廖華寶 胡江建 張笑丹 黃瑞紫 宋學軍△

（1 南方科技大學疼痛醫(yī)學中心，深圳 518055；2 南方科技大學醫(yī)院圍術期醫(yī)學部，深圳 518055）

糖尿病、癌癥和心血管疾病位列我國乃至全球發(fā)病率最高的三大疾病，嚴重威脅人類健康。近年來，我國糖尿病患病率急劇上升，給社會發(fā)展帶來嚴重挑戰(zhàn)[1]。糖尿病神經病 (diabetic neuropathy) 是糖尿病中晚期常見的并發(fā)癥。臨床上，近50%糖尿病病人伴隨神經病變，其中有25%～50%病人會產生糖尿病神經病理性疼痛 (diabetic neuropathic pain, DNP)[2]。DNP 癥狀包括針刺樣疼痛、灼燒感、痛覺過敏、痛覺超敏、自發(fā)痛、感覺缺失等。DNP的發(fā)生發(fā)展機制包括高血糖引起血管病變和神經損傷。高血糖通過激活多元醇通路，造成山梨醇和果糖的大量堆積，形成胞內高滲透壓，導致血管內皮細胞、神經細胞變性以及死亡。氧化應激和氮化應激產生大量活性氧和一氧化氮，增加血管通透性，促進糖尿病疼痛發(fā)展。高血糖引發(fā)晚期糖基化終末產物 (advanced glycation end products, AGEs) 聚集以及線粒體功能障礙，引起血管和神經病變[3,4]。神經病變多體現(xiàn)在軸突功能異常、軸突再生障礙、纖維密度降低、脫髓鞘病變，以及膠質細胞活性改變等。髓鞘是保護軸突，維持正常神經傳導的結構基礎[5]。在中樞或外周神經系統(tǒng)中，髓鞘病變都會導致神經功能異常和缺失[5,6]。研究表明，外周神經脫髓鞘病變是DNP 發(fā)生發(fā)展和維持的重要原因[6～8]。然而，針對DNP 的機制研究和臨床治療依然非常有限。傳統(tǒng)的鎮(zhèn)痛藥對DNP 具有一定的療效[9～11]，但缺乏針對性，因此其效果有限。同時，這些藥物的使用受到安全性、成癮性和耐受等問題限制。

在研究糖尿病及其疼痛機制時，必須注意到臨床上有一部分晚期糖尿病病人并不會出現(xiàn)明顯的疼痛癥狀[12]。同樣，在糖尿病實驗模型中，并非所有高血糖個體都出現(xiàn)痛敏，但這一現(xiàn)象以及背后的機制在既往的研究中往往被忽視，直到最近證明并明確指出這個問題[13]。在糖尿病疼痛模型中，與正常組相比，具有兩個變量—高血糖和疼痛。而糖尿病疼痛組與糖尿病非疼痛組之間，僅僅單一變量—疼痛，分析疼痛個體與非疼痛個體間的差異和關系，這對研究DNP的發(fā)生和發(fā)展機制至關重要。本研究著重探討高血糖疼痛和高血糖非疼痛動物，在外周神經中的理化特性的差別及其對應的臨床疼痛癥狀，為糖尿病疼痛的機制研究提供更精準可靠的動物實驗模型分析。

方 法

1.藥物、試劑和儀器

鏈脲佐菌素（sigma，美國），vonFrey filament（Aesthesio，美國），共聚焦熒光顯微鏡（Nikon，日本），RNA 提取試劑(Total RNA miniprep kit, Axygen)，cDNA 合成試劑(AT311-03, Transgene)，MBP抗體 (ab40390, Abcam)，Alexa Fluor 488 (4412s, CST)，透射電子顯微鏡（日立，日本）。

2.動物造模及分組

雄性C57BL/6 小鼠，體重20～25 g；雄性SD大鼠，體重220～250 g，購買自廣東省醫(yī)學動物中心，SPF 環(huán)境飼養(yǎng)，自由進食。本研究涉及的所有動物操作，均嚴格遵循南方科技大學動物倫理委員會的相關規(guī)定（倫理批準號SUSTC-JY2019144，SUSTC-JY2019095），由通過實驗動物實驗操作考核的人員參與執(zhí)行。禁食12 h 后，實驗組腹腔注射鏈脲佐菌素 (streptozocin, STZ)，小鼠連續(xù)注射5 天，每天40 mg/kg；大鼠單次注射，劑量為70 mg/kg。對照組注射溶劑枸櫞酸鈉緩沖溶液。最后一次注射記為第0 天，此后每周測量動物空腹血糖，連續(xù)2 周血糖值高于13.8 mM（小鼠）[14]和16.7 mM（大鼠）[15]，即視為成功的糖尿病模型，并根據(jù)其痛閾是否降低，分組如下：糖尿病疼痛組 (STZ-pain)、糖尿病非疼痛組 (STZ-nonpain)和對照組 (Control)。第42天取材。

3.機械痛閾值

造模前1 天和造模后第7、14、21、28、35、42 天測試機械痛閾。動物鼠置于金屬網架的透明格子中，適應20 min，用vonFrey filament 測試。小鼠使用0.07 g～2 g 的纖維絲 (0.07 g、0.16 g、0.4 g、0.6 g、1.0 g、1.4 g、2.0 g)，從0.6 g 開始使用。大鼠使用2 g～15 g 的纖維絲 (2 g、4 g、6 g、8 g、10 g、15 g)，從2 g 開始，刺激動物后足底中部2～3 s，出現(xiàn)快速縮足或舔足反應，記為陽性 “1”，反之，為陰性 “0”。兩次刺激之間至少間隔15 s。機械痛閾值計算在結果圖中換算成力學單位毫牛頓 (mN)。

4.免疫熒光染色檢測坐骨神經髓磷脂堿性蛋白

小鼠經異氟烷麻醉后，從心臟灌注0.1 M 的PBS 和4% PFA，取坐骨神經置于4% PFA 中固定24 h，隨后置于30%蔗糖溶液脫水2 天，OCT 膠包埋組織并冰凍切片，切片厚度為20 μm，加入5%BSA（含0.3% TritonX-100）室溫封閉1 h，然后使用MBP 一抗(1:100)，4℃孵育過夜(> 18 h)，次日用0.1 M PBS 洗滌5 min×3 次，加入二抗Alexa Fluor 488 (1:500)，室溫孵育1 h。之后用0.1 M PBS洗滌5 min×3 次。封片劑封片。共聚焦顯微鏡下拍攝。

5.坐骨神經mRNA 分析檢測

小鼠經異氟烷麻醉后，心臟灌注0.1 M 的PBS，取坐骨神經，約1 cm 長，用RNA 提取試劑盒提取總RNA，并反轉錄成cDNA，用q-PCR 檢測MPZ, MAG 和SOX 10 的mRNA 表達水平。

6.坐骨神經電鏡觀察

取坐骨神經，在2.5%戊二醛固定液中4℃過夜；更換新的2.5%戊二醛，后固定4 h；0.1 M 的PBS 漂洗15 min×3 次；1% 四氧化鋨液固定2 h，PBS 漂洗15 min×3 次；乙醇和丙酮逐級脫水，每次10 min；置入環(huán)氧丙烷中30 min；純包埋液37℃浸透2～3 h；包埋劑中4℃下固化2～3 天；制成超薄切片（厚度50 nm）；最后依次用醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，各30 min，電鏡拍攝。統(tǒng)計各組的纖維厚度，髓鞘厚度以及g-ratio 值。g-ratio = 纖維內徑/外徑，g-ratio 值越大，表示髓鞘越薄。

7.統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件統(tǒng)計并生成圖表，Image J 軟件統(tǒng)計免疫熒光的強度。所有計量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準誤(±SEM)表示，行為數(shù)據(jù)采用two-way ANOVA 分析，Western blot、電鏡、Q-PCR 以及免疫熒光結果多組間的比較采用one-way ANOVA分析。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1. STZ 誘導血糖增高和機械痛閾值降低

腹腔注射STZ 后，小鼠體重增長緩慢甚至下降（見圖1A），血糖逐漸升高，在第14 天達到峰值并趨于穩(wěn)定，第42 天，78%的小鼠發(fā)展成糖尿?。ㄒ妶D1B，表1）。同時，第7 天起，部分小鼠機械痛閾顯著下降（即STZ-pain）；第14 天及之后，小鼠痛閾穩(wěn)定，持續(xù)至實驗結束；至第42 天，約72%的糖尿病小鼠出現(xiàn)顯著機械痛敏，占總數(shù)56%（見圖1C，表1）。但仍然有28%的糖尿病個體痛閾不變 (STZ-nonpain)，占總數(shù)的22%（見圖1C，表1）。

在SD 大鼠實驗中，同樣發(fā)現(xiàn)注射STZ 后第42天，95%動物發(fā)展成糖尿病（見圖1D，1E，表1）。第12 天起，部分個體機械痛閾顯著下降 (STZ-pain)；第42 天，46%的糖尿病大鼠出現(xiàn)顯著痛敏，占動物總數(shù)的43.8%，而54%的糖尿病大鼠的機械痛閾無顯著變化 (STZ-nonpain)，占動物總數(shù)51.3%（見圖1F，表1）。這些結果表明，STZ 誘導的大小鼠糖尿病模型中，依然有相當一部分動物不出現(xiàn)明顯的疼痛行為學癥狀。

圖1 STZ 誘導的糖尿病模型機械痛閾值改變(±SEM)Fig. 1 STZ-induced hyperglycemia and mechanical hypersensitivity (±SEM)

表1 STZ 誘導糖尿病性高血糖和機械性疼痛發(fā)生率Table 1 Incidence of STZ-induced hyperglycemia and mechanical allodynia in rats and mice

2.糖尿病神經病理性疼痛小鼠坐骨神經脫髓鞘病變

髓鞘病變導致神經功能異常和缺失，包括軀體感覺異常。對比糖尿病疼痛組(STZ-pain)和糖尿病非疼痛組(STZ-nonpain)小鼠的坐骨神經纖維形態(tài)可知，STZ 誘導的糖尿病疼痛組(STZ-pain)的g-ratio值顯著大于對照組(Control)和非疼痛組(STZ-nonpain)，而STZ-nonpain 組坐骨神經的形態(tài)無顯著變化（見圖2 A-C）。這些結果表明，糖尿病疼痛小鼠的坐骨神經髓鞘厚度顯著低于對照組和糖尿病非疼痛組。在病理條件下，有髓鞘的傳入神經纖維中，Aβ 和Aδ 纖維都參與傷害性信息的傳遞，特別是與機械痛敏密切相關[12]。在STZ-pain 組的坐骨神經中，直徑小于5 μm 的纖維的g-ratio 值顯著升高，即髓鞘厚度顯著下降。而直徑在5 μm 以上的纖維的g-ratio 值沒有顯著變化。STZ-nonpain 組中，g-ratio值雖有微弱升高，但并不顯著（見圖2D）。

對各組坐骨神經中的神經纖維內徑（髓鞘以內的軸突直徑）、外徑（含髓鞘）以及髓鞘厚度進行統(tǒng)計分析結果表明，各組纖維的平均內徑無差別（見圖2E）。與對照組相比，STZ-nonpain 小鼠神經纖維的外徑無顯著變化（見圖2F），髓鞘的絕對厚度降低，但仍顯著高于STZ-pain 組（見圖2G）。STZ-pain 組的外徑和厚度均顯著降低，且顯著低于STZ-nonpain 組（見圖2F，2G)。因此，STZ 誘導糖尿病后，機械痛敏小鼠的坐骨神經發(fā)生顯著的脫髓鞘，但非疼痛個體無此病變。

圖2 STZ 誘導的糖尿病神經病理性疼痛小鼠坐骨神經脫髓鞘(±SEM)Fig. 2 STZ-induced demyelination of the sciatic nerves in STZ-pain mice (±SEM)

3. STZ 誘導的糖尿病神經病理性疼痛模型的坐骨神經髓鞘相關蛋白表達降低

髓鞘堿性蛋白 (myelin basic protein, MBP) 是一種富集在中樞神經系統(tǒng)少突膠質細胞和外周神經系統(tǒng)中的髓鞘膜蛋白，對髓鞘形成起著重要作用。免疫組化結果顯示，STZ 注射后第42 天，STZ-pain和STZ-nonpain 組的MBP 蛋白表達量均下調（見圖3A，3B）。與對照組相比，STZ-pain 組的MBP表達水平下降近41%，STZ-nonpain 組MBP 下調不足20%（見圖3B）。

髓鞘蛋白P0 (myelin protein zero, MPZ)是外周髓鞘的一種主要結構組分，MPZ 基因的破壞會導致髓鞘形成減少和軸突的降解。髓鞘相關糖蛋白(myelin associated glycoprotein, MAG)在外周神經系統(tǒng)中由施萬細胞形成，它與髓磷脂和髓鞘上其他分子之間的相互作用為軸突長期穩(wěn)定所必需。STZ 誘導的STZ-pain 小鼠坐骨神經MPZ 和MAG 的mRNA 含量減少，而STZ-nonpain 組并無變化（見圖3C，3D）。SOX10 作為髓鞘的標記分子，STZ 誘導高血糖及疼痛后，其mRNA 表達并未改變（見圖3E）。綜上結果表明，MBP 蛋白下降以及MPZ 和MAG 的mRNA 含量降低，與髓鞘的破壞呈正相關。

圖3 STZ 誘導的糖尿病神經病理性疼痛小鼠的坐骨神經中MBP、MPZ 和MAG 表達變化(±SEM)Fig. 3 STZ-induced alteration of expression of MBP, MPZ, and MAG in the sciatic nerves in STZ-pain mice (±SEM)

討 論

晚期糖尿病病人有明顯的血管病變和神經病變，這些病變多發(fā)生于遠端，尤其是四肢，并伴隨嚴重的疼痛，這類疼痛與神經病變密切相關。同時，自發(fā)或STZ 誘導的糖尿病動物模型中，有相當比例動物并沒有痛敏癥狀，這與臨床觀察病例情況是很相似的。既往有關DNP 的基礎研究中，常進行簡單的對照和治療組間的比較分析，忽略糖尿病中很多個體存在疼痛和無疼痛的差別。DNP 組與正常組之間存在諸如血糖濃度、痛閾等多種變量，使研究結果的分析復雜化，結論不夠明確或者模糊不清。本研究區(qū)分糖尿病鼠中疼痛和非疼痛個體，發(fā)現(xiàn)STZ 誘導的大小鼠糖尿病模型中，僅半數(shù)出現(xiàn)機械痛閾下降。小鼠糖尿病模型中，78%出現(xiàn)持續(xù)高血糖。但僅56%的個體高血糖并伴隨痛閾降低。大鼠糖尿病模型中，95%出現(xiàn)持續(xù)高血糖，只有43.8%痛閾下降，另51.3%痛閾不變。本研究大鼠和小鼠采用不同的STZ 注射方式，他們的高血糖發(fā)生率差別較大，這可能提示大鼠和小鼠對STZ 的反應以及抵抗程度不同，其具體原因尚待探究。根據(jù)糖尿病動物的痛閾差異，將動物分成糖尿病疼痛和非疼痛個體，進一步分析了其外周神經的病變情況。

外周神經系統(tǒng)中，施萬細胞包裹著軸突，并形成髓鞘。已有報道糖尿病病人常伴隨有外周神經損傷，例如軸突損傷、纖維缺失、髓鞘的降解。糖尿病性神經病變更易損害感覺神經，直到晚期才發(fā)生運動神經（有髓鞘）和功能的損傷[16]，這揭示了無髓鞘的神經纖維更易受到侵害損傷，最終導致軸突損傷甚至喪失。本研究分析了糖尿病疼痛和非疼痛個體的坐骨神經髓鞘的變化，發(fā)現(xiàn)糖尿病疼痛組的髓鞘g-ratio 高于非疼痛組，髓鞘厚度降低；主要傳遞傷害性信息傳入的中小直徑纖維的髓鞘降低更加顯著。同時，糖尿病非疼痛組的神經髓鞘并無顯著變化。為進一步探討引起髓鞘改變的原因，檢測了與坐骨神經髓鞘生成和維持相關的分子 (MBP, MPZ和MAG) 的表達情況。STZ 注射后第6 周，相比糖尿病非疼痛組，糖尿病疼痛組的MBP 蛋白下調，MPZ 和MAG 的mRNA 顯著下降，這與坐骨神經脫髓鞘現(xiàn)象一致。MBP 等分子的表達減少可以引起施萬細胞損傷，進而引起髓鞘缺損和厚度降低。軸突失去髓鞘保護后，容易受到來自病變組織和血液中炎性因子和ROS 等分子的攻擊，導致軸突損傷甚至缺失[17]。同時，生理狀態(tài)下施萬細胞參與葡萄糖代謝，產生乳酸，可以為軸突供能；高血糖狀態(tài)下，施萬細胞產生過量乳酸，引起軸突酸中毒，激活酸敏感通道和TRPV1 等，引起疼痛[18]。這些結果更加準確地表明，外周神經髓鞘的病變和缺失對DNP的發(fā)展和維持至關重要。

本研究并未深入探索脫髓鞘的關鍵分子機制和改善方案，以及在糖尿病疼痛的發(fā)生發(fā)展過程中髓鞘的動態(tài)變化，髓鞘的改變在糖尿病的發(fā)生和發(fā)展階段的作用有待進一步研究。治療糖尿病疼痛的藥物很多，包括5-羥色胺再攝取抑制劑、三環(huán)類抗抑郁藥、抗驚厥藥、嗎啡、以及辣椒堿等局部用藥。前四類為全身用藥，不良反應多，而局部用藥不良反應小?；谔悄虿∩窠洸〖疤弁闯梢虻膹碗s性，單獨用藥效果并不理想，現(xiàn)多應用聯(lián)合用藥緩解和治療糖尿病疼痛。已知甲鈷胺、生長因子、維生素等營養(yǎng)類藥物可以促進磷脂的合成，修復髓鞘，促進神經修復，緩解神經病變和疼痛[19～21]。因糖尿病外周神經病變多發(fā)生于四肢末端，可考慮局部用藥，促進髓鞘再生和神經修復。結合本研究結果，修復髓鞘是減輕DNP 的治本性有效策略。

綜上所述，本研究強調糖尿病疼痛個體和非疼痛個體的差別，將分析的變量控制為單一因素—痛覺異常，通過比較糖尿病疼痛組和非疼痛組的髓鞘特性，更精確地說明了坐骨神經脫髓鞘在DNP的發(fā)展和維持階段的重要作用，進一步為DNP 的藥物研究和臨床治療提供理論依據(jù)。