations of sodium hypochlorite on swimming mobility of S. Derby biofilms

2.5.2 次氯酸鈉對(duì)S. Derby生物被膜內(nèi)細(xì)胞代謝活性的影響

生物被膜的形成與其中代謝活性細(xì)胞的發(fā)展有關(guān)，細(xì)胞在發(fā)育期間進(jìn)行線粒體呼吸[21]。CCK-8試劑中含有水溶性四唑鹽WST-8，WST-8在電子載體的作用下能被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲臢物，生成的甲臢物數(shù)量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量細(xì)胞液的OD405nm，便可檢測(cè)出待測(cè)細(xì)胞樣品的代謝活性[38]。

如圖6所示，次氯酸鈉對(duì)S. Derby生物被膜中細(xì)胞代謝活性具有較好的抑制效果。不同體積分?jǐn)?shù)次氯酸鈉對(duì)S. Derby生物被膜中細(xì)胞代謝活性的抑制率差異顯著（P＜0.05），隨著次氯酸鈉體積分?jǐn)?shù)的升高，抑制率顯著升高（P＜0.05）。其中1/8 MIC次氯酸鈉的抑制率為65.19%，MIC次氯酸鈉的抑制率達(dá)到93.88%。代謝活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示次氯酸鈉能明顯降低生物被膜內(nèi)細(xì)胞代謝活性，從而可以進(jìn)一步推測(cè)，抑制細(xì)胞代謝活性是次氯酸鈉抑制生物被膜的原因之一。

圖6 不同體積分?jǐn)?shù)次氯酸鈉對(duì)S. Derby生物被膜內(nèi)細(xì)胞代謝活性的抑制率Fig. 6 Inhibitory rates of different concentrations of sodium hypochlorite on biofilm metabolism of S. Derby biofilms

2.5.3 次氯酸鈉對(duì)S. Derby生物被膜胞外多糖和蛋白的影響

由表2可以看出，對(duì)照組中S. Derby生物被膜的胞外多糖質(zhì)量濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著上升（P＜0.05），次氯酸鈉處理組在相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)的S. Derby胞外多糖質(zhì)量濃度顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），由此可見(jiàn)，在培養(yǎng)2～4 d的過(guò)程中，次氯酸鈉均對(duì)S. Derby胞外多糖的產(chǎn)生有抑制作用，其中MIC時(shí)的抑制效果最好。

表2 不同體積分?jǐn)?shù)次氯酸鈉對(duì)S. Derby生物被膜胞外多糖的影響Table 2 Effects of different concentrations of sodium hypochlorite on extracellular polysaccharides of S. Derby biofilms

由表3可知，次氯酸鈉處理組與對(duì)照組的S. Derby胞外蛋白質(zhì)量濃度都隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，在相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，不同體積分?jǐn)?shù)次氯酸鈉處理組的S. Derby胞外蛋白質(zhì)量濃度均與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05），由此可知，次氯酸鈉不能抑制S. Derby胞外蛋白的產(chǎn)生。

表3 不同體積分?jǐn)?shù)次氯酸鈉對(duì)S. Derby生物被膜胞外蛋白的影響Table 3 Effects of different concentrations of sodium hypochlorite on extracellular proteins of S. Derby biofilms

EPS是生物被膜的重要組成部分，胞外多糖、胞外蛋白等共同組成生物被膜的三維立體結(jié)構(gòu)[39]。在本研究中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，生物被膜內(nèi)的胞外多糖和蛋白的質(zhì)量濃度也相應(yīng)增加，這與利用結(jié)晶紫染色法對(duì)生物被膜定量的結(jié)果相一致。纖維素、脂多糖等多糖成分可以支持細(xì)胞間的相互作用，介導(dǎo)生物被膜的三維結(jié)構(gòu)生成，在培養(yǎng)基中添加不同體積分?jǐn)?shù)的次氯酸鈉后，生物被膜中的胞外多糖質(zhì)量濃度顯著降低（P＜0.05），這表明次氯酸鈉主要通過(guò)抑制胞外多糖的生成來(lái)抑制生物被膜形成三維結(jié)構(gòu)。卷曲菌毛、鞭毛等蛋白成分是細(xì)菌泳動(dòng)和黏附的主要組件[40]，加入次氯酸鈉后生物被膜中胞外蛋白的質(zhì)量濃度沒(méi)有顯著變化（P＞0.05），也印證了次氯酸鈉對(duì)于細(xì)菌的泳動(dòng)能力沒(méi)有影響。纖維素由bcsABZC-bcsEFG基因編碼[41]，卷曲菌毛由csgA、csgD等基因編碼[42]，次氯酸鈉對(duì)胞外多糖和胞外蛋白的抑制情況不同，可能是由于其對(duì)于編碼胞外多糖和胞外蛋白的基因表達(dá)產(chǎn)生了不同的影響。此外，沙門(mén)氏菌生物被膜還受菌體內(nèi)在的諸多基因和群體感應(yīng)的調(diào)控[32]，需要進(jìn)一步從基因表達(dá)和群體感應(yīng)調(diào)控的角度研究次氯酸鈉抑制沙門(mén)氏菌生物被膜形成的機(jī)制，目前相關(guān)研究正在開(kāi)展進(jìn)行中。

2.5.4 激光共聚焦掃描顯微鏡觀察S. Derby生物被膜結(jié)果

圖7 S. Derby生物被膜的激光共聚焦掃描顯微鏡圖Fig. 7 CLSM images of S. Derby biofilms

通過(guò)激光共聚焦掃描顯微鏡三維光學(xué)成像，對(duì)不同體積分?jǐn)?shù)次氯酸鈉處理下S. Derby生物被膜進(jìn)行了分析和比較。圖7是對(duì)照組與次氯酸鈉處理組S. Derby生物被膜的激光共聚焦顯微圖像，圖中綠色代表活菌，紅色代表死菌，立體圖可以展現(xiàn)生物被膜的厚度。對(duì)照組的顯微圖像顯示生物被膜中的細(xì)菌呈現(xiàn)團(tuán)狀聚集，活菌數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于死菌，生物被膜厚度較高。在次氯酸鈉處理組中，MIC下細(xì)菌量較少，且均為死菌，隨著處理的次氯酸鈉體積分?jǐn)?shù)降低，活菌數(shù)量增加，死菌數(shù)量減少，細(xì)菌逐漸聚集，生物被膜厚度也增加，但仍遠(yuǎn)小于對(duì)照組。與前面次氯酸鈉抑制沙門(mén)氏菌生物被膜的形成（圖4）的結(jié)果相一致。顯微鏡觀察結(jié)果顯示出沙門(mén)氏菌有較強(qiáng)的成膜能力，這一結(jié)果與Sadekuzzaman等[43]報(bào)道的結(jié)果一致。本研究也表明S. Derby生物被膜對(duì)目前工業(yè)中常規(guī)使用體積分?jǐn)?shù)（0.01%、0.02%）的次氯酸鈉具有一定的耐受性。這可能是沙門(mén)氏菌在食品接觸面定植和引起交叉污染的原因，需要進(jìn)一步尋找對(duì)沙門(mén)氏菌生物被膜具有更有效抑制和清除作用的措施。

3 結(jié) 論

沙門(mén)氏菌污染對(duì)于食品工業(yè)是一個(gè)重大的安全隱患，探究不同體積分?jǐn)?shù)和類型的食品級(jí)消毒劑對(duì)該細(xì)菌的影響對(duì)優(yōu)化控制食品加工環(huán)境中安全問(wèn)題尤為重要。本研究表明，次氯酸鈉對(duì)S. Derby的MIC為0.08%，在該體積分?jǐn)?shù)下S. Derby的生長(zhǎng)完全受到抑制，對(duì)生物被膜的抑制率達(dá)到91.76%；亞MIC（0.04%、0.02%、0.01%）次氯酸鈉對(duì)S. Derby生物被膜也具有明顯的抑制作用。不同體積分?jǐn)?shù)的次氯酸鈉均能降低S. Derby生物被膜內(nèi)細(xì)胞的代謝活性，減少胞外多糖的生成，激光共聚焦掃描顯微鏡結(jié)果也進(jìn)一步印證了次氯酸鈉處理減少了生物被膜的生成量及活菌數(shù)。因此，本實(shí)驗(yàn)所探索的次氯酸鈉抑制S. Derby生物被膜的形成機(jī)制主要有：延緩浮游菌的生長(zhǎng)、降低生物被膜內(nèi)細(xì)胞代謝活性、減少生物被膜胞外多糖的合成及生物被膜內(nèi)菌體的數(shù)量。