黃鐘，孫潔，姚振濱，劉冬，盧獻靈

(石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 急診內(nèi)科，石河子 832000)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是由多種病因引起的肺內(nèi)過度性、失控性炎癥反應，其最初于1967年由Ashbaugh等[1]定義。ARDS 由急性肺損傷(acute lung injury，ALI)發(fā)展而來，是重癥監(jiān)護病房常見的危重病，因病死率居高不下(30%～50%)而備受關(guān)注[2]。隨著近年來對ARDS的深入研究，發(fā)現(xiàn)感染、創(chuàng)傷等引發(fā)的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome， SIRS)是引發(fā)ALI/ARDS的主要原因。ARDS不是單一疾病，多數(shù)由直接或間接組織損傷誘發(fā)炎癥反應而引起，尤其是創(chuàng)傷和膿毒癥患者，疾病迅速進展而進入全身炎癥反應狀態(tài)，最終導致ARDS的發(fā)生[3]。

研究表明，患者肺內(nèi)大面積炎癥反應是誘發(fā)ALI/ARDS的最主要原因[4]。炎癥小體是一種存在于細胞質(zhì)中的多蛋白復合物，NOD樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain-containing protein 3, NLRP3)參與組成的炎癥小體是細胞質(zhì)中的一種大分子復合蛋白，由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和Caspase-1組成，參與機體固有免疫反應[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，激活NLRP3炎癥小體的主要途徑有：(1)細胞內(nèi)鉀離子外流[7]；(2)溶酶體破壞[8]；(3)線粒體活性氧類(reactive oxygen species， ROS)生成[9]。細胞發(fā)生氧化應激時，產(chǎn)生的ROS促進與硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)相互作用的硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)與細胞中的TRX解離，并使之與NLRP3結(jié)合，從而激活NLRP3炎癥小體及其下游信號通路[10]。

TXNIP又稱維生素D3上調(diào)蛋白1(vitamin D3 upregulated protein 1， VDUP-1)/硫氧還蛋白結(jié)合蛋白2(thioredoxin-binding protein 2，TBP-2)[11]，是體內(nèi)重要的抗氧化蛋白，它通過抑制TRX介導氧化應激反應，誘導細胞凋亡及對抗細胞增殖等[12]。氧化應激作為ALI/ARDS最主要的發(fā)病機制，是目前研究的熱點[13]，同時也是激活NLRP3炎癥小體的重要途徑。

本研究通過分析膿毒癥所致ALI/ARDS患者及健康對照者PBMC中TXNIP和NLRP3 mRNA及蛋白水平，旨在探討TXNIP/NLRP3炎癥小體通路是否在ALI/ARDS的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 收集2017年1月-2018年12月于石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院住院治療的40例膿毒癥導致ALI/ARDS患者為病例組，其中男性23例、女性17例，年齡(71.56±6.52)歲；隨機收集同期于該院進行健康體檢的40例健康者為對照組，其中男性21例、女性19例，年齡(69.23±5.30)歲，與病例組在性別和年齡上匹配。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，血液樣本及信息的收集均獲得患者的知情同意

ALI/ARDS的診斷以歐洲危重病醫(yī)學會、美國胸科學會和美國重癥醫(yī)學會于2012年制定的《急性呼吸窘迫綜合征：柏林標準》以及中華醫(yī)學會重癥醫(yī)學分會制定的《中國嚴重膿毒癥/膿毒性休克治療指南(2014)》[14]作為標準。

排除標準：伴其他肺部疾病，包括支氣管哮喘、活動性肺結(jié)核、支氣管擴張、肺囊性纖維化、肺膿腫、間質(zhì)性肺??；并發(fā)冠心病、高脂血癥、動脈粥樣硬化、肝腎疾病、腫瘤及自身免疫性疾病等。

1.1.2 試劑與儀器 人外周血淋巴細胞分離液，購自北京索萊寶科技有限公司；TRIzol 試劑，購自美國英杰生命技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自Thermo Fisher Scientific公司；RT-PCR 試劑盒，購自凱杰企業(yè)管理(上海)有限公司；TXNIP、NLRP3 及β-actinmRNA引物，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；小鼠抗人β-actin一抗、羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRG)和兔抗鼠IgG-HRG二抗， 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人TXNIP一抗，購自Abcam公司；兔抗人NLRP3一抗，購自CST公司 ；化學發(fā)光底物，購自Thermo Fisher Scientific公司。Thermo NanoDrop 2000紫外可見分光光度計，購自Thermo Fisher Scientific公司；PCR 儀，購自Thermo Hybaid公司；7500Fast RT-PCR儀，購自美國應用生物系統(tǒng)公司；高速離心機，購自Thermo Fisher Scientific公司；Western blotting電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)，購自伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 臨床治療方案及預后判斷 (1)治療方案：在治療原發(fā)病的基礎上，采用中華醫(yī)學會重癥醫(yī)學分會制定的《中國嚴重膿毒癥/膿毒性休克治療指南(2014)》建議方案治療?；颊呷朐汉罅⒓唇o予廣譜抗生素抗感染、胃黏膜保護以預防應激性潰瘍、化痰平喘、營養(yǎng)支持、電解質(zhì)酸堿平衡維持和機械通氣治療，以及可能的針對原發(fā)病的治療。同時給予患者皮下注射5 000 IU低分子肝素鈉，12 h/次，共治療7 d。(2)資料收集：所有病例組患者均于初診時詢問和記錄一般資料、臨床特點、輔助檢查結(jié)果和序貫器官衰竭估計評分(sequential organ failure assessment， SOFA)，并于確診病情且未予治療前抽取患者外周血5 mL；治療第0天(D0)、第3天(D3)、第7天(D7)再次抽取外周血并進行SOFA。(3)預后判斷：所有患者最終均完成7 d治療，其中10例患者于治療第10天死亡，3例患者于第14天死亡，其余患者均好轉(zhuǎn)并由重癥監(jiān)護病房轉(zhuǎn)移至普通病房繼續(xù)治療，其中14 例患者因病情需要，進行了經(jīng)皮氣管切開術(shù)治療。

1.2.2 研究對象外周血PBMC的分離 在潔凈試管中加入6 mL Ficoll分離液，取肝素抗凝靜脈血與等量全血稀釋液充分混勻，用滴管將混懸液沿管壁緩慢滴至分層液面上。以377×g離心15 min，取上、中層界面處白色云霧層狹窄帶細胞，轉(zhuǎn)移至含4～5 mL細胞洗滌液的試管中；充分混勻后，以107×g離心10～30 min，沉淀經(jīng)反復洗滌2次得到所需細胞樣本，于4 ℃冷藏備用。

1.2.3 PBMC中TXNIP和NLRP3 mRNA表達的qRT-PCR檢測 按TRIzol試劑操作說明書提取細胞總RNA，用紫外分光光度計檢測并記錄總RNA的濃度與純度[D(260 nm)/D(280 nm)比值在1.8～2.0者為合格]。cDNA的合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書要求進行。根據(jù)qRT-PCR試劑盒說明書，取1 μL RNA提取液反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 建立20 μL反應體系，進行qRT-PCR。反應條件：95 ℃ 2 min(1個循環(huán))，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s(40個循環(huán))，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。 以2-ΔΔCt表示目的mRNA與對照mRNA表達的倍數(shù)。(表1)

表1 引物序列

1.2.4 PBMC中TXNIP和NLRP3蛋白表達的Western blotting檢測 將全蛋白提取裂解液按Ficoll法收集至細胞沉淀中。通過二辛可寧酸(bicinchoninic acid， BCA)測定法測定蛋白質(zhì)濃度。將20 μg總蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。依次用抗TXNIP、NLRP3一抗在4 ℃條件下孵育PVDF膜過夜，然后按1∶5 000稀釋羊抗兔IgG-HRP(抗體稀釋液為5%脫脂牛奶)，1∶5 000稀釋兔抗鼠 IgG-HRP(抗體稀釋液為5%脫脂牛奶)，與PVDF膜共孵育1 h。使用超高靈敏度增強型化學發(fā)光底物顯影，曝光后使用ImageJ2x軟件分析條帶灰度。

2 結(jié)果

2.1 各組TXNIP、NLRP3mRNA與SOFA的相關(guān)性與對照組比較，病例組治療D0組、D3組和D7組SOFA評分顯著升高(P<0.05，圖1)。病例治療D0組、D3組和D7組NLRP3 mRNA表達量與SOFA呈正相關(guān)(r=0.976，P=0.004；r=0.845，P=0.005；r=0.910，P=0.032)，NLRP3 mRNA表達量與SOFA亦呈正相關(guān)(r=0.879，P=0.003；r=0.899，P=0.038；r=0.782，P=0.007)。

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 各組NLRP3及TXNIP蛋白表達水平的比較病例治療D0組、D3組和D7組NLRP3和TXNIP蛋白表達水平較對照組顯著升高(P<0.05)；病例組治療D0組較D3組和D7組NLRP3和TXNIP蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。(圖2)

注：A.NLRP3的Western blotting蛋白條帶圖； B.各組NLRP3蛋白相對表達量的統(tǒng)計分析； C.TXNIP的Western blotting蛋白條帶圖； D.各組TXNIP蛋白相對表達量的統(tǒng)計分析。與對照組比較，*P<0.05； 與D0組比較，#P<0.05。

2.3 各組NLRP3和TXNIPmRNA表達水平的比較以對照組mRNA表達量為1、2-△△Ct值為標準，計算各組NLRP3、TXNIPmRNA的相對表達量。結(jié)果顯示，病例組治療D0時NLRP3 mRNA表達量為對照組的83.22倍，D3時降至38.02倍，D7時降低至18.18倍；病例組D0時TXNIPmRNA表達量為對照組的96.15倍，D3時降至39.40倍，D7時降至29.75倍。這說明對ARDS患者的治療以NLRP3 mRNA顯著下降為主，伴TXNIPmRNA表達顯著下降，但至治療D7后仍顯著高于對照組(圖3)。

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

眾所周知，ARDS不是單因性疾病，是由直接或間接損傷導致的與肺功能急劇下降相關(guān)聯(lián)的一系列呼吸道癥候群。由于ARDS及其病因的異質(zhì)性，發(fā)病機制尚不清楚。近年來， ARDS的鑒別診斷和治療已取得了進展。

在已知的NLRP3炎癥小體激活途徑中氧化應激作為ALI/ARDS重要的發(fā)生機制，是目前的研究熱點[15-16]。課題組前期通過文獻查閱發(fā)現(xiàn)，炎癥小體活化的經(jīng)典途徑是在PAMP提供的第一信號與損傷相關(guān)分子模式提供的第二信號相互作用下產(chǎn)生的，第一信號激活TLR4信號通路，促使NF-κB激活, 介導pro-IL-18、pro-IL-1β等產(chǎn)生[17]；第二信號促進NLRP3/ASC/pro-Caspase-1蛋白復合物(炎癥小體)組裝，pro-Caspase-1自剪切為活化形式，繼而活化的Caspase-1將pro-IL-18、pro-IL-1β等剪切、活化、釋放至細胞外[18]。炎癥小體活化的非經(jīng)典途徑無需依賴TLR4信號通路，是由細胞焦亡造成的病原微生物釋放和被識別引起的。Caspase-1能夠識別細胞內(nèi)的LPS，進而活化NLRP3炎癥小體，促進Gasdermin D的活化與釋放，進而介導細胞死亡[19]。因此，當炎癥刺激因子誘導機體產(chǎn)生大量ROS時，會促使TXNIP 與TRX解離，解離的TXNIP 識別并結(jié)合NLRP3，通過ASC募集 pro-Caspase-1 形成 NLRP3 炎癥小體，激活 Caspase-1，促進IL-1家族的成熟和釋放，引發(fā)炎癥級聯(lián)效應，引起強烈的炎癥反應，最終引發(fā)ALI/ARDS。

TXNIP/NLRP3炎癥小體通路在許多疾病中都有所研究，如視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病[20]、高尿酸血癥[21]、帕金森病[22]和急性肝損傷[23]等。已有研究發(fā)現(xiàn), TXNIP/NLRP3炎癥小體通路參與慢性阻塞性肺疾病患者的機體炎癥反應[24-25]，但有關(guān)其在膿毒癥導致的ALI/ARDS患者PBMC中的表達報道較少。因此，深入了解TXNIP/NLRP3炎癥小體通路在膿毒癥患者中的表達及治療相關(guān)作用，有助于進一步認識膿毒癥的形成及發(fā)展，同時可為探究抑制TXNIP的治療藥物提供參考。TXNIP VDUP-1/TBP-2起初是在1，25-二羥維生素D3治療后的HL-60白血病細胞中被發(fā)現(xiàn)的[26]。Jin等[27]研究發(fā)現(xiàn)， TXNIP在肝損傷小鼠炎癥較重組中高表達，炎癥較輕組呈低表達，與本研究結(jié)果一致——在病例治療D0、D3、D7發(fā)現(xiàn)隨著炎癥反應的減輕，TXNIP的蛋白和mRNA表達也隨之下降。機體通過增加PBMC中TXNIPmRNA和蛋白表達量參與急性加重期的機體炎癥反應，給予患者有效的糖皮質(zhì)激素類藥物治療后，TXNIP在mRNA和蛋白表達水平上隨著炎癥反應的減弱而降低。

NLRP是NLR家族蛋白中的一個重要亞家族，炎癥小體是一種存在于細胞胞質(zhì)中的多蛋白復合物，NLRP3參與組成的炎癥小體稱為NLRP3炎癥小體[7]，其在ALI/ARDS等疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[28-30]。Li等[31]通過LPS誘導ARDS小鼠模型的肺組織及肺巨噬細胞借助免疫熒光及Western blotting檢測到NLRP3表達的顯著增加。Shikano等[32]發(fā)現(xiàn)， 在ARDS小鼠模型骨髓分離的巨噬細胞中NLRP3 mRNA及蛋白表達量也升高。本研究發(fā)現(xiàn)， 在人外周血中NLRP3 mRNA及蛋白水平同樣升高，并且隨著治療引起的炎癥反應減弱而表達降低。

綜上所述，本研究證明了炎癥和氧化應激導致了TXNIP/NLRP3炎癥小體通路激活，該通路的異常過度表達與ALI/ARDS的嚴重程度呈正相關(guān)。TXNIP/NLRP3炎癥小體通路與ALI/ARDS的關(guān)聯(lián)為抑制TXNIP和NLRP3的治療藥物研制提供可能，TXNIP/NLRP3炎癥小體通路或?qū)⒊蔀橹委烝LI/ARDS的新靶點。