陸玉建

(1.濱州學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院,山東 濱州 256603;2.山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心,山東 濱州 256603;3.山東省黃河三角洲生態(tài)脆弱帶工程技術(shù)研究中心,山東 濱州 256603)

紫茉莉(MirabilisjalapaL.)為紫茉莉科、紫茉莉?qū)俣嗄晟荼局参颷1]。紫茉莉具有較高的觀賞價(jià)值,可以美化環(huán)境,同時(shí)也是一種藥用植物,具有殺蟲、抑菌、抗病毒等功效[2,3]。紫茉莉生長(zhǎng)迅速、生物量大,根系發(fā)達(dá),可通過(guò)根系分泌物與土壤微生物相互作用,在污染土壤的生物修復(fù)中顯示出巨大的潛力[4]。土壤重金屬污染對(duì)人類健康構(gòu)成了巨大的威脅,植物修復(fù)是解決此類問(wèn)題的重要途徑。紫茉莉?qū)χ亟饘冁k具有較強(qiáng)的耐受性,甚至在堿性土壤中仍具有強(qiáng)大的鎘積累能力[5,6]。通過(guò)螯合和施肥等措施,可以強(qiáng)化紫茉莉?qū)︽k污染土壤的修復(fù)效率[7]。紫茉莉通過(guò)根系有機(jī)物含量的變化,可以將吸收的鉛積累在根部,從而有效地保護(hù)植物的地上部分,因此紫茉莉具有極強(qiáng)的鉛耐性[8]。由此可見,紫茉莉是一種較為理想的修復(fù)重金屬污染土壤的植物。石油污染會(huì)導(dǎo)致土壤中真菌的多樣性明顯降低；紫茉莉耐受污染的能力強(qiáng),可以較好地維持真菌的豐度[9]。紫茉莉能夠穩(wěn)定維持土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu),種植紫茉莉可使石油污染土壤的根際微生物多樣性增加[10]。上述研究結(jié)果表明,紫茉莉可通過(guò)與微生物聯(lián)合作用,進(jìn)一步提高石油污染土壤的修復(fù)效果。雖然紫茉莉可用于修復(fù)重金屬和有機(jī)污染物污染的土壤,但其修復(fù)效果仍難滿足實(shí)際需求,而誘變技術(shù)無(wú)疑是提高紫茉莉生物修復(fù)能力的有效途徑。甲基磺酸乙酯(Ethyl methyl sulfonate, EMS)是一種活性很強(qiáng)的化學(xué)誘變劑,已在植物誘變育種中被廣泛應(yīng)用[11]。EMS可作用于植物各種組織和器官,通過(guò)DNA復(fù)制過(guò)程中堿基交換而形成點(diǎn)突變[12]?；瘜W(xué)誘變和離體培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合是突變體篩選較常用的一種方法,具有不受環(huán)境條件限制、節(jié)省大量人工和時(shí)間、擴(kuò)大變異譜和提高變異率等優(yōu)點(diǎn)[13,14]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于紫茉莉的研究主要集中在生物修復(fù)方面,而通過(guò)體細(xì)胞無(wú)性系變異途徑選育突變體則未見相關(guān)報(bào)道。本研究以紫茉莉?yàn)椴牧?通過(guò)將離體再生和EMS誘變技術(shù)相結(jié)合,初步篩選出了性狀優(yōu)良的耐鹽突變體。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

在溫室種植紫茉莉2個(gè)月后,選取帶節(jié)莖段作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 紫茉莉不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基:以MS為基本培養(yǎng)基,分別添加2,4-D(0.1、0.5 mg/L)、NAA(0.5、1.0 mg/L)、6-BA(1.0、2.0 mg/L)、KT(1.0、2.0 mg/L)、TDZ(0.05、0.1 mg/L)。生根培養(yǎng)基:以MS或1/2MS為基本培養(yǎng)基,添加NAA(0、0.3、0.5、1.0 mg/L)。所有培養(yǎng)基均添加3.0%蔗糖和1.0%瓊脂。

1.2.2 紫茉莉的離體再生 取紫茉莉的帶節(jié)莖段,剪去葉片,先用自來(lái)水反復(fù)沖洗,再用蒸餾水沖洗1～2次,然后用70%酒精處理30 s,用0.1% HgCl2消毒10 min,最后用無(wú)菌水沖洗5次,將莖段切割后插入MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d。將莖段上抽出的芽切下,轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)30 d。以無(wú)菌幼苗為材料,取帶節(jié)莖段作為外植體,轉(zhuǎn)接到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將不定芽接入MS+2.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)。切取不定芽,接入MS培養(yǎng)基進(jìn)行壯苗培養(yǎng),最后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根誘導(dǎo)。

1.2.3 鹽脅迫對(duì)紫茉莉不定芽生長(zhǎng)的影響 選取紫茉莉的不定芽,分別轉(zhuǎn)接到含不同濃度(0、50、100、150、175、200、250、300 mmol/L)NaCl的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行垂直培養(yǎng)。在培養(yǎng)30 d后觀察不定芽的生根情況,確定紫茉莉耐鹽突變體篩選時(shí)NaCl的臨界濃度。

1.2.4 紫茉莉不定芽的EMS誘變 將紫茉莉的不定芽浸泡在含不同濃度(0.0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)EMS的磷酸緩沖液中,處理時(shí)間分別為3、4、5、6、7、8 h。在處理完畢后,用無(wú)菌水反復(fù)沖洗不定芽,將其轉(zhuǎn)接入不定芽增殖培養(yǎng)基,在培養(yǎng)30 d后觀察不定芽的生長(zhǎng)情況。當(dāng)紫茉莉的不定芽無(wú)生長(zhǎng)或者葉片變黃或干枯時(shí),說(shuō)明不定芽受到了嚴(yán)重抑制,均按致死處理。根據(jù)統(tǒng)計(jì)的致死的不定芽數(shù),計(jì)算不定芽致死率,獲得比較適合不定芽EMS誘變的半致死劑量。紫茉莉不定芽致死率=(不定芽致死數(shù)/總芽數(shù))×100%。

1.2.5 紫茉莉耐鹽突變體的篩選 用合適劑量的EMS誘變紫茉莉的不定芽,然后接種到增殖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)30 d后切取不定芽，將其接種到含適當(dāng)濃度NaCl的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)。切割生根的不定芽,在含鹽或不含鹽的培養(yǎng)基中反復(fù)培養(yǎng),進(jìn)而獲得耐鹽能力較強(qiáng)的紫茉莉突變體。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長(zhǎng)物質(zhì)對(duì)紫茉莉不定芽誘導(dǎo)的影響

為了獲得紫茉莉不定芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基,分別對(duì)接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中莖段不定芽的分化情況進(jìn)行觀察分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,莖段均可產(chǎn)生不定芽,但不定芽產(chǎn)生的數(shù)量和速度存在明顯的差異。根據(jù)形態(tài)觀察和不定芽數(shù)量統(tǒng)計(jì)的結(jié)果,在MS+1.0 mg/L KT+0.05 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基中,紫茉莉不定芽誘導(dǎo)的效果較好，并且獲得的不定芽在MS+2.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中增殖迅速。

2.2 植物生長(zhǎng)物質(zhì)對(duì)紫茉莉不定芽生根的影響

通過(guò)對(duì)不定芽生根情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析可以發(fā)現(xiàn),紫茉莉比較容易生根,在所設(shè)計(jì)的生根培養(yǎng)基中,不定芽均可生根,但效果存在一定的差異。其中添加0.3 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基更適于不定芽的生根,在此培養(yǎng)基中,不定芽生根效果明顯,根數(shù)量較多,并且比較粗壯。

2.3 紫茉莉離體再生體系的建立

將紫茉莉莖段接種入MS中培養(yǎng)30 d,可觀察到在莖段的葉腋部位有明顯的芽抽出。將產(chǎn)生的芽接種到MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)30 d,芽生長(zhǎng)旺盛,獲得無(wú)菌苗(圖1A)。切取莖段,將其接種到MS+1.0 mg/L KT+0.05 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基進(jìn)行不定芽誘導(dǎo),30 d后莖段上產(chǎn)生了明顯的不定芽(圖1B)。將不定芽轉(zhuǎn)入MS+2.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)30 d,不定芽數(shù)量快速增加,成簇分布(圖1C)。切割不定芽,將其接種入MS+2.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中進(jìn)行連續(xù)繼代培養(yǎng),不定芽繼續(xù)增多增大(圖1D～圖1E)。選取不定芽,將其接入MS培養(yǎng)基進(jìn)行壯苗培養(yǎng)30 d,不定芽生長(zhǎng)迅速(圖1F)。將壯苗培養(yǎng)后的不定芽接種入MS+0.3 mg/L NAA培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo),30 d后在不定芽基部產(chǎn)生了大量的根(圖1G)。將再生植株進(jìn)行栽培,在適宜條件下,紫茉莉生長(zhǎng)十分旺盛(圖1H)。

A：培養(yǎng)30 d的莖段; B：分化培養(yǎng)30 d的莖段; C：增殖培養(yǎng)30 d的不定芽; D：繼代培養(yǎng)2周的不定芽; E：連續(xù)繼代培養(yǎng)的不定芽; F：不定芽的壯苗培養(yǎng); G：生根誘導(dǎo)30 d后的再生植株; H：移栽后生長(zhǎng)的紫茉莉。

2.4 鹽脅迫對(duì)紫茉莉不定芽生長(zhǎng)的影響

將紫茉莉的不定芽接種到含鹽的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行垂直培養(yǎng),30 d后觀察各培養(yǎng)基中不定芽的生根情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：對(duì)照組的不定芽生長(zhǎng)旺盛,產(chǎn)生的根較多(圖2A)；當(dāng)NaCl濃度為50～100 mmol/L時(shí),不定芽的生長(zhǎng)情況和對(duì)照類似(圖2B～圖2C)；當(dāng)NaCl濃度達(dá)到150 mmol/L時(shí),不定芽的生長(zhǎng)受到了一定的抑制,只有部分不定芽可以生根,并且根的數(shù)量有所減少(圖2D)；當(dāng)NaCl濃度為175 mmol/L時(shí),不定芽的生長(zhǎng)受到了明顯的抑制,大多數(shù)不定芽難以生根(圖2E)；當(dāng)NaCl濃度為200 mmol/L時(shí),不定芽的生長(zhǎng)受到了嚴(yán)重抑制,基部開始褐化,沒(méi)有根產(chǎn)生(圖2F)；當(dāng)NaCl濃度為250 mmol/L時(shí),部分不定芽已經(jīng)枯萎,基部褐化嚴(yán)重,無(wú)根產(chǎn)生(圖2G)；當(dāng)NaCl濃度為300 mmol/L時(shí),不定芽逐漸枯萎,基部褐化腐爛(圖2H)。因此，含175～200 mmol/L NaCl的培養(yǎng)基可以用來(lái)進(jìn)行紫茉莉耐鹽突變體的篩選。

2.5 紫茉莉不定芽的EMS誘變

將紫茉莉的不定芽利用不同劑量的EMS進(jìn)行處理,結(jié)果如圖3A所示。當(dāng)EMS誘變3 h時(shí),對(duì)照組的不定芽生長(zhǎng)正常;經(jīng)0.2%～1.0% EMS處理的不定芽的生長(zhǎng)情況與對(duì)照組相似。當(dāng)EMS誘變4 h時(shí),經(jīng)0.2%～0.8% EMS處理的不定芽的生長(zhǎng)情況與對(duì)照組無(wú)明顯差異;而經(jīng)1.0% EMS處理的不定芽的生長(zhǎng)受到了一定的抑制,致死率接近7%。當(dāng)EMS誘變5 h時(shí),經(jīng)0.6% EMS處理的不定芽的致死率大約為17%;經(jīng)0.8% EMS處理的不定芽的生長(zhǎng)明顯被抑制,致死率大約為40%;而經(jīng)1.0% EMS處理的不定芽的生長(zhǎng)受到了嚴(yán)重抑制,部分不定芽干枯,致死率接近100%；當(dāng)EMS誘變6 h時(shí),經(jīng)0.8% EMS處理的不定芽的致死率大約為50%；當(dāng)EMS誘變7 h時(shí),經(jīng)0.6% EMS處理的不定芽的致死率大約為55%,同樣接近半數(shù)致死率(圖3B)；當(dāng)EMS誘變處理8 h時(shí),不定芽受到的抑制作用明顯增強(qiáng),其中0.6% EMS處理的不定芽的致死率超過(guò)了60%；0.8% EMS處理的不定芽的致死率提高到75%;1.0% EMS處理的大部分不定芽褐化干枯,致死率達(dá)到了100%。紫茉莉不定芽致死率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,EMS誘變不定芽的合適劑量為0.8%(處理6 h)或0.6%(處理7 h)。

A～H：紫茉莉不定芽分別在含0、50、100、150、175、200、250、300 mmol/L NaCl的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根的情況。

A：紫茉莉不定芽經(jīng)EMS處理后致死率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；EMS處理時(shí)間分別為3、4、5、6、7、8 h;EMS處理濃度分別為0.0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%。B：EMS處理7 h時(shí)不定芽的生長(zhǎng)情況；EMS濃度分別為0.0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%。

2.6 紫茉莉耐鹽突變體的篩選

將0.8% EMS處理6 h后的不定芽進(jìn)行增殖培養(yǎng),接著轉(zhuǎn)入含175 mmol/L NaCl的培養(yǎng)基中垂直培養(yǎng)14 d,和對(duì)照相比,誘變后的不定芽生長(zhǎng)更迅速(圖4A和圖4D)。將不定芽轉(zhuǎn)入相同的含鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng),誘變后不定芽的生根效果明顯優(yōu)于對(duì)照(圖4B和圖4E)。將經(jīng)175 mmol/L NaCl篩選后的不定芽切割后轉(zhuǎn)入含200 mmol/L NaCl的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),連續(xù)繼代2次,結(jié)果表明：對(duì)照組不定芽的生長(zhǎng)受到了嚴(yán)重抑制,難以生根;而誘變處理的不定芽的生長(zhǎng)較好,部分不定芽可誘導(dǎo)產(chǎn)生明顯的根(圖4C和圖4F)。

將篩選后的不定芽接種到錐形瓶中培養(yǎng)30 d,當(dāng)培養(yǎng)基中不含NaCl時(shí),對(duì)照和誘變處理的不定芽均可誘導(dǎo)生根,沒(méi)有明顯的區(qū)別(圖4G)。但當(dāng)培養(yǎng)基中添加200 mmol/L NaCl時(shí),對(duì)照的不定芽的生長(zhǎng)受到了嚴(yán)重抑制,無(wú)根產(chǎn)生;而誘變處理的不定芽則可產(chǎn)生明顯的根,生長(zhǎng)較好,具有較強(qiáng)的耐鹽能力(圖4H)。

A：在含175 mmol/L NaCl培養(yǎng)基中垂直培養(yǎng)14 d的不定芽; B：在含175 mmol/L NaCl培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)的不定芽; C：在含200 mmol/L NaCl培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)2次的不定芽; D：經(jīng)EMS誘變后,在含175 mmol/L NaCl培養(yǎng)基中垂直培養(yǎng)14 d的不定芽; E：經(jīng)EMS誘變后,在含175 mmol/L NaCl培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)的不定芽; F：經(jīng)EMS誘變后,在含200 mmol/L NaCl培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)2次的不定芽; G：在不含NaCl的培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d的不定芽; H：在含200 mmol/L NaCl的培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d的不定芽。

3 討論

污染土壤的植物修復(fù)在傳統(tǒng)上主要依賴于從污染環(huán)境中尋找超富集植物,這限制了植物修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展[15]。利用誘變技術(shù)選育具有高生物量的超富集植物,是開發(fā)和利用植物修復(fù)技術(shù),進(jìn)行污染土壤凈化的有效新途徑[16]。EMS是一種可以改變DNA結(jié)構(gòu)的烷化劑,可對(duì)植物的某一特殊性狀進(jìn)行改良[17,18]。紫茉莉適應(yīng)性強(qiáng),生長(zhǎng)迅速,生物量大,是一種較為理想的污染土壤的修復(fù)植物[19]。但野生紫茉莉?qū)ξ廴就寥赖男迯?fù)能力仍需進(jìn)一步提高。將EMS誘變與植物離體培養(yǎng)相結(jié)合,變異不僅包括培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的體細(xì)胞無(wú)性系變異,還包括誘變處理產(chǎn)生的新變異,從而可以極大地拓寬變異譜[11]。EMS離體誘變還可以選擇具有抗性的突變體,加快誘變育種進(jìn)程,能夠在較短時(shí)間內(nèi)創(chuàng)造出更有價(jià)值的新品種[20]。目前,通過(guò)EMS誘變改良紫茉莉生物性狀的研究尚未見報(bào)道。我們將離體培養(yǎng)和誘變技術(shù)相結(jié)合,試圖篩選出耐鹽能力強(qiáng)的紫茉莉新品系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在紫茉莉離體再生的過(guò)程中,MS+1.0 mg/L KT+0.05 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基適合莖段不定芽的誘導(dǎo)。對(duì)照各培養(yǎng)基的成分發(fā)現(xiàn),在NAA和KT存在的情況下,添加TDZ對(duì)不定芽誘導(dǎo)的效果較好,顯示TDZ可能在不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中十分重要,但仍需和其他植物生長(zhǎng)物質(zhì)協(xié)同作用。6-BA可促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化,有利于不定芽的誘導(dǎo)和增殖，因此,在MS培養(yǎng)基中添加2.0 mg/L 6-BA對(duì)紫茉莉不定芽的增殖效果較好。紫茉莉的生根能力極強(qiáng),不同類型的培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)產(chǎn)生不定根,而當(dāng)在MS培養(yǎng)基中添加0.3 mg/L NAA時(shí),不定根的形成效果更佳,表明一定濃度的NAA更有利于促進(jìn)紫茉莉不定根的形成。通過(guò)分析影響不定芽分化和生根誘導(dǎo)的因素,本研究建立了比較高效穩(wěn)定的紫茉莉離體再生體系,從而使紫茉莉離體誘變成為可能。

鹽脅迫是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要環(huán)境因素之一,高鹽度可導(dǎo)致植物生長(zhǎng)緩慢、產(chǎn)量降低甚至死亡[21]。通過(guò)分析鹽脅迫對(duì)紫茉莉不定芽生長(zhǎng)的影響可以發(fā)現(xiàn),隨著鹽濃度的提高以及處理時(shí)間的延長(zhǎng),紫茉莉不定芽表現(xiàn)出越來(lái)越明顯的鹽害癥狀。當(dāng)NaCl濃度為175 mmol/L時(shí),不定芽的生長(zhǎng)受到了明顯的抑制,生根效果極差；當(dāng)NaCl濃度達(dá)到200 mmol/L時(shí),不定芽的生長(zhǎng)受到了嚴(yán)重的抑制,基部開始褐化,沒(méi)有根產(chǎn)生,因此該濃度可作為紫茉莉耐鹽突變體的篩選濃度。為了獲得更多的耐鹽突變體,在實(shí)際篩選過(guò)程中,NaCl濃度可設(shè)定為175～200 mmol/L。通過(guò)分析EMS誘變對(duì)紫茉莉不定芽生長(zhǎng)的影響可以看出,不定芽生長(zhǎng)對(duì)EMS表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。低濃度的EMS對(duì)不定芽的生長(zhǎng)沒(méi)有影響,甚至有一定的促進(jìn)作用;高濃度的EMS則對(duì)不定芽的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。此外,EMS處理時(shí)間越長(zhǎng),對(duì)不定芽的影響也越大。在36種處理組合中,比較適合紫茉莉不定芽誘變的條件為:0.8% EMS處理6 h或0.6% EMS處理7 h,此時(shí)不定芽的致死率大約為50%,適合不定芽的誘變處理。通過(guò)合適劑量的EMS誘變和175～200 mmol/LNaCl的反復(fù)耐鹽篩選,初步獲得了具有抗性的紫茉莉耐鹽突變體。本研究結(jié)果可以為下一步通過(guò)EMS誘變技術(shù)定向篩選生物修復(fù)能力強(qiáng)的紫茉莉新品系提供參考，對(duì)今后利用紫茉莉進(jìn)行污染土壤的修復(fù)具有重要意義。