王蘋 趙明娟 崔鴻博

(北京市懷柔區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心 101400）

1%雞紅細(xì)胞懸液是采用血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)檢測新城疫病毒、禽流感病毒、禽腺病毒Ⅲ群（減蛋綜合征病毒）、傳染性支氣管炎病毒等病原微生物血凝抑制抗體的重要試劑[1]，紅細(xì)胞的凝集狀態(tài)直接影響試驗(yàn)結(jié)果的判定，不同條件下、不同濃度、不同保存方法都會影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[2-4]。因此，準(zhǔn)確配制及合理保存紅細(xì)胞懸液是保證試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的一項(xiàng)重要環(huán)節(jié)。在基層實(shí)驗(yàn)室，送檢的每份雞血清樣品一般需檢測新城疫、禽流感病毒H7亞型、禽流感病毒H5亞型（Re-11 株）、禽流感病毒H5亞型（Re-12 株）4 種抗體效價，每份水禽血清樣品也需檢測禽流感病毒H7亞型、禽流感病毒H5亞型（Re-11 株）、禽流感病毒H5亞型（Re-12 株）3種抗體效價。由于檢測種類多，檢測樣品數(shù)量大，不可能一天完成，但如果每次試驗(yàn)都重新制備1%紅細(xì)胞懸液會增加工作量，因此，實(shí)驗(yàn)室檢測人員一般都選擇一次制備足夠一批次檢測試驗(yàn)所需量的1%紅細(xì)胞懸液，于4℃保存，分批次使用。筆者通過試驗(yàn)觀察1%紅細(xì)胞懸液在4℃環(huán)境下保存時間對新城疫及禽流感血凝抑制試驗(yàn)抗原效價的影響，確定了最佳保存時間，僅為廣大基層實(shí)驗(yàn)室檢測人員提供參考。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計

采用自制1%雞紅細(xì)胞懸液，分別測定雞新城疫血凝抑制試驗(yàn)抗原、禽流感病毒H7亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原、禽流感病毒H5亞型（Re-11 株）血凝抑制試驗(yàn)抗原、禽流感病毒H5亞型（Re-12 株）血凝抑制試驗(yàn)抗原4 種抗原效價，每種抗原每次試驗(yàn)設(shè)4 個重復(fù)，分別記錄1%雞紅細(xì)胞懸液在4℃環(huán)境下保存1、2、3、4、5、6、7d 時測定的4 種抗原效價，每種抗原用PBS 稀釋后分裝成小份，于-20℃保存，每次試驗(yàn)取一份檢測其效價。

1.2 試驗(yàn)儀器設(shè)備

12 道多道移液器（5～50μl），單道移液器（5～50μl），一次性吸頭，冷藏柜（4℃）、微量振蕩器、90。一次性微量反應(yīng)板、一次性加樣槽。

1.3 試驗(yàn)試劑

新城疫血凝抑制試驗(yàn)抗原（哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，生產(chǎn)批號：20180824），禽流感病毒H7亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原（哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，生產(chǎn)批號：2019006），禽流感病毒H5亞型（Re-11 株）血凝抑制試驗(yàn)抗原（哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，生產(chǎn)批號：2019006），禽流感病毒H5亞型（Re-12 株）血凝抑制試驗(yàn)抗原（哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，生產(chǎn)批號：2019006），1×PBS緩沖液 (pH7.2～7.4，0.01mol/L)（HyClone，產(chǎn)品有效期至：2020 年8 月），紅細(xì)胞保存液（Solarbio，生產(chǎn)批號：20190328），1%雞紅細(xì)胞懸液（自制）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 1%紅細(xì)胞懸液制備

（1）于50ml 潔凈的無菌帶蓋離心管中加入約7ml 阿氏液，用5mL 一次性無菌注射器從翅靜脈處采集3～10 周齡SPF 雞(最少兩只) 血約5ml，與阿氏液于離心管中輕輕混合均勻。

（2）加入3～4 倍體積的PBS 混勻，以1800r/min 離 心8min，棄上清液和沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，重復(fù)以上過程，反復(fù)洗滌3 次(洗凈血漿和白細(xì)胞)。

（3）最后吸取1 倍體積(ml) 的紅細(xì)胞，加入99 倍體積(ml) 的PBS，均勻混合，分裝于50ml 三角瓶中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 血凝（HA）試驗(yàn)操作步驟

（1）取90。一次性微量反應(yīng)板，用微量移液器在1～12 孔均加入0.025ml PBS，換吸頭。

（2）吸取0.025ml 病毒懸液加入第1 孔，吹打3～5 次充分混勻。

（3）從第1 孔吸取0.025ml 混勻后的病毒液加入第2 孔，混勻后吸取0.025ml 加入第3 孔，如此進(jìn)行對倍稀釋至第11孔，從第11 孔吸取0.025ml 棄之，設(shè)第12 孔為PBS 對照。

（4）每孔再加入0.025ml PBS。

（5）每孔再加入0.025ml 體積分?jǐn)?shù)為1%雞紅細(xì)胞懸液。

（6）震蕩均勻，在室溫20～25℃下靜置約40min，PBS 對照孔的紅細(xì)胞呈明顯的紐扣狀沉到孔底時判定結(jié)果。

（7）結(jié)果判定：將板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無呈淚滴狀流淌。完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀釋倍數(shù)代表一個血凝單位（HAU）。

1.4.3 回歸試驗(yàn)操作步驟[5]

（1）取90。一次性微量反應(yīng)板，用微量移液器在1～4 孔均加入0.025ml PBS，換吸頭。

（2）吸取0.025ml 配制好的4HAU 病毒懸液加入第1 孔，吹打3～5 次充分混勻。

（3）從第1 孔吸取0.025ml 混勻后的病毒液加入第2 孔，混勻后吸取0.025ml 加入第3 孔，如此進(jìn)行對倍稀釋至第4 孔，從第4 孔吸取0.025ml 棄之。

（4）每孔再加入0.025ml 體積分?jǐn)?shù)為1%雞紅細(xì)胞懸液。

（5）輕輕均勻，在室溫20～25℃下靜置約40min 后觀察結(jié)果。

（6）結(jié)果判定：將板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無呈淚滴狀流淌。第1 孔、第2 孔完全血凝（不流淌）則抗原配制正確，否則應(yīng)重新測定抗原血凝效價。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)結(jié)果

測定的效價分別用回歸試驗(yàn)檢測，顯示結(jié)果準(zhǔn)確，查看附表。

附表 1%紅細(xì)胞懸液在4℃保存1～7d 時血凝試驗(yàn)檢測抗原效價結(jié)果

2.2 結(jié)果分析

試驗(yàn)結(jié)果顯示，1%紅細(xì)胞懸液在4℃保存第6 天開始出現(xiàn)溶血，靜置后的上清液由無色透明狀出現(xiàn)淺粉紅色，測定各種血凝抑制試驗(yàn)抗原的效價開始下降。因此，在開展血凝和血凝抑制試驗(yàn)時，為保證試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，1%雞紅細(xì)胞懸液在4℃最多可保存5d，過期則不能使用。

3 討論

3.1 紅細(xì)胞懸液保存時間

由試驗(yàn)結(jié)果可知，制備好的紅細(xì)胞懸液在4℃環(huán)境下保存5d 時，測得的抗原效價基本一致，不影響使用效果；第6 天抗原效價開始下降，說明紅細(xì)胞懸液開始溶血，濃度開始下降，不能繼續(xù)使用。

3.2 影響試驗(yàn)結(jié)果的因素

血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)是新城疫和高致病性禽流感診斷技術(shù)之一[6,7]，4 單位病毒配制的準(zhǔn)確性、抗原反復(fù)凍融次數(shù)、稀釋液pH、被檢血清狀態(tài)、1%紅細(xì)胞懸液配制方法、試驗(yàn)耗材、儀器設(shè)備、環(huán)境溫度、檢測人員操作手法等因素都會對試驗(yàn)結(jié)果造成影響[8]，因此，整個試驗(yàn)的每個環(huán)節(jié)都應(yīng)嚴(yán)格按照操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，盡量減少試驗(yàn)誤差。

3.3 紅細(xì)胞懸液配制過程中的注意事項(xiàng)

采集的血液與阿氏液混合時應(yīng)將血液沿離心管壁緩慢注入，不能直接垂直打入；在洗滌紅細(xì)胞過程中，離心機(jī)轉(zhuǎn)速不要超過2000r/min，每次混勻操作動作要輕，避免劇烈震蕩，否則易造成紅細(xì)胞的破裂，造成溶血。

3.4 紅細(xì)胞懸液保存注意事項(xiàng)

制備好的1%紅細(xì)胞懸液于4℃保存時，最好分裝成小份，每份僅供一次試驗(yàn)使用，避免反復(fù)冷藏及回溫，減少紅細(xì)胞破裂，延長保存時間。