呂曉發(fā)，溫炳欽，陳靖湄，翟登輝，蔡金艷

[廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑實驗室（三級）/廣東省教育廳現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實驗室，廣東廣州 510006]

蔓荊子為馬鞭草科植物單葉蔓荊Vitex trifoliaLinn.var.simplicifoliaCham.或蔓荊V.trifoliaL.的干燥成熟果實，為臨床常用中藥，具有疏風(fēng)散熱、清利頭目的功效。研究表明，蔓荊子含有多種類別活性成分[1?7]。

本課題組前期從西南齒唇蘭Anoectochilus elwesii分離鑒定出活性成分過氧麥角甾醇[8]，有降血糖[9]、抗氧化[10]、抑菌[11]、抗腫瘤[12]、抗炎[13]及抑制響尾蛇毒液磷脂酶A2[14]等廣泛的生物活性。但該成分在自然界分布的植物品種少，在A.elwesii中含量低微，結(jié)構(gòu)具有類似明星藥物青蒿素活性過氧橋的獨(dú)特官能團(tuán)，很難合成獲得。本課題組利用過氧鍵性質(zhì)引入DPPH自由基清除活性顯色劑，建立了一種實用的柱層析分離和改良生物自顯影技術(shù)追蹤過氧麥角甾醇，提高了專屬性和穩(wěn)定性，結(jié)合UH?PLC/Q?TOF?MSn確證結(jié)構(gòu)且無需標(biāo)準(zhǔn)品（已申請專利202010064258.3）。為快速檢識和制備天然單體，進(jìn)行擴(kuò)大藥源和分離富集的探索，發(fā)現(xiàn)蔓荊子的三氯甲烷部位含有過氧麥角甾醇，有研究發(fā)現(xiàn)過氧鍵是青蒿素類抗瘧疾藥物的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[15]。因此，本文對蔓荊子三氯甲烷部位進(jìn)行成分研究，并將過氧麥角甾醇作為目標(biāo)成分進(jìn)行重點(diǎn)分離和降血糖活性測試，旨為蔓荊子降血糖活性化合物過氧麥角甾醇的應(yīng)用研究與開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料及試劑

蔓荊子購于廣州清平藥材批發(fā)市場，由廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院李書淵老師鑒定為馬鞭草科牡荊屬植物單葉蔓荊V.trifolia的果實，植物標(biāo)本保存于廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院（MJ2016）。

柱色譜用硅膠（200～300目）及TLC硅膠GF254（青島海洋化工廠）；Sephadex LH?20為原裝GE Healthcare產(chǎn)品；實驗所用分離試劑均為分析純。結(jié)晶牛胰島素（美國Sigma公司）；3?（4,5二甲基噻唑2）?2,5?二苯基四氮唑溴鹽（MTT，美國Sigma公司）；含酚紅的DMEM高糖培養(yǎng)基（葡萄糖含量為25 mmol/L，美國HyClone公司）；胎牛血清（美國HyClone公司）；磷酸緩沖鹽溶液（1×，美國HyClone公司）；雙抗（青霉素?鏈霉素混合液，美國HyClone公司）；0.25%胰蛋白酶（美國Gibco公司）；葡萄糖測定試劑盒（深圳中深百控生物科技有限公司）；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國NEST公司）。

1.2 儀器

X?5數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)測定儀（溫度計未校正）；PerkinElmer Spectrum?100紅外光譜儀；Bruker AV?500核磁共振儀（TMS為內(nèi)標(biāo)）；ZF?20C暗箱式紫外分析儀（上海寶山顧村電光儀器廠）；BioRAD model 680酶標(biāo)儀（美國BIO?RAD公司）；Thermo model 3111二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；超凈臺（蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司）；Thermo CR.3i離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Leica DFC420倒置顯微鏡（德國Leica公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 化學(xué)成分研究

2.1.1 提取與分離 將采購的單葉蔓荊子自然晾曬得到藥材干重2.5 kg，粉碎，置于5 L圓底燒瓶中，用10倍量的95%乙醇超聲提取40 min，在70℃下水浴回流提取3 h，反復(fù)提取3次，將依次過濾得到的提取液在45℃減壓濃縮得到總浸膏171.25 g。將浸膏混懸于適量的水中，分別用石油醚、三氯甲烷以及乙酸乙酯多次萃取，各萃取部位濃縮成浸膏，得到石油醚部位31.25 g、三氯甲烷部位27.57 g、乙酸乙酯部位23.34 g。將三氯甲烷部位浸膏以樣品量:硅膠量=1∶1.5比例拌樣制成硅膠干粉，以樣品量與硅膠量1∶30裝填硅膠層析柱，每500 mL作為1個流份，分別通過石油醚?乙酸乙酯=50∶1~1∶10（體積比，下同）與乙酸乙酯?甲醇=50∶1~1∶10（體積比，下同）作為洗脫液梯度洗脫，共得到231個流份，TLC監(jiān)測將相似流份合并。石油醚?乙酸乙酯=20∶1洗脫時得到流份17~23，通過TLC監(jiān)測進(jìn)行合并，將17~23經(jīng)過凝膠柱層析，洗脫液比例為甲醇?三氯甲烷=1∶1，將得到的第4流份選擇合適溶劑放置析晶得到化合物1（50 mg）。在石油醚?乙酸乙酯=15∶1洗脫時得到流份34~45以及流份57。將流份34~45合并，經(jīng)甲醇?三氯甲烷=1∶1凝膠柱層析，得到15流份，將其中流份2~3再次通過甲醇?三氯甲烷=1∶1凝膠柱層析并重結(jié)晶后得到化合物2（20 mg）。將流份57經(jīng)硅膠柱層析，層析液為石油醚?乙酸乙酯=1∶1，將得到的流份經(jīng)過甲醇?三氯甲烷=1∶1過凝膠柱進(jìn)一步純化得到化合物3（20.3 mg）。在石油醚?乙酸乙酯=5∶1時得到流份125~130，通過反復(fù)硅膠柱層析、SephadexLH?20柱層析以及重結(jié)晶得到化合物4（14.0 mg）、5（30.6 mg）、6（15.3 mg）、7（10.4 mg）。

2.1.2 結(jié)構(gòu)鑒定 化合物1：無色針晶（CHCl3），mp.138~140℃，1H NMR（CDCl3，500 MHz）δ：5.36（1H，d，J=5.2 Hz）為烯鍵上氫的信號峰，3.52（1H，td，J=11.7，5.9 Hz）為羥基碳上氫的信號峰，從1.01（3H，s），0.92（3H，d，J=6.5 Hz），0.85（3H，d，J=1.7 Hz），0.83（3H，d，J=4.2 Hz），0.79（3H，m），0.69（3H，d，J=9.1 Hz）可知化合物存在6個甲基。13C NMR（CD?Cl3，125 MHz）δ：37.4（C?1），31.8（C?2），72.2（C?3），42.5（C?4），141.1（C?5），121.9（C?6），32.1（C?7），35.8（C?8），50.3（C?9），36.7（C?10），21.2（C?11），39.9（C?12），42.4（C?13），56.9（C?14），24.5（C?15），28.4（C?16），56.2（C?17），19.2（C?18），12.0（C?19），36.3（C?20），19.5（C?21），34.1（C?22），26.2（C?23），46.0（C?24），29.3（C?25），20.0（C?26），18.9（C?27），23.2（C?28），12.1（C?29）。從化學(xué)位移121.9以及141.1可以得知該化合物存在雙鍵結(jié)構(gòu)，而72.20為羥基所連碳對應(yīng)的化學(xué)位移值。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報道基本一致，故確定化合物1為β?谷甾醇（β?sitosterol）。

化合物2：黃色晶體（CH3OH），1H NMR（CDCl3，500 MHz）δ：3.88（3H，s），3.93（3H，s），3.97（3H，s），4.00（3H，s）為甲氧基氫質(zhì)子，5.79（1H，s），6.51（1H，s），7.69（1H，d，J=2.2 Hz），7.73（1H，dd，J=8.6，2.2 Hz）均為苯環(huán)上的氫質(zhì)子所對應(yīng)的化學(xué)位移值。12.61（1H，s）為黃酮母核5位所連羥基上的氫信號，其氫譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報道基本一致，故確定化合物2為5?羥基?3，7，3'，4'?四甲氧基黃酮（5?hydroxy?3，7，3'，4'?tetramethoxy flavone)。

化合物3：無色晶體（CHCl3），1H NMR（CDCl3，500 MHz）δ：1.6（32H，s）可知該化合物由16個亞甲基組成，0.92（6H，m）可知該化合物存在2個化學(xué)環(huán)境相同的甲基，1.25（3H，s），1.42（1H，s），故化合物3為10?甲基二十烷（10?methyl eicosane）。

化合物4：白色針晶（CH3OH），1H NMR（CDCl3，500 MHz）δ：3.04（3H，s）為苯環(huán)上甲氧基氫質(zhì)子化學(xué)位移，6.85（1H，m），7.57（2H，td，J=4.4，1.9 Hz）為苯環(huán)氫質(zhì)子化學(xué)位移，其氫譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報道基本一致，故確定化合物4為香草酸（vanillic acid）。

化合物5：白色針晶（CH3OH），mp.215~217℃，1H NMR（CD3OD，500 MHz）δ：6.84（2H，J=8.5 Hz，d），7.90（2H，J=8.5 Hz，d）為苯環(huán)氫質(zhì)子，其氫譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報道一致，故確定化合物5為對羥基苯甲酸（p?hydroxybenzoic acid）。

化合物6：白色針晶（CH3OH），1H NMR（CDCl3，500 MHz）δ：7.45（2H，dt，J=8.1，2.0 Hz），6.82（1H，m）均為苯環(huán)上的氫質(zhì)子化學(xué)位移，其氫譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報道基本一致，故確定該化合物6為原兒茶酸（protocatechuic acid）。

化合物7：無色針晶（CH3COOC2H5），ESI?MSm/z：429.332 95[M+H]+，879.640 47[2M+Na]+；mp.181~183℃；IR（KBr）δmax（cm?1）：3 417（-OH），1 640（C=O），1 457、1 383（-CH3）；1H NMR（CDCl3，500 MHz）δ：0.81（3H，d，J=2.3 Hz），0.83（3H，s），0.84（3H，d，J=2.1 Hz），0.88（3H，s），0.91（3H，dd，J=6.8，3.5 Hz），1.0（3H，d，J=6.6 Hz）可知該化合物含有6個甲基，3.98（1H，m）是羥基所連碳上氫質(zhì)子的化學(xué)位移，5.14（1H，dd，J=15.3，8.3 Hz），5.22（1H，dd，J=15.3，7.5 Hz）為反式雙鍵兩側(cè)碳上的2個氫質(zhì)子化學(xué)位移，6.24（1H，d，J=8.5 Hz），6.50（1H，d，J=8.5 Hz）為順式雙鍵兩側(cè)碳上的2個氫質(zhì)子化學(xué)位移；在13C NMR（CDCl3，125 MHz）中顯示該化合物含有28個碳原子，δ135.41、130.75為雙鍵上2個碳原子的化學(xué)位移，δ135.20、132.31為化合物另一個雙鍵結(jié)構(gòu)上2個碳原子的化學(xué)位移，δ82.17、79.44為氧原子所連季碳上的化學(xué)位移值，此為過氧鍵的信號峰，δ66.48顯示該化合物含有羥基，13CNMR還顯示出該化合物含有多個甲基、亞甲基以及次甲基，δ56.19（C?17），51.68（C?14），51.08（C?9），44.56（C?13），42.77（C?24），39.74（C?20），39.34（C?12），36.96（C?10），36.91（C?4），34.69（C?1），33.07（C?25），30.10（C?2），28.65（C?16），23.40（C?11），20.88（C?21），20.63（C?15），19.95（C?27），19.64（C?26），18.18（C?19），17.56（C?28），12.87（C?18）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報道基本一致，故確定該化合物7為3β?羥基?5α，8α?過氧化麥角甾?6，22?二烯（3β?hy?droxy?5α，8α?ergosteroid?6，22?diene（peroxy ergos?terol））。

2.2 降血糖活性測試及分子對接活性篩選

2.2.1 HepG2肝癌細(xì)胞建立胰島素抵抗模型及葡萄糖消耗量測定 選取位于對數(shù)生長期且生長情況良好的HepG2肝癌細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用胰蛋白酶消化使細(xì)胞脫壁后，用含有血清的培養(yǎng)液終止消化，PBS溶液清洗2~3次，接種于96孔板，要求細(xì)胞數(shù)量為3×103/孔，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80%。棄去培養(yǎng)液，加入含1%FBS培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中饑餓培養(yǎng)12 h。每孔加入100μL濃度為1×10?7μmol/L的胰島素溶液后重新放置于培養(yǎng)箱中孵育24 h使細(xì)胞出現(xiàn)胰島素抵抗。

設(shè)置空白組、標(biāo)準(zhǔn)液組、模型組、陽性組以及給藥組：空白組加等量蒸餾水；標(biāo)準(zhǔn)液組為試劑盒上的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液；模型組為造模后的細(xì)胞加培養(yǎng)液（含1×10?7μmol/L的胰島素溶液），不給藥，加入等量的培養(yǎng)液量；陽性組為造模后的細(xì)胞加培養(yǎng)液（含1×10?7μmol/L的胰島素溶液），再加入目標(biāo)濃度的二甲雙胍；給藥組為造模后的細(xì)胞加培養(yǎng)液（含1×10?7μmol/L的胰島素溶液）再加入目標(biāo)濃度的過氧麥角甾醇。給藥濃度分別為3.125、6.25、12.5、25、50、100μmol/L，給藥后放置培養(yǎng)箱中孵育12 h，離心取上清液。用葡萄糖試劑盒測定上清液所殘留的葡萄糖含量[葡萄糖消耗量（μmol/L）=25?（A樣品?A空白）/（A標(biāo)準(zhǔn)?A空白）×5.55]，結(jié)果見表1。

表1 不同濃度過氧麥角甾醇的降血糖活性測定結(jié)果Table 1 Hypoglycemic activity of different concentrations of peroxy ergosterol(n=3)

可見，陽性藥二甲雙胍具有良好的降糖效果，給藥濃度分別為3.125、6.25、12.5、25、50、100μmol/L時，葡萄糖消耗量為（6.08±0.59）、（8.83±1.04）、（9.64±0.63）、（10.21±0.86）、（10.36±0.37）、（10.39±0.50）mmol/L；當(dāng)劑量為100μmol/L時，二甲雙胍組細(xì)胞對葡萄糖最大的攝取能力是模型組細(xì)胞的1.38倍。而不同濃度給藥組的細(xì)胞對葡萄糖的消耗量分別為（7.30±0.45）、（7.54±0.51）、（7.27±1.17）、（6.70±0.99）、（8.46±0.56）、（9.02±0.38）mmol/L；100μmol/L劑量組細(xì)胞對葡萄糖攝取能力最大，是模型組細(xì)胞的1.20倍，說明活性化合物3β?羥基?5α，8α?過氧化麥角甾?6，22?二烯具有較好的促進(jìn)胰島素抵抗模型細(xì)胞攝取培養(yǎng)液中葡萄糖的能力。

從MTT實驗結(jié)果中得出過氧麥角甾醇對于HepG2肝癌細(xì)胞毒性較弱，IC50>100μmol/L。

2.2.2 與降血糖活性靶點(diǎn)分子對接 從PDB蛋白數(shù)據(jù)庫中選取14種胰島素抵抗相關(guān)靶點(diǎn)的X線晶體結(jié)構(gòu)用于分子對接研究：白細(xì)胞介素?6（IL?6）、特異性磷酸酶活性的抑癌基因（PTEN）、糖原合成酶3（GSK3）、腫瘤壞死因子?α（TNF?α）、過氧化物酶體增值物激活受體（PPARγ）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、蛋白酪氨酸磷酸酶?1B（PTP?1B）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（GLUT4）、蛋白激酶B（Akt/PKB）、C?Jun氨基末端激酶（JNK）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、有絲分裂原激活蛋白激酶（MAPK）、蛋白激酶A（PKA）以及11β?羥基類固醇脫氫酶1型（11β?HSD1）。3β?羥基?5α，8α?過氧化麥角甾?6，22?二烯作為配體分別與上述14種靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對接，初步探討能否作用于這些靶點(diǎn)從而改善胰島素抵抗。

在分子對接運(yùn)算前清除X線晶體復(fù)合物的水分子、離子以及配體結(jié)構(gòu)后為其蛋白結(jié)構(gòu)添加極性氫與電荷。采用Autodock軟件模塊進(jìn)行小分子的構(gòu)建與能量的優(yōu)化，能量優(yōu)化過程中賦予分子力場以及電荷，得到分子的最低能量構(gòu)象即為對接配體的起始構(gòu)象。Autodock分子對接運(yùn)算采用結(jié)合自由能（ΔG）打分函數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 Autodock軟件對接結(jié)果Table 2 Docking results with Autodock

可見，3β?羥基?5α，8α?過氧化麥角甾?6，22?二烯與上述14種靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合自由能均為負(fù)值。根據(jù)吉布斯自由能原理，其與各靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合屬于可自發(fā)進(jìn)行的反應(yīng)，故理論上這14種靶點(diǎn)蛋白均可能為過氧麥角甾醇治療2型糖尿病的潛在靶點(diǎn)。結(jié)合自由能打分函數(shù)所得數(shù)值的大小排序依次為：iNOS>GLUT4>11β?HSD1>PKA>MAPK>PPARγ>AMPK>Akt/PKB>JNK>PTP?1B>GSK3>TNF?α>PTEN>IL?6，可知與iNOS和GLUT4結(jié)合能力較強(qiáng)，可能通過抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶從而減少NO的產(chǎn)生，使得胰島細(xì)胞凋亡顯著減少；也可與GLUT4結(jié)合，促進(jìn)骨骼肌和脂肪細(xì)胞葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取。進(jìn)一步計算機(jī)模擬，表明其結(jié)構(gòu)中的過氧橋及羥基可與靶點(diǎn)蛋白的氨基酸結(jié)合形成氫鍵，這2個基團(tuán)可能是過氧麥角甾醇的活性中心。

3 結(jié)論

本文從蔓荊子三氯甲烷部位浸膏中分離純化并鑒定出7個化合物單體，化合物2、3為首次從該植物中分離得到。并對重點(diǎn)化合物7進(jìn)行了體外降血糖活性測試及分子對接研究，表明3?羥基?5,8?過氧化麥角甾?6,22?二烯具有較好的降血糖活性，與胰島素抵抗靶點(diǎn)iNOS和GLUT4結(jié)合能力較強(qiáng)，揭示了潛在的靶點(diǎn)結(jié)合活性。本研究豐富了蔓荊子的化學(xué)成分及藥理活性研究，還為其降血糖活性化合物的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供了科學(xué)基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。