花 敏，張 笛，姜艾伶，熊慧欣

(揚州大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 江蘇 揚州 225127)

嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillusferrooxidans， 簡稱A.ferrooxidans)是一種典型的化能自養(yǎng)菌，主要通過氧化Fe2+、單質(zhì)S及還原態(tài)硫化物來獲取生命活動所需能量(Xiongetal., 2008)。在富含A.ferrooxidans的酸性礦山廢水等自然環(huán)境中普遍存在的生物成因鐵的氫氧化合物等礦物可以降解環(huán)境介質(zhì)中的重金屬等污染物(Bighametal., 1994)。如施氏礦Fe8O8(OH)6SO4和黃鉀鐵礬KFe3(SO4)2(OH)6等生物誘導(dǎo)而形成的鐵沉淀礦物可以清除酸性礦山廢水環(huán)境中的銅、鉻等重金屬(Songetal., 2015； Lietal., 2016)。故A.ferrooxidans等鐵細(xì)菌作用下生物成因鐵礦物的形成及其相互作用日益被人們所重視(Xiongetal., 2008； 徐軼群等， 2013)，并具有良好的環(huán)境應(yīng)用前景(Burtonetal., 2012； Zhuetal., 2013)。

眾所周知，土壤中普遍存在植物根系分泌物和微生物分解的腐殖質(zhì)，腐殖質(zhì)的分泌過程中常伴隨著溶解性低分子量有機(jī)酸(最常見的有檸檬酸、草酸、酒石酸和蘋果酸)的生成，這些低分子量有機(jī)酸的濃度一般不高，為微摩爾至毫摩爾數(shù)量級(王永壯等， 2018)。低分子量有機(jī)酸可以通過配位絡(luò)合的方式參與土壤重金屬遷移轉(zhuǎn)化以提高重金屬的生物有效性(Sullivanetal., 2012)。如Chiang等(2011)利用檸檬酸、草酸、酒石酸、乙酸等低分子量有機(jī)酸處理放射性物質(zhì)137Cs污染土壤時發(fā)現(xiàn)，有機(jī)酸釋放的H+和酸根離子易與土壤礦物表面發(fā)生反應(yīng)；有機(jī)配體在酸性環(huán)境條件下與土壤礦物相互作用可形成相關(guān)復(fù)合物，從而緩慢釋放土壤中的137Cs。同時，低分子量有機(jī)酸可被土壤膠體和礦物質(zhì)吸附，有機(jī)酸離子的存在可使土壤ζ電位降低，從而導(dǎo)致土壤組分的表面性質(zhì)發(fā)生變化(Xuetal., 2004； Gaoetal., 2010)?？梢娺@些低分子量有機(jī)酸與土壤礦物間的相互作用，對土壤重金屬的凈化和治理有著非常重要的意義。低分子量有機(jī)酸常與鐵的氧化物共存(Wangetal., 2007； Moradietal., 2012)，如二元羧酸草酸容易與礦物表面Fe(Ⅲ)結(jié)合形成 Fe(Ⅲ)-草酸鹽絡(luò)合物吸附在黃鉀鐵礬表面，形成穩(wěn)定絡(luò)合物(Wangetal., 2017)。低分子量有機(jī)酸不僅對鐵的地球生物循環(huán)有較大影響，而且對環(huán)境中重金屬的遷移轉(zhuǎn)化起著極為重要的作用(Xieetal., 2017)。草酸鹽會影響含As(V)黃鉀鐵礬的穩(wěn)定性和共沉淀As(V)的遷移，如草酸鹽于pH=2.5條件下結(jié)合礦物表面的Fe(Ⅲ)形成絡(luò)合物，從而促進(jìn)含As(Ⅴ)黃鉀鐵礬的溶解(唐苑君等， 2020)；有研究證實在草酸鹽存在下，反應(yīng)溶液pH=3.0時會促進(jìn)As(V)從礦物相遷移至溶液相(Renetal., 2018)。此外Li等(2014)研究亦發(fā)現(xiàn)，pH=1.6～2.2時，添加檸檬酸可減少表觀基質(zhì)飽和常數(shù)，從而降低鐵離子的競爭性，減少產(chǎn)物的抑制作用。

環(huán)境介質(zhì)中的重金屬和鐵礦物間的相互作用，常與鐵細(xì)菌的生物礦化作用密不可分(黨政等， 2018)。低分子量有機(jī)酸的存在會影響鐵細(xì)菌的代謝和生物礦化(Tuetal., 2019)，如低分子量有機(jī)酸的濃度過高會抑制A.ferrooxidans的活性及其Fe2+氧化和溶液(初始pH=2.0～3.0)的酸化程度，從而導(dǎo)致生物酸化速度減慢和重金屬去除效率降低(宋永偉等， 2016)?；诘头肿恿坑袡C(jī)酸在鐵細(xì)菌的代謝過程和生物礦化環(huán)境意義中的重要作用與影響，本文主要探討了低分子有機(jī)酸鈉鹽對A.ferrooxidans培養(yǎng)液體中鐵礦物產(chǎn)物形成的影響，并對主要鐵礦物產(chǎn)物進(jìn)行表征與觀察。其獲得結(jié)果可為A.ferrooxidans存在的相關(guān)污染環(huán)境和工程環(huán)境介質(zhì)中鐵礦物的形成及其物相轉(zhuǎn)化機(jī)理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 鐵細(xì)菌和培養(yǎng)介質(zhì)

實驗用鐵細(xì)菌為A.ferrooxidansHX3(其基因數(shù)據(jù)庫登入號為HQ009292)。細(xì)菌培養(yǎng)介質(zhì)為改進(jìn)型9 K培養(yǎng)液，即由(NH4)2SO43.5 g、K2HPO40.058 g、KCl 0.116 g、MgSO4·7 H2O 0.58 g和Ca(NO3)2·4 H2O 0.016 8 g 溶解于1 L去離子水中配置而成，并用1∶1 的H2SO4調(diào)節(jié)pH值為3.0±0.2，于121℃下濕熱滅菌15 min，待用；鐵細(xì)菌所需能量由FeSO4·7 H2O 44.2 g鐵鹽提供。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)過程中鐵礦物的形成實驗

3組鐵礦物形成實驗a、b和c， 分別于500 mL錐形瓶中加入300 mL改進(jìn)型9 K培養(yǎng)液，外源加入系列摩爾濃度(表1)的低分子有機(jī)酸鈉鹽草酸鈉(sodium oxalate： 簡寫為SO，Na2C2O4)、檸檬酸鈉(sodium citrate： 簡寫為SC， C6H5Na3O7·2 H2O)和蘋果酸鈉(sodium malate： 簡寫為SM， C4H4Na2O5)； 然后接種5%的A.ferrooxidansHX3菌液，用1∶1的H2SO4調(diào)節(jié)初始pH值至2.8±0.1，置于28℃ 和180 r/min轉(zhuǎn)速的搖床中振動。另外，一致反應(yīng)條件下，設(shè)置對照處理(即未加低分子有機(jī)酸鈉鹽的A.ferrooxidansHX3培養(yǎng)液，簡稱CK)，其初始pH值約為2.8。上述處理均設(shè)置3個平行樣。

表 1 低分子有機(jī)酸鈉鹽的濃度及形成的鐵沉淀物Table 1 Concentrations of low molecular organic sodium salts and the formed iron precipitates

0～168 h反應(yīng)期間，每隔12 h拍照記錄A.ferrooxidans培養(yǎng)液的顏色和濁度變化情況；測試溶液pH值(采用pHS-3C型數(shù)字pH計測定)； 取2 mL溶液在10 000 r/min離心去沉淀后的上清液酸化后于4℃保存，待測Fe2+濃度(采用鄰菲羅啉比色法測定； APHA)。每次取樣前，用稱重法補(bǔ)充因蒸發(fā)等損失的水分。另將分別培養(yǎng)至2、4 和7 d的含A.ferrooxidans菌液中形成的鐵沉淀物離心取出，并用去離子水反復(fù)洗滌以去雜質(zhì)離子，40℃烘干后保存于干燥器皿，待表征分析。

1.3 礦物樣品的表征測試方法

晶型在揚州大學(xué)測試中心由德國Bruker公司的D8 Advance型多晶X-ray衍射儀測定(工作條件為CuKα線、40 kV、200 mA，掃描速度4°/min，掃描范圍10°～80°)；對照J(rèn)CPDS卡片確定測試樣品衍射特征峰對應(yīng)d值。在揚州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院采用德國Bruker公司的Tensor 27傅立葉變換紅外光譜儀測定顆粒的表面結(jié)構(gòu)組成及鍵合情況；該儀器配有一個帶有KBr分光鏡的DTGS檢波器，測試背景值400 mg KBr，分辨率為4 cm-1。形貌結(jié)構(gòu)與能譜元素分析在揚州大學(xué)測試中心由日本日立公司Hitachi S-4800和Zeiss Supra55場發(fā)射掃描電子顯微鏡測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)過程中溶液顏色變化

A.ferrooxidans培養(yǎng)過程中溶液的顏色隨時間的變化如圖1所示。未加低分子有機(jī)酸鈉鹽對照處理(CK)和含有草酸鈉(a組)的所有處理SO4～SO40的溶液顏色在初始48 h內(nèi)由淡黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t棕色，并伴隨有鐵沉淀物形成。含有檸檬酸鈉(b組)的SC40處理中未觀察到有鐵沉淀形成，溶液顏色在初始36 h內(nèi)由黃綠色轉(zhuǎn)變成黃棕色，而后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樽丶t色；其余處理SC4～SC20在初始48 h內(nèi)溶液顏色由黃綠色轉(zhuǎn)變成橘色或紅棕色，且伴隨有鐵沉淀物形成。含有蘋果酸鈉(c組)的SM20處理中無沉淀形成；其余處理SM4～SM10在初始24 h內(nèi)溶液的顏色由深黃色轉(zhuǎn)變成紅棕色，且伴隨有鐵沉淀物形成。

2.2 溶液pH值及Fe2+濃度的變化

細(xì)菌培養(yǎng)處理的溶液pH值和Fe2+溶度變化情況見圖2。溶液pH值隨著培養(yǎng)時間的延遲整體呈下降趨勢，于132 h后均趨于平穩(wěn)(圖2)；其中含有草酸鈉鹽處理中溶液pH值(除SO40于120 h后)均于60 h后由初始值2.8下降至平穩(wěn)值1.8～2.1范圍內(nèi)；含有檸檬酸鈉和蘋果酸鈉處理(除SM20外)與對照處理(CK)變化一致，于初始60 h內(nèi)快速下降，然后波動緩慢下降至平穩(wěn)值1.6～1.9范圍內(nèi)(SM20處理的溶液pH值為2.2)。

圖 1 含不同濃度低分子有機(jī)酸鈉鹽的細(xì)菌培養(yǎng)液顏色隨時間的變化Fig. 1 Color changes of bacterial cultures containing the low molecular organic acid salts at their different concentrations with time

培養(yǎng)液pH值下降主要是由于Fe2+被生物催化氧化成的Fe3+水解形成鐵沉淀過程中伴隨有H+釋放至溶液中(Xiong and Guo， 2011； 宋永偉等， 2018)。pH值波動趨于平穩(wěn)過程中略有上升可能是因為在鐵礦物沉淀動態(tài)形成過程中礦物沉淀的溶解速度比其生成速度快，導(dǎo)致反應(yīng)溶液中OH-略升高；亦可能是隨著反應(yīng)時間的延續(xù)，形成的礦物逐漸穩(wěn)定，吸附在礦物表面不穩(wěn)定的Fe3+水合物逐步解吸并釋放到液相，使Fe3+和OH-略升高(梁劍茹等， 2011)。所加外源低分子有機(jī)酸鈉鹽種類不同，溶液pH值變化呈現(xiàn)一定差異，這可能與不同結(jié)構(gòu)酸根離子對鐵細(xì)菌活性的影響和鐵礦物沉淀形成的存在差異有關(guān)(Renetal., 2009； 宋永偉等， 2016)。

溶液中Fe2+濃度隨著細(xì)菌培養(yǎng)時間的延遲變化趨勢如圖2所示。對照處理(CK)和含低濃度有機(jī)酸鈉鹽處理在48 h內(nèi)Fe2+均被完全氧化成Fe3+。而含高濃度低分子有機(jī)酸鈉鹽SO40處理中Fe2+完全被生物催化氧化所需時間延遲了72 h； 含SC40和SM20的處理中7 d后溶液中Fe2+氧化率仍低于30%。顯然，高濃度低分子有機(jī)酸鈉鹽對細(xì)菌氧化Fe2+的能力有明顯的抑制。3種低分子有機(jī)酸鈉鹽對細(xì)菌氧化Fe2+能力的抑制影響從大到小的順序為：蘋果酸鈉>檸檬酸鈉>草酸鈉。

2.3 鐵沉淀產(chǎn)物的表征與分析

2.3.1 EDS元素分析與XRD、FTIR圖譜

圖 2 溶液 pH值和 Fe2+濃度隨細(xì)菌培養(yǎng)時間的變化Fig. 2 Changes of solution pH values and Fe2+ concentrations with bacterial cultivation time

依據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)溶液中的Fe2+氧化情況，分別對培養(yǎng)至2、4和7 d后形成的鐵沉淀產(chǎn)物進(jìn)行了表征和分析。低分子有機(jī)酸鈉鹽的加入使細(xì)菌培養(yǎng)液中外源引進(jìn)了大量的Na+。故進(jìn)一步檢測了部分處理SO10、SC20和SM10中細(xì)菌培養(yǎng)至4 d時的鐵沉淀產(chǎn)物的元素組成，其EDS分析見表2。結(jié)果證實這些鐵礦物產(chǎn)物主要由Fe、O、S和K元素組成，并未檢測到Na元素。在含有500 mmol/L Na+的A.ferrooxidans培養(yǎng)液中， 11周后的鐵礦物沉淀產(chǎn)物中幾乎未檢測到黃鈉鐵礬(Grampetal., 2008)。這一致表明在A.ferrooxidans培養(yǎng)液中，即使Na+含量遠(yuǎn)大于K+的含量，但初始礦物相施氏礦依舊優(yōu)先轉(zhuǎn)化形成黃鉀鐵礬，而不是黃鈉鐵礬。

表 2 4 d后獲得鐵礦物的元素分析 wB/% Table 2 Elemental analysis for iron minerals obtained after 4 d

XRD和FTIR結(jié)果分別見圖3和圖4。參照文獻(xiàn)(Liaoetal., 2009； Xuetal., 2014； 張笛等， 2018)中報道的施氏礦(PDF47-1775)和黃鉀鐵礬(PDF36-0427)的XRD譜線，相關(guān)處理中沉淀產(chǎn)物對應(yīng)的XRD譜線結(jié)果見圖3。其中，2 d后形成鐵沉淀產(chǎn)物的XRD譜線只呈現(xiàn)了施氏礦的主要特征峰， 對應(yīng)d值為5.09、 3.39、2.55、2.28、1.95、1.66、1.51、1.48。4 d含蘋果酸鈉的沉淀產(chǎn)物和7 d所有產(chǎn)物的XRD譜線(主要特征峰d值為5.80、5.08、3.63、3.12、2.56、2.27、1.98、1.83)均顯示，它們主要為黃鉀鐵礬礦相；其他XRD譜線存在施氏礦和黃鉀鐵礬礦的主要特征峰，這表明4 d后其他處理中鐵沉淀產(chǎn)物為施氏礦和黃鉀鐵礬的混合相。

此外，細(xì)菌培養(yǎng)介質(zhì)中形成的2、4和7 d的鐵礦物產(chǎn)物的FTIR譜線見圖4。細(xì)菌培養(yǎng)至2 d時獲得鐵沉淀的FTIR譜線于693 cm-1處出現(xiàn)O—H…SO4的振動峰，1 122、981和605 cm-1處出現(xiàn)了典型的SO4基團(tuán)振動峰的吸收峰。與文獻(xiàn)(Xieetal., 2017)報道的施氏礦的紅外光譜線基本一致。細(xì)菌繼續(xù)培養(yǎng)至第4 d時，除了SO20和SO40處理中鐵礦物產(chǎn)物的FTIR譜線與純施氏礦基本一致外，其余處理產(chǎn)物的FTIR譜線中均存在黃鉀鐵礬的結(jié)構(gòu)基團(tuán)對應(yīng)的吸收峰。7 d鐵沉淀的FTIR譜線于1 195和630 cm-1處出現(xiàn)了SO4伸縮振動峰，1 087和1 005 cm-1處出現(xiàn)了黃鉀鐵礬的SO4吸收峰，在508 cm-1處出現(xiàn)了FeO6正八面體的振動峰，這證實7 d鐵礦物產(chǎn)物的主要礦相為黃鉀鐵礬。

圖 3 鐵沉淀產(chǎn)物的X射線衍射圖Fig. 3 XRD patterns of the iron precipitate products

圖 4 鐵沉淀產(chǎn)物的紅外光譜圖Fig. 4 FTIR spectra of the iron precipitate products

2.3.2 FESEM形貌分析

含有機(jī)酸鈉鹽各處理組(即含有草酸鈉、檸檬酸鈉和蘋果酸鈉的a、b和c 3組處理)中部分鐵礦物的FESEM形貌結(jié)構(gòu)如圖5所示。Fe2+氧化趨勢與對照處理一致的含有機(jī)酸鈉鹽處理(SO10、SO20、SC20和SM10)形成鐵礦物產(chǎn)物的形貌結(jié)果顯示，除SO20的產(chǎn)物中只有少量黃鉀鐵礬塊狀顆粒(直徑約0.4～2 μm)，主要為施氏礦(呈現(xiàn)為針墊-聚集球顆粒，直徑約2.5～5 μm)；其余3個處理的鐵沉淀產(chǎn)物在第4 d時已觀察到大量黃鉀鐵礬顆粒。SC20處理中形成的施氏礦(直徑約0.5～0.8 μm)和黃鉀鐵礬的顆粒尺寸(約0.4～1.5 μm)明顯小于SO10和SM10中形成的鐵沉淀物(施氏礦的顆粒直徑約1～2 μm；黃鉀鐵礬顆粒尺寸約1～2.5 μm)。SO10和SM10處理中形成施氏礦的顆粒形貌極為相似，但它們轉(zhuǎn)化形成的黃鉀鐵礬的顆粒形貌存在明顯差異(前者顆粒尺寸不如后者均一，且大量顆粒為不規(guī)則菱形狀)。

圖 5 鐵礦物沉淀的動態(tài)形貌Fig. 5 Dynamic morphologies for the iron mineral precipitates

此外，觀察含草酸鈉(a組)細(xì)菌培養(yǎng)液SO10、SO20和SO40這3個處理中2、4和7 d產(chǎn)物的形貌變化情況時發(fā)現(xiàn)，隨著草酸鈉濃度的升高，初始鐵沉淀產(chǎn)物針墊球狀施氏礦(圖A2、B2和C2； 圖C4)向菱形塊狀黃鉀鐵礬(圖A4和 B4； 圖A7、B7和C7)的轉(zhuǎn)化抑制會明顯增強(qiáng)。綜合XRD、FTIR和FESEM結(jié)果，可證實SO40處理中鐵礦物產(chǎn)物的礦相轉(zhuǎn)化明顯被抑制，其主要原因可能是Fe2+被完全氧化的時間較該組其他處理延遲了72 h所致。進(jìn)一步觀察了細(xì)菌培養(yǎng)至第4 d時含草酸鈉組SO4～SO40(插圖、A4、B4和C4)和含蘋果酸鈉處理SM4(插圖)和SM10(圖E4)形成鐵礦物的形貌，也發(fā)現(xiàn)菱形塊狀黃鉀鐵礬顆粒的轉(zhuǎn)化形成隨著外加有機(jī)酸鈉鹽濃度的升高受到抑制。

綜上，在含有A.ferrooxidans的反應(yīng)溶液中，當(dāng)Fe2+被完全氧化成Fe3+后(48 h后)，利于施氏礦向黃鉀鐵礬相的轉(zhuǎn)化(Nazarietal., 2014)。蘋果酸鈉較草酸鈉(或檸檬酸鈉)更能顯著促進(jìn)施氏礦向黃鉀鐵礬轉(zhuǎn)化。此外，高濃度的有機(jī)酸鈉鹽(SO40和SC20處理)會抑制這兩種礦相的轉(zhuǎn)化(Renetal., 2009)或不利于鐵礦物的形成(SC40和SM20處理中無鐵沉淀產(chǎn)生)。故含細(xì)菌培養(yǎng)液中形成的鐵礦物產(chǎn)物礦相和形貌結(jié)構(gòu)均會受到外加低分子有機(jī)酸鈉鹽的種類和濃度的影響。

3 結(jié)論

(1) 加入低分子有機(jī)酸鈉鹽的濃度較低時對細(xì)菌氧化Fe2+的能力作用不明顯；其濃度較高時(蘋果酸鈉、檸檬酸鈉和草酸鈉依次為20、40和40 mmol/L)則會產(chǎn)生明顯的抑制(從大到小的順序為蘋果酸鈉>檸檬酸鈉>草酸鈉)。

(2) 有機(jī)酸鈉鹽濃度較低時，利于針墊類球狀施氏礦向菱形黃鉀鐵礬轉(zhuǎn)化。其中鐵沉淀產(chǎn)物在細(xì)菌培養(yǎng)初始階段(2 d內(nèi))主要為施氏礦，在細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)束(7 d)后主要為黃鉀鐵礬；在Fe2+完全被氧化后(2～7 d)，鐵沉淀產(chǎn)物初始相施氏礦易向黃鉀鐵礬轉(zhuǎn)化。

(3) 有機(jī)酸鈉鹽濃度較高時，鐵沉淀產(chǎn)物主要為施氏礦；此外施氏礦的形成與黃鉀鐵礬的轉(zhuǎn)化形成均會受到抑制。

(4) 蘋果酸鈉的加入比草酸鈉和檸檬酸鈉的加入更易促進(jìn)黃鉀鐵礬的轉(zhuǎn)化。