楊超， 劉貝，魏微，胡芬， 姚洋，孫志華

(湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院， 襄陽市中心醫(yī)院 腫瘤科，襄陽 441000)

腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophage，TAM)是指浸潤于腫瘤間質(zhì)中的巨噬細胞(macrophage, M)[1]。TAM長期在腫瘤微環(huán)境下會逐漸形成獨特的表型，同時在功能上也會發(fā)生明顯改變。根據(jù)活化狀態(tài)和功能，TAM可以分為M1和M2型[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，在人類常見的多種腫瘤中，TAM隨腫瘤發(fā)展而逐漸以M2型為主，M2型巨噬細胞(M2 macrophage，M2-M)更有助于腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[4-6]。因此，有效調(diào)控腫瘤微環(huán)境中的TAM表型有望成為腫瘤治療的方向之一。肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)是M2-TAM在腫瘤微環(huán)境中分泌的一種重要的細胞因子[7]。為了解在非小細胞肺癌中HGF以及M2-TAM的作用，本研究探討了HGF及其上游靶基因miR-142-5p在以M2-TAM為主的非小細胞肺癌中的功能，同時驗證M2-TAM對非小細胞肺癌的促生長和轉(zhuǎn)移作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑小鼠RAW264.7巨噬細胞和小鼠肺癌Lewis細胞由襄陽市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗中心保存，10% FBS、青霉素和鏈霉素購自Invitrogen公司，RPMI 1640和DMEM培養(yǎng)液購自Life Technologies公司，Transwell小室、培養(yǎng)板購自Corning公司，TRIzol RNA提取試劑盒、Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司，RNA純化試劑盒和RT-PCR試劑盒購自QIAGEN公司，ELISA試劑盒購自聯(lián)科生物公司，CCK-8、PBS和RIPA裂解緩沖液購自Beyotime Biotechnology公司，ELISA檢測儀購自Thermo公司，IL-4購自Sigma公司，Matrigel購自Bio-Rad公司，熒光素酶活性檢測試劑盒以及HGF-Wt和HGF-Mut質(zhì)粒購自Promega 公司，si-HGF (EMU037921-20UG)購自Sigma-Aldrich公司。抗鼠CD206-PE抗體和CD163-FITC抗體購自BD Pharmingen公司。FACSCallibur流式細胞儀購自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞共培養(yǎng) 將1×105個/mL的小鼠M和肺癌Lewis細胞均分別接種到含10%滅活FBS的完全RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、 5%CO2完全飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，取處于對數(shù)生長期的細胞進行試驗。采用100 μg/mL的IL-4在體外將M誘導(dǎo)成為M2-M，通過Transwell系統(tǒng)將M與小鼠肺癌Lewis細胞共培養(yǎng)，得到M2-TAM和普通TAM。

1.2.2miR-142-5p、CD206、CD163和HGFmRNA表達的RT-PCR檢測 取上述收集到的細胞，按照TRIzol試劑使用說明書抽提總RNA，采用Thermo NanoDrop 2000分光光度計檢測其濃度和純度，并采用Agilent-2100凝膠電泳系統(tǒng)檢測總RNA的完整性。應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計引物(表1)，以GADPH為內(nèi)參。引物由TaKaRa公司合成。將TRIzol法提取得到的2組細胞總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s，共45個循環(huán)。同時擴增各個樣本的目的基因和內(nèi)參基因，每組細胞設(shè)計3個重復(fù)孔。通過GAPDH基因水平校正，采用2-ΔΔCt分析法檢測CD206、CD163、miR-142-5p和HGFmRNA的相對表達量。

表1 試驗所用的引物序列

1.2.3 CD206、CD163的FACS檢測 分別采用PE標記抗CD206，F(xiàn)ITC標記抗CD163單抗處理細胞，F(xiàn)ACS檢測細胞表面CD206和CD163的表達，試驗重復(fù)3次，采用Cellquest軟件分析結(jié)果。

1.2.4 HGF、TGF-β、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和IL-10的ELISA檢測 將處于對數(shù)生長期的各組細胞接種至6孔板，每組重復(fù)4個孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細胞上清液，以4 ℃ 1 000×g離心10 min。取離心后的上清液，采用ELISA檢測HGF、TGF-β、VEGF、IL-10的水平。

1.2.5 miR-142-5p和HGF靶向關(guān)系的驗證 合成含有熒光素酶基因的HGF野生型質(zhì)粒(HGF-Wt)和突變型質(zhì)粒(HGF-Mut)。用dual-luciferase reporter assay system (Promega公司)實施熒光素酶報告基因檢測試驗。將HGF-Wt或HGF-Mut與miR-142-5p模擬物(miR-142-5p mimic)或陰性對照物(NC mimic)共轉(zhuǎn)染M2-TAM。轉(zhuǎn)染48 h后測定熒光素酶活性。所有試驗一式3份，重復(fù)3次。

1.2.6 細胞轉(zhuǎn)染 將M2-TAM以1×105個/孔密度接種于12孔板，孵育24 h，待細胞生長穩(wěn)定后進行轉(zhuǎn)染。將M2-TAM隨機分組，采用miR-142-5p模擬物(miR-142-5p mimic)和抑制劑(miR-142-5p inhibitor)構(gòu)建M2-TAM-miR-142-5p過表達和低表達細胞模型及相應(yīng)對照組，采用si-HGF和si-NC轉(zhuǎn)染M2-TAM以構(gòu)建M2-TAM-HGF低表達細胞模型。

1.2.7 M2-TAM對小鼠肺癌Lewis細胞增殖影響的檢測 取各組細胞2×103個，接種于96孔板中。貼壁培養(yǎng)24 h后向每孔加入10 μL CCK-8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，用酶標儀測定光密度[D(450 nm)]值。分別測定細胞在轉(zhuǎn)染后0、12、24、48和72 h細胞增殖能力的變化。

2 結(jié)果

2.1 CD206、CD163在各組細胞中的表達RT-PCR和FACS檢測結(jié)果顯示，M2-TAM特異性分子標志物CD206和CD163在M2-M中的表達量明顯高于M，在M2-TAM中的表達量明顯高于TAM(P<0.001)。(表2、圖1和圖2)

表2 各組細胞CD206和CD163表達量的比較

注：A.RT-PCR檢測M、M2-M、TAM和M2-TAM中CD206 mRNA的表達；B.RT-PCR檢測M、M2-M、TAM和M2-TAM中CD163 mRNA的表達。***P<0.001。

圖2 FACS分析各組細胞中CD206和CD163的表達

2.2 miR-142-5p、HGF在各組細胞中的表達RT-PCR和ELISA檢測結(jié)果顯示，與M相比，M2-M中miR-142-5p的表達水平明顯降低(P<0.001)；與TAM相比，M2-TAM中miR-142-5p的表達水平也明顯降低 (P<0.001)。與之相反，HGF的表達水平在M2-M中顯著高于M(P<0.001)，在M2-TAM中也顯著高于TAM (P<0.001)。(圖3)

注：A.RT-PCR檢測M和M2-M中miR-142-5p的表達；B.RT-PCR檢測TAM和M2-TAM中miR-142-5p的表達；C.RT-PCR檢測M和M2-M中HGF mRNA的表達；D.RT-PCR檢測TAM和M2-TAM中HGF mRNA的表達；E.ELISA檢測M和M2-M中HGF蛋白的表達；F.ELISA檢測TAM和M2-TAM中HGF蛋白的表達。***P<0.001。

2.3 miR-142-5p和HGF的靶向關(guān)系為進一步探究HGF和miR-142-5p之間的調(diào)控機制，采用TargetScan進行分析。結(jié)果顯示，HGF的mRNA中存在與miR-142-5p相互作用的結(jié)合位點。為了驗證miR-142-5p能否與HGF結(jié)合，分別將HGF-Wt、HGF-Mut共轉(zhuǎn)染到M2-TAM中，同時進一步實施了熒光素酶報告基因檢測試驗。結(jié)果顯示，與HGF-Mut相比，miR-142-5p模擬物能顯著降低HGF-Wt報告基因質(zhì)粒的熒光素酶活性(P<0.001)。這表明miR-142-5p能與HGF的3＇UTR特異性結(jié)合。(圖4)

注：A.TargetScan分析miR-142-5p與HGF之間的結(jié)合位點；B.熒光素酶報告基因檢測試驗檢測miR-142-5p與HGF的結(jié)合關(guān)系。***P<0.001。

2.4 miR-142-5p對HGF、TGF-β、VEGF、IL-10表達的影響為進一步探究miR-142-5p與HGF之間的作用關(guān)系，采用miR-142-5p mimic和miR-142-5p inhibitor構(gòu)建M2-TAM-miR-142-5p過表達和低表達細胞模型，同時進一步采用RT-PCR和ELISA檢測各組中HGF、TGF-β、VEGF、IL-10的表達水平。結(jié)果顯示，過表達miR-142-5p 后，HGF、TGF-β、VEGF、IL-10的表達水平均下降(P<0.001)，而低表達miR-142-5p后，結(jié)果相反(P<0.001)。(圖5)

注：A.RT-PCR檢測過表達和低表達miR-142-5p后M2-TAM中miR-142-5p的表達；B.RT-PCR檢測過表達和低表達miR-142-5p后M2-TAM中HGF mRNA的表達；C.ELISA檢測過表達miR-142-5p后M2-TAM中HGF、TGF-β、VEGF、IL-10的表達；D.ELISA檢測低表達miR-142-5p后M2-TAM中HGF、TGF-β、VEGF、IL-10的表達。***P<0.001。

2.5 miR-142-5p在M2-TAM調(diào)節(jié)肺癌細胞增殖中的作用鑒于miR-142-5p對HGF的抑制作用，為進一步探究miR-142-5p對M2-TAM的作用機制，采用Transwell系統(tǒng)構(gòu)建M2-TAM-肺癌細胞共培養(yǎng)模型，通過CCK-8進一步檢測肺癌細胞增殖能力的變化。結(jié)果顯示，過表達miR-142-5p后，小鼠肺癌Lewis細胞的增殖能力明顯下降(P<0.01)；而低表達miR-142-5p后，小鼠肺癌Lewis細胞的增殖能力明顯上升(P<0.01)。(圖6)

注：A.CCK-8檢測過表達miR-142-5p后M2-TAM對小鼠肺癌Lewis細胞增殖能力的作用；B.CCK-8檢測低表達miR-142-5p后M2-TAM對小鼠肺癌Lewis細胞增殖能力的作用。**P<0.01。

2.6 HGF在M2-TAM調(diào)節(jié)肺癌細胞增殖中的作用為了研究由M2-TAM釋放的HGF對非小細胞肺癌細胞增殖的調(diào)控作用，采用HGF拮抗劑構(gòu)建HGF低表達細胞模型，并通過ELISA驗證轉(zhuǎn)染成功(P<0.001)。進一步采用CCK-8檢測HGF對小鼠肺癌Lewis細胞增殖能力的影響。結(jié)果顯示，HGF低表達后，小鼠肺癌Lewis細胞增殖能力下降(P<0.01)。(圖7)

注：A.ELISA檢測HGF拮抗劑作用后M2-TAM中HGF的表達；B.CCK-8檢測HGF低表達后M2-TAM對小鼠肺癌Lewis細胞增殖能力的作用。**P<0.01。

3 討論

M是維持機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和抵御外來病原體的重要固有免疫細胞群。然而，在腫瘤微環(huán)境中，TAM通常促進腫瘤細胞增殖、免疫抑制和血管生成，從而支持腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。通常，腫瘤中TAM的豐富與疾病預(yù)后不良有關(guān)[8]。已有多項研究證實，在膠質(zhì)瘤、卵巢癌、肝內(nèi)膽管上皮癌、肺腺癌、胰腺癌和黑色素瘤中，TAM表現(xiàn)出M2活化的表型特征，M2-TAM與腫瘤患者生存時間呈負相關(guān)[9]。本研究通過體外試驗發(fā)現(xiàn)，miR-142-5p在M2-ATM中低表達，miR-142-5p可通過靶向負調(diào)控HGF抑制非小細胞肺癌細胞的增殖。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在非小細胞肺癌中異常表達，并通過與靶基因相互作用促進或抑制腫瘤的發(fā)展。如miR-484在非小細胞肺癌中高表達，可促進癌細胞增殖和遷移[10]；miR-661在非小細胞肺癌中高表達，可通過直接靶向RUNX3在非小細胞肺癌中作為致癌基因發(fā)揮作用[11]；miR-124則通過下調(diào)SOX8抑制非小細胞肺癌細胞的增殖[12]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-142-5p在非小細胞肺癌中表達下調(diào)，且miR-142-5p可以靶向PIK3CA并通過抑制PI3K/AKt通路來抑制腫瘤的生長[13]。本研究探討了miR-142-5p在不同表型M和TAM中的表達，發(fā)現(xiàn)在M2-M和M2-TAM中，miR-142-5p的表達均顯著下調(diào)。

HGF是一種多功能細胞因子，可促進細胞增殖、遷移和細胞外基質(zhì)入侵。HGF的多種生物學(xué)功能是通過與其受體c-MET的結(jié)合來介導(dǎo)的[14]。c-MET屬于絡(luò)氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinascs，RTK)超家族成員，為原癌基因Met編碼的一類具有自主磷酸化活性的跨膜受體[15]。已有研究證明，HGF在非小細胞肺癌中高表達，且HGF/c-MET信號通路可以影響非小細胞肺癌的發(fā)展[16]。與miR-142-5p相反，HGF在M2-TAM中高表達，且在干擾HGF的表達后，M2-TAM對非小細胞肺癌細胞增殖能力的促進作用顯著減弱，進一步證實HGF在TAM與肺癌細胞增殖調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。另一方面，關(guān)于miRNA與HGF/c-MET信號通路之間的分子機制及其對肺癌發(fā)展的影響，有研究證明，miR-198可以抑制非小細胞肺癌中的HGF/c-MET信號通路來克服放療耐藥性，誘導(dǎo)細胞凋亡[17]；miR-34a通過靶向MET可以部分克服HGF介導(dǎo)的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)突變肺癌細胞對吉非替尼的耐藥[15]；miR-182通過靶向MET基因抑制肺癌細胞從上皮向間質(zhì)的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[18]。本研究通過TargetScan預(yù)測和熒光素酶報告基因檢測試驗也發(fā)現(xiàn)miR-142-5p與HGF存在堿基結(jié)合位點。過表達miR-142-5p抑制了HGF和其他M2型細胞因子TGF-β、VEGF、IL-10在M2-TAM中的表達，同時負調(diào)節(jié)了M2-TAM對非小細胞肺癌細胞增殖能力的促進作用；而低表達miR-142-5p所產(chǎn)生的作用恰好相反。此外，下調(diào)HGF的表達也負調(diào)節(jié)了M2-TAM對非小細胞肺癌細胞增殖能力的促進作用。由此可見，在M2-TAM中，miR-142-5p可能通過靶向下調(diào)HGF的表達影響HGF作用下的HGF/c-MET信號通路，從而抑制非小細胞肺癌細胞的增殖。

本研究初步探究了miR-142-5p靶向抑制HGF的表達對非小細胞肺癌細胞增殖的影響，為TAM以M2型為主的非小細胞肺癌細胞增殖的分子機制提供了一種新思路。然而，本研究尚存在不足之處，如miR-142-5p的上游機制、體外試驗的局限性等，都尚待進一步的探究和完善。