金 明 劉旭升 逄洪波* 王 澤 趙宗耀 韓康順 李彥利 賈玉敏

(1.沈陽師范大學 生命科學學院，沈陽 110034；2.通化市農(nóng)業(yè)科學研究院 水稻所，吉林 通化 135007)

水稻是最重要的糧食作物之一，全世界一半以上的人口以水稻為主食[1-2]。冷害是導致水稻產(chǎn)量下降的主要因素之一，全球大約1 500萬hm2的土地容易遭受冷害，在日本、韓國、中國的東北和西南地區(qū)尤為嚴重[3-4]。水稻直播有利于機械化操作，具有省工、省力和高效等優(yōu)勢，隨著勞動力成本不斷上漲，水稻直播越來越受到農(nóng)民的青睞[5]。芽期是水稻生長發(fā)育過程中最脆弱的時期，直播的水稻種子遭受冷害會引起種子死亡，大大降低發(fā)芽率，導致不正常幼苗的形成，最終造成嚴重減產(chǎn)[6-7]。故提高芽期耐寒性是水稻育種的重要目標，芽期耐寒性強的水稻品種將有利于糧食生產(chǎn)，促進糧食安全和持續(xù)發(fā)展。

水稻芽期分為萌發(fā)期和芽期2個階段。萌發(fā)期耐寒性是指水稻種子在低溫下的發(fā)芽能力，而芽期耐寒性是指水稻種子萌發(fā)后在低溫下成苗的能力[8]。國內(nèi)外學者在水稻芽期耐寒篩選和鑒定方面已經(jīng)開展了一些相應(yīng)的研究，韓龍植等[9]以成苗率作為芽期耐寒指標從879份水稻種質(zhì)資源中篩選出39份芽期耐寒性極強的水稻種質(zhì)資源。王麗艷等[10]以發(fā)芽率等4個指標對8個水稻品種和3個自育品系進行評價篩選出‘墾粳8’和‘鴻源香169’2個耐寒性強的水稻品種。黃永蘭等[11]以死苗率作為芽期耐寒性評價指標對江西省的48份早稻品種進行評價，得出雜交水稻品種強于常規(guī)水稻品種的結(jié)論。唐雙勤等[12]以成苗率及根長、根數(shù)等指標作為芽期耐寒指標對江西省的33份早秈雜交稻品種和8份常規(guī)稻進行評價篩選出‘陵兩優(yōu)7108’、‘兩優(yōu)287’和‘錦兩優(yōu)816’等9份強耐寒品種。熊英等[13]以成苗率和6個幼苗生長相關(guān)指標作為芽期耐寒性的評價指標對204份水稻材料進行評價，篩選出了5份耐寒能力突出的水稻種質(zhì)。肖宇龍等[14]以成苗率作為芽期耐寒指標對江西省23個早稻主栽品種組合進行評價，篩選出4個芽期耐寒性極強的組合。張建華等[15]以幼芽成活率作為芽期耐寒指標對690份稻種資源進行評價篩選出25份強耐寒品種。

已有研究中，水稻萌發(fā)期和芽期耐寒性主要分別采用發(fā)芽率和成苗率進行評價[3,16-17]。QTL定位研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)期和芽期耐寒性的QTL位點只有少部分重疊，說明二者的耐寒機制可能存在較大差異[18]，而水稻耐寒性是由多個因子共同決定的復(fù)雜數(shù)量性狀，因此僅采用單一指標進行耐寒性評價有局限性。且以往研究利用統(tǒng)計學方法對水稻芽期耐寒性進行評價時，一般只采用單一方法進行簡單分析，利用多元統(tǒng)計方法對水稻芽期耐寒性進行綜合評價鮮見報道。故本研究通過測定萌發(fā)期指標(發(fā)芽率、發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、種子萌發(fā)指數(shù)、平均發(fā)芽時間和萌發(fā)系數(shù))與芽期指標(成苗率)，采用主成分分析法和隸屬函數(shù)法，對49個水稻種質(zhì)進行綜合評價，旨在篩選出合理的芽期耐寒性相關(guān)評價指標，建立更加快速準確的芽期耐寒評價體系，以期為水稻種質(zhì)資源的耐寒評價和選育耐寒性優(yōu)異的水稻新品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選用的49份水稻種質(zhì)資源來源于中國、孟加拉國和印度等10個不同國家，種質(zhì)的具體信息見表1。

表1 49份水稻種質(zhì)資源名稱及其來源Table 1 Names and origin of 49 rice germplasm resources

1.2 試驗方法

種子置于50 ℃ 烘箱中72 h打破休眠后，75%乙醇對其表面進行消毒處理，并用無菌水沖洗3次[19]。

發(fā)芽率測定參考Fujino等[16-17]和Li等[20]的方法，每個水稻品種挑選40粒飽滿種子放置于鋪有雙層濾紙的玻璃培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中，加入適量無菌水后，在氣候培養(yǎng)箱15 ℃(12 h光照/12 h黑暗)中低溫處理10 d。種子露白則記為發(fā)芽，統(tǒng)計每天發(fā)芽種子個數(shù)用于萌發(fā)期相關(guān)耐寒指標的計算。每個品種重復(fù)3次。

成苗率測定參考Zhang等[3]和Pan等[21]的方法，將水稻種子放置于28 ℃黑暗條件下浸種48 h后，放入30 ℃培養(yǎng)箱黑暗條件下催芽24 h。選擇40粒芽長約5 mm的水稻種子，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中后放入5 ℃ 氣候培養(yǎng)箱(12 h光照/12 h黑暗)低溫處理10 d，轉(zhuǎn)至培養(yǎng)室(28 ℃，12 h光照/12 h黑暗)恢復(fù)生長。7 d后統(tǒng)計成苗數(shù)。每個品種重復(fù)3次。

1.3 測定指標

以發(fā)芽率(GR， germination rate)、發(fā)芽勢(GP， germination potential)、相對發(fā)芽率(RGR， relative germination rate)、相對發(fā)芽勢(RGP， relative germination potential)、發(fā)芽指數(shù)(GI， germination index)，種子萌發(fā)指數(shù)(PI， promptness index)、平均發(fā)芽時間(MGT， mean germination time)、萌發(fā)系數(shù)(GC， germination coefficient)以及成苗率(SR， seedling rate)作為芽期耐寒性的評價指標，對不同品種水稻的芽期耐寒性進行評價。各指標的計算公式如下：

發(fā)芽率=(發(fā)芽的種子數(shù)/種子總數(shù))×100%

(1)

發(fā)芽勢=(培養(yǎng)4天發(fā)芽的種子數(shù)/
種子總數(shù))×100%

(2)

相對發(fā)芽率=處理發(fā)芽率/對照發(fā)芽率×100%

(3)

相對發(fā)芽勢=處理發(fā)芽勢/對照發(fā)芽勢×100%

(4)

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)

(5)

式(5)中:Gt,第t天種子的發(fā)芽數(shù)；Dt，進行發(fā)芽實驗的第t天。

種子萌發(fā)指數(shù)=1.00×nd2+0.75×nd4+
0.50×nd6+0.25×nd8

(6)

式(6)中:nd2、nd4、nd6和nd8分別對應(yīng)第2 天、第4 天、第6天和第8天的發(fā)芽率。

平均發(fā)芽時間=(G1T1+G2T2+…+GnTn)/
(G1+G2+…+Gn)

(7)

式(7)中:Tn指代發(fā)芽日數(shù)，d;Gn是與發(fā)芽日數(shù)相對應(yīng)的發(fā)芽種子數(shù)。

萌發(fā)系數(shù)=發(fā)芽率/平均發(fā)芽時間

(8)

成苗率=(成活苗數(shù)/出芽總粒數(shù))×100%

(9)

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

利用Excel 2016軟件進行各綜合指標耐寒隸屬函數(shù)值及芽期耐寒綜合評價值的計算。

u(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(10)

(11)

(12)

式(10)～(12)中：j取1到n的值；Xj和u(Xj)分別代表第j個綜合指標的主成分值和隸屬函數(shù)值；Xmax和Xmin分別表示第j個主成分的最大值和最小值[22]；Wj，第j個綜合指標在所有綜合指標中的重要程度即權(quán)重；Pj，通過主成分分析后所得的第j個綜合指標的貢獻率[23]；D，為水稻品種在低溫條件下由綜合指標計算所得的耐寒綜合評價值[24]。

利用SPSS 26.0軟件進行主成分分析等統(tǒng)計學相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各指標之間的相關(guān)性分析

由表2可知，發(fā)芽率與發(fā)芽勢、相對發(fā)芽勢呈顯著正相關(guān)，與相對發(fā)芽率、種子萌發(fā)指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)和萌發(fā)系數(shù)呈極顯著正相關(guān)，其中發(fā)芽率與萌發(fā)系數(shù)的相關(guān)系數(shù)最大，R2=0.998；平均發(fā)芽時間與發(fā)芽率、相對發(fā)芽率、發(fā)芽勢、相對發(fā)芽勢、種子萌發(fā)指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)和萌發(fā)系數(shù)均呈極顯著負相關(guān)，其中平均發(fā)芽時間與種子萌發(fā)指數(shù)的相關(guān)系數(shù)絕對值最大,為0.941；而成苗率與其余幾個指標的相關(guān)性不顯著。相關(guān)性分析結(jié)果表明，大部分單項指標間都呈極顯著相關(guān)性。

表2 水稻芽期耐寒性指標的相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coefficient of cold tolerance indexes in rice at the germination stage

2.2 主成分分析

由表3可知，9個芽期耐寒指標通過主成分分析后得到了2個主成分。其中主成分1的特征值為6.370，具有70.782%的貢獻率；而主成分2的特征值為1.558，具有17.310%的貢獻率。2個主成分的累積貢獻率為88.092%，特征值均>1，依據(jù)累計貢獻率≥85%，特征值>1的提取標準，舍棄其余特征值<1的綜合指標，故將9個芽期耐寒指標轉(zhuǎn)化為 2個獨立的綜合指標，這2個綜合指標能夠?qū)υ袉雾椫笜说拇蟛糠中畔⑦M行足夠的概括，可以用于水稻種質(zhì)資源的芽期耐寒性表型指標評價。主成分1中系數(shù)較大的為發(fā)芽指數(shù)(GI)0.390，種子萌發(fā)指數(shù)(PI)0.388，萌發(fā)系數(shù)(GC)0.380，平均發(fā)芽時間(MGT)-0.379，發(fā)芽率(GR)0.373和相對發(fā)芽率(RGR)0.372，系數(shù)的絕對值均>0.3；主成分2中系數(shù)最大的為相對發(fā)芽勢(RGP)0.612。由表3可得到2個綜合指標的對應(yīng)系數(shù)為:

表3 主成分貢獻率及特征向量Table 3 Principal component contribution ratio and eigenvector

主成分1： CI1=0.373GR+0.248GP+0.388PI+0.390GI-0.379MGT+0.380GC-0.099SR+0.372RGR+0.248RGP

主成分2： CI2=-0.233GR+0.610GP-0.008PI-0.073GI-0.017MGT-0.196GC+0.322SR-0.226RGR+0.612RGP

2.3 品種綜合評價

由表4可知，主成分1中，IRIS 313-11965的隸屬函數(shù)值最大，為 1.000，表明IRIS 313-11965在主成分1中的芽期耐寒性最強，而IRIS 313-10930的隸屬函數(shù)值最小，為0.000，表明IRIS 313-10930在主成分1中的芽期耐寒性最弱；主成分2中，IRIS 313-10946的隸屬函數(shù)值最大，為 1.000，表明IRIS 313-10946在主成分2中的芽期耐寒性最強，而IRIS 313-10963的隸屬函數(shù)值最小，為0.000，表明IRIS 313-10963在主成分2中的芽期耐寒性最弱。

依據(jù)公式(11)計算得到主成分分析篩選出的2 個綜合指標的權(quán)重。主成分1的權(quán)重為0.803，主成分2的權(quán)重為0.197。在49個水稻品種中，IRIS 313-11965、IRIS 313-8956 和 IRIS 313-11038的D值較高(0.790～0.830)，評價為芽期耐寒能力極強。IRIS 313-10891、IRIS 313-9405和IRIS 313-10071等9個品種的D值較低(0.187～0.282)，評價為芽期耐寒能力極弱，見表4。

表4 各品種的主成分值、隸屬函數(shù)值、綜合評價值(D)和預(yù)測值Table 4 Principal component value, membership function value, comprehensiveevaluation value and predicted value of each variety

表4(續(xù))

2.4 回歸分析

將D作為因變量，9個單項指標作為自變量進行逐步回歸分析，建立最優(yōu)回歸方程：D=0.326+0.020GI+0.021SR-0.028MGT+0.025PI+0.012GR+0.137RGP。決定系數(shù)R2=1.000，P=0.000，6個自變量幾乎可決定D的全部變異，分別是發(fā)芽指數(shù)(GI)、成苗率(SR)、平均發(fā)芽時間(MGT)、種子萌發(fā)指數(shù)(PI)、發(fā)芽率(GR)和相對發(fā)芽勢(RGP)。用該回歸方程對49個品種水稻芽期耐寒性進行預(yù)測，其預(yù)測值與綜合評價值D的排序完全一致(表4)，說明該回歸方程可對水稻芽期耐寒性進行準確的預(yù)測。

2.5 聚類分析

利用D，采用組間聯(lián)接法和歐氏距離進行聚類分析，在歐氏距離8.0處將49份品種分為5個類群,見圖1，對應(yīng)水稻耐寒性劃分的極強、強、中、弱和極弱 5個等級。第Ⅰ類群包括IRIS 313-11986、IRIS 313-11031和IRIS 313-11154等13個水稻品種，耐寒性弱；第Ⅱ類群包括IRIS 313-11049、IRIS 313-10932和IRIS 313-11048等7個水稻品種，耐寒性中等；第Ⅲ類群包括IRIS 313-11965、IRIS 313-8956 和 IRIS 313-11038共3個水稻品種，耐寒性極強；第Ⅳ類群包括IRIS 313-11944、IRIS 313-11016和IRIS 313-10731等17個品種，耐寒性強；第Ⅴ類群包括IRIS 313-10891、IRIS 313-9405和IRIS 313-10071等9個水稻品種，耐寒性極弱。

Ⅰ，耐寒性弱；Ⅱ，耐寒性中等；Ⅲ，耐寒性極強；Ⅳ，耐寒性強；Ⅴ，耐寒性極弱。虛線表示歐式距離8。Ⅰ， weak cold-tolerant varieties; Ⅱ， moderate cold-tolerant varieties; Ⅲ， particularly strong cold tolerance; Ⅳ， strong cold tolerance; Ⅴ， particularly weak cold tolerance. The dotted line indicates that Euclidean distance value is 8.圖1 基于9個芽期耐寒指標的49份水稻種質(zhì)資源聚類分析Fig.1 Cluster analysis results of 49 rice germplasm resources based on 9 cold tolerance indexes at the germination stage

3 討 論

耐寒種質(zhì)資源的篩選和鑒定是培育耐寒水稻品種的直接有效手段。隨著機械化生產(chǎn)和直播稻面積的大量增加，水稻芽期耐寒性變得尤為重要。以往的研究多選用發(fā)芽率[10]、成苗率[9,12-13,15]、發(fā)芽指數(shù)[10]和根長[12-13]等指標評價水稻芽期耐寒性，但水稻耐寒性是由多個因子共同決定的復(fù)雜數(shù)量性狀，僅使用某一個單項指標對其進行耐寒性鑒定評價具有局限性[25-26]，故本研究通過利用萌發(fā)期耐寒指標(發(fā)芽率、發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、種子萌發(fā)指數(shù)、萌發(fā)系數(shù)和平均發(fā)芽時間)和芽期耐寒指標(成苗率)共9個指標進行綜合評價。

主成分分析可以將多個關(guān)聯(lián)的單項指標轉(zhuǎn)化成數(shù)量很少并且相互獨立的綜合指標，避免了多指標評價中各指標間具有一定相關(guān)性且信息重疊等問題。這種方法已經(jīng)用于農(nóng)藝性狀的評價中，如高粱耐鹽性[27]、大豆耐低磷[28]、小麥抗旱性[29]和水稻耐鹽性[30-31]等。本研究計算出每個水稻種質(zhì)的主成分值及對應(yīng)的隸屬函數(shù)值和權(quán)重，避免人為確定權(quán)重的主觀性；將2個綜合指標的特征向量進行歸一化處理，得到水稻芽期耐寒性的綜合評價值(D)，這樣既考慮了各指標間的相關(guān)性，又考慮了各指標的重要性，從而使獲得的評價結(jié)果更為科學合理。利用多元統(tǒng)計學分析進行綜合評價將9個芽期耐寒性指標數(shù)量化，與芽期耐寒性強弱建立數(shù)量關(guān)系，根據(jù)D對本研究的49個水稻品種芽期耐寒性進行排序以及分級，結(jié)果表明，IRIS 313-11965、IRIS 313-8956和IRIS 313-11038共3個水稻種質(zhì)的芽期耐寒性在選取的49個水稻品種中最強，可以在今后的水稻芽期耐寒品種選育和改良中加以應(yīng)用。

聚類分析可以將不同的種質(zhì)進行準確的分類，能夠直觀地對不同種質(zhì)間的分類關(guān)系進行分析[32]。本研究中，根據(jù)D對49個水稻品種進行聚類分析，將其劃分為5個類別，與韓龍植等[9]研究中極強、強、中、弱和極弱的5個水稻耐寒等級劃分一致。本研究利用逐步回歸分析構(gòu)建了1個最優(yōu)回歸方程作為水稻芽期耐寒性的評價模型，利用該模型得到的預(yù)測值及排序都與利用D進行評價的結(jié)果基本相同。結(jié)果驗證了利用該模型評價水稻芽期耐寒性比較可靠，其評價指標容易測定且準確有效，可以用于預(yù)測目標種質(zhì)芽期耐寒性的強弱。

4 結(jié) 論

本研究對49份水稻種質(zhì)資源的芽期耐寒性進行綜合評價。利用主成分分析、隸屬函數(shù)分析、聚類分析和逐步回歸分析等多元統(tǒng)計學方法，從測定的9個單項指標中篩選出發(fā)芽率(GR)、相對發(fā)芽勢(RGP)、發(fā)芽指數(shù)(GI)、種子萌發(fā)指數(shù)(PI)、平均發(fā)芽時間(MGT)和成苗率(SR)6個與水稻芽期耐寒性有顯著相關(guān)的關(guān)鍵指標，建立了最優(yōu)回歸方程，D=0.326+0.020GI+0.021SR-0.028MGT+0.025PI+0.012GR+0.137RGP可用于水稻種質(zhì)資源芽期耐寒性的快速鑒定與預(yù)測。利用綜合評價值(D)篩選出3份芽期耐寒性極強的水稻種質(zhì)材料是IRIS 313-11965、IRIS 313-8956和IRIS 313-11038。