◆作者：鄧秉釗 潘綺雯 肖田安 林海丹

◆單位：廣東省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心

亞硫酸氫鈉甲奈醌粉是一種維生素類藥物，常用于飼料添加劑領(lǐng)域，其止血功能可縮短凝血時(shí)間，減少動(dòng)物的死亡率，用于輔助治療水產(chǎn)動(dòng)物的出血及敗血癥，并有利于畜禽胚胎的形成，從而提高幼崽的存活率。目前收載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2017年版）化學(xué)藥品卷中。原標(biāo)準(zhǔn)中含量測定項(xiàng)的檢測方法比較繁瑣，供試品需用三氯甲烷萃取三次后，再采用紫外分光光度法測定，容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差較大，且三氯甲烷毒性較強(qiáng)。本方法優(yōu)化考察將采用高效液相法測定，分離效能和靈敏度都比較高，重現(xiàn)性好，能夠有效反映測定方法對待測成分的專屬性，簡化提取處理，供試品只需用水溶解稀釋處理后再進(jìn)樣上機(jī)測定即可。本法能為亞硫酸氫鈉甲萘醌粉（維生素K3）的質(zhì)量控制提供可靠檢測依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

甲醇（HPLC）、磷酸二氫鈉（AR）、亞硫酸氫鈉（AR）；亞硫酸氫鈉甲萘醌原料（湖北振華化學(xué)股份有限公司，98.0%）、淀粉輔料(秦皇島驪驊淀粉有限公司)、1%亞硫酸氫鈉甲萘醌粉（廣州白云山寶神動(dòng)物保健品有限公司，批次180903），甲萘醌對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100029-201811，99.7%）。

1.2 儀器

高效液相色譜儀Agilent1260、高效液相色譜儀Waters e2695、紫外分光光度計(jì)-島津UV2700、電子天平Sartorius SECVRA225D-1CN SQP精度0.01 mg。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.015 mol/L磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.8）（30∶70）為流動(dòng)相；檢測波長為230 nm；進(jìn)樣量為20μL；按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，其結(jié)果乘以1.918，即得。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

甲萘醌對照品10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，用5 mL甲醇溶解，加入10%亞硫酸氫鈉溶液5 mL，振搖1 min，加水稀釋至刻度，精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

取亞硫酸氫鈉甲萘醌粉適量（約相當(dāng)于亞硫酸氫鈉甲萘醌5 mg），精密稱定，置250 mL量瓶中，加水適量，振搖使亞硫酸氫鈉甲萘醌溶解，加入10%亞硫酸氫鈉溶液1 mL，并用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 專屬性與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取甲萘醌對照品溶液、空白試劑、1%亞硫酸氫鈉溶液，按2.1的色譜條件進(jìn)行分析，空白試劑和亞硫酸氫鈉均對測定結(jié)果無影響。理論塔板數(shù)按甲萘醌峰計(jì)算為8600（見圖1至圖3）。

圖1 空白試劑色譜圖

圖3 甲萘醌對照品溶液色譜圖

2.4 峰純度和波長的確定

取對照品溶液，按2.1的色譜條件進(jìn)行分析，以DAD檢測器在200至400 nm波長處記錄色譜圖，其純度因子在計(jì)算出的閾值限值內(nèi)，說明其為單一物質(zhì)，未包裹共流出物；另外，在230 nm的波長處有最大吸收，故選擇230 nm為檢測波長，檢測靈敏度較高（見圖4）。

圖4 對照品溶液甲萘醌峰的純度及光譜數(shù)據(jù)圖

2.5 回收率試驗(yàn)

按處方比例配制1%的亞硫酸氫鈉甲萘醌粉，取1.1中已知含量的原料約16mg、20mg、24mg及各約2 g的輔料分別置200 mL量瓶中，制成制劑標(biāo)示量的80%、100%、120%三個(gè)濃度的樣品，各3份，按含量測定項(xiàng)下的色譜條件和方法(進(jìn)樣量為5 μL)，進(jìn)行測定。結(jié)果表明，回收率限度符合要求（限度要求為92%~105%），并與原標(biāo)準(zhǔn)UV法測定回收率結(jié)果對比（見表1）。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6 線性關(guān)系

取6個(gè)濃度的甲萘醌對照品溶液，按2.1的色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖，以對照品溶液濃度的對數(shù)值與相應(yīng)的峰面積對數(shù)值計(jì)算線性回歸方程。結(jié)果表明，在0.001～0.100mg/mL范圍內(nèi)，峰面積的常用對數(shù)與進(jìn)樣量濃度的常用對數(shù)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程。（見表2和圖5）?；貧w方程為:

圖5 甲萘醌標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 線性試驗(yàn)結(jié)果

圖2 1%亞硫酸氫鈉溶液色譜圖

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取1%亞硫酸氫鈉甲萘醌粉，按2.2.2制備6份供試品溶液，再按2.1的色譜條件進(jìn)行分析，各測定一次，計(jì)算含量［本次試驗(yàn)使用的高效液相色譜儀：Waters e2695（色譜柱：Waters C18 5μm 4.6×150 mm Columu）］。結(jié)果表明，本法的重復(fù)性良好（見表3）。

2.8 中間精密度試驗(yàn)

取1%亞硫酸氫鈉甲萘醌粉，按2.2.2制備6份供試品溶液，再按2.1的色譜條件進(jìn)行分析，各測定一次，計(jì)算含量，然后與2.7比較，本次試驗(yàn)另選時(shí)間，使用高效液相色譜儀Agilent 1260（色譜柱：Gemini 5u-C18-110A 150×4.60 mm5 micron）。結(jié)果表明，本法的中間精密度良好（見表3）。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果及中間精密度試驗(yàn)結(jié)果比較

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1%亞硫酸氫鈉甲萘醌粉（廣州白云山寶神動(dòng)物保健品有限公司，批次180903），按2.1的色譜條件進(jìn)行分析，供試品溶液分別放置0、1、2、4、8、24 h后，再分別測定峰面積。結(jié)果表明，柱溫設(shè)置為25℃時(shí)，在24 h內(nèi)穩(wěn)定（見表4）。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.10 耐用性

試驗(yàn)條件按2.1的色譜條件進(jìn)行分析（色譜柱為Waters C18 5μm 4.6×150 mm Columu；柱溫為35℃；流動(dòng)相為甲醇-pH 4.8的0.015 mol/L磷酸二氫鈉溶液（30∶70）。

2.10.1 柱溫

將柱溫調(diào)節(jié)為15℃、20℃、25℃、30℃、35℃，結(jié)果顯示，甲萘醌的峰隨柱溫的升高，保留時(shí)間減少，柱溫為25℃時(shí)的出峰時(shí)間為3.7 min比較合適。

2.10.2 流動(dòng)相比例

將流動(dòng)相磷酸二氫鈉溶液和甲醇的比例調(diào)節(jié)為21∶79、30∶70、39∶61，結(jié)果顯示，甲萘醌的峰隨甲醇比例升高，保留時(shí)間減少，而流動(dòng)相中甲醇比例越低，峰寬越大，出峰時(shí)間越長，導(dǎo)致峰型越差，以甲醇：磷酸二氫鈉溶液（30∶70）為流動(dòng)相時(shí)的出峰時(shí)間為3.7 min比較合適。

2.10.3 流動(dòng)相pH值

將流動(dòng)相中磷酸二氫鈉溶液的pH調(diào)節(jié)為4.0、4.8、5.6，結(jié)果顯示，鹽溶液組分的pH值越低，出峰時(shí)間增長，而pH值在4.8~5.6范圍內(nèi)，出峰時(shí)間變化不大。

2.10.4 不同色譜柱

考察不同C-18柱，（Waters C18 5μm4.6×150 mm Columu；Gemini 5u-C18-110A 150×4.60 mm5 micron）的影響。結(jié)果顯示，不同色譜柱，甲萘醌峰的拖尾因子基本相同。

3 討論

3.1 本方法具有簡便、安全、快捷特點(diǎn)，極大提高工作效率，節(jié)約人力物力。經(jīng)試驗(yàn)，靈敏度、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性高，回收率合理，各參數(shù)結(jié)果符合規(guī)定，方法可行，可為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

3.2 甲萘醌具有高度的疏水性，無法用水溶解，所以配制對照品溶液時(shí)需要先用5 mL的甲醇溶解；亞硫酸氫鈉甲萘醌易溶于水，所以可以直接用水溶解處理；但二者均遇光不穩(wěn)定，所以需要加入少量亞硫酸氫鈉溶液，及避光操作。

3.3 亞硫酸氫鈉甲萘醌在水溶液中存在如下化學(xué)平衡：亞硫酸氫鈉可促使平衡向左移動(dòng)，在供試液中，加有少量的亞硫酸氫鈉，可保證測定結(jié)果的穩(wěn)定可靠（見圖6）。

圖6 亞硫酸氫鈉甲萘醌化學(xué)平衡

3.4 亞硫酸氫鈉甲萘醌與甲萘醌之間的轉(zhuǎn)換系數(shù)為：1 mg的甲萘醌相當(dāng)于1.918 mg的亞硫酸氫鈉甲萘醌。