吳 碩， 鄒 璇， 王明亞， 張 慶*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院， 廣東木本飼料工程技術(shù)研究中心， 廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室， 廣東 廣州 510642； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院， 河北 保定 071001)

陳皮柑(Citrusreticulatacv. Chachiensis)，又稱新會柑，被大量用于制作陳皮。新會位于我國南方，屬亞熱帶海洋氣候，雨水充沛，氣候溫暖，適合陳皮柑的種植，由陳皮柑制成的新會陳皮，品質(zhì)優(yōu)良，享譽全國[1]。據(jù)報道，陳皮柑種植面積逐年增高，年產(chǎn)量高達23萬噸[2]。然而，陳皮柑果肉質(zhì)地差、果核多、易收縮，食用價值低，在制作陳皮時會產(chǎn)生大量的陳皮柑果肉廢棄物。廢棄的陳皮柑果肉不僅占用空間，而且會滋生細菌、產(chǎn)生腐敗的酸臭味，污染環(huán)境[3]。但陳皮柑果肉富含有機酸，多酚等活性物質(zhì)，有研究表明這些活性物質(zhì)可以抑制有害微生物生長、提高有氧穩(wěn)定性，防止青貯飼料腐敗[4-5]。將陳皮柑汁應(yīng)用于青貯，可以提高陳皮柑利用率，為陳皮柑果肉廢棄物的利用提供新思路。

柱花草(StylosanthesguianensisL.)蛋白質(zhì)含量高、營養(yǎng)豐富、種植面積逐年增高，是我國華南地區(qū)一種重要的牧草；水稻(OryzasativaL.)是一種重要的糧食作物，我國每年產(chǎn)生約2.3億噸廢棄水稻秸稈[6-7]。青貯是一種通過乳酸菌等有益微生物對牧草進行發(fā)酵的加工貯藏方式。用青貯手段對柱花草和水稻秸稈進行加工貯藏不僅可以解決我國冬季新鮮牧草供應(yīng)不足的問題，還能解決廢棄秸稈占用空間、直接燃燒造成環(huán)境污染的問題，同時提高資源利用率。然而，柱花草可溶性碳水化合物(Water-soluble carbohydrates，WSC)低，乳酸菌可利用的碳水化合物少[8]，乳酸菌代謝速度慢，產(chǎn)酸少，不良微生物不能被抑制，進而產(chǎn)生有害或無用代謝，造成營養(yǎng)物質(zhì)的損失，青貯結(jié)果較差；水稻是禾本科作物，秸稈中的粗纖維含量高，粗糙堅硬，適口性差，單獨青貯不易成功[9]。而陳皮柑汁富含糖類(10.1%～11.3%)、有機酸(如檸檬酸0.7%～0.8%)和多酚等活性物質(zhì)[10]，可以彌補柱花草和水稻秸稈青貯時缺少可溶性碳水化合物等缺陷，提高青貯品質(zhì)。陳皮柑汁中的可溶性碳水化合物平均可達到6.20%[11]，能為乳酸菌發(fā)酵提供充足的底物，快速降低青貯pH值。其次，檸檬酸是陳皮柑汁中主要的有機酸，有報道稱檸檬酸能夠有效抑制大腸桿菌等不良微生物[12-13]，陳皮柑汁中的多酚和維生素具有抗氧化性[14]，能夠提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。除此之外，陳皮柑汁還含有豐富的氨基酸和礦物質(zhì)，可以提高飼料的營養(yǎng)品質(zhì)，而且酸甜的陳皮柑汁可以增加飼料的適口性，提高動物的采食率，促進動物生長。

本試驗通過在柱花草和水稻秸稈青貯中添加陳皮柑汁，探究陳皮柑汁對柱花草和水稻秸稈青貯品質(zhì)的影響，以期為廢棄陳皮柑果肉的回收利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗基地(23.24°14′24″ N，113.64°38′24″ E)種植柱花草和水稻，于2020年11月成熟期，留茬5 cm，用鐮刀人工收割柱花草和水稻，用鍘刀將材料切成約2 cm的小段，2種材料分別混合均勻備用；將陳皮柑果肉通過物理方法按壓，擠出汁液，離心、過濾后，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗設(shè)計

在新鮮的柱花草和水稻秸稈中分別添加純水作為對照組(10 mL純水添加到500 g原料中，CK)；添加1%陳皮柑汁試驗組(5 mL純水+5 mL陳皮柑汁添加到500 g原料中，1%OL組)；添加2%陳皮柑汁試驗組(10 mL陳皮柑汁添加到500 g原料中，2%OL組)。樣品混合均勻后分別裝入聚乙烯塑料包裝袋(180 mm × 260 mm)，每袋約180 g，然后用真空密封器(廣東省東莞市益健機械包裝有限公司)密封，共制作18青貯樣品袋(2種原料×3個處理×3個重復(fù))。室溫青貯30 d后測定樣品的化學(xué)成分和青貯指標，并對青貯發(fā)酵結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3 微生物、有機酸和化學(xué)成分測定

1.3.1微生物數(shù)量測定 采用平板計數(shù)法測定乳酸菌，大腸桿菌，霉菌和酵母菌數(shù)量。青貯30 d后，開袋稱取10 g樣品加入90 mL滅菌生理鹽水，充分浸泡5 min后，取1 mL浸取液加入到9 mL的滅菌生理鹽水中充分混勻，重復(fù)操作將青貯樣品中細菌含量逐次稀釋至10-6倍，選擇適宜的梯度，用MRS瓊脂培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基和孟加拉紅定性培養(yǎng)基在適宜溫度的恒溫箱中培養(yǎng)乳酸菌、大腸桿菌、酵母菌和霉菌48 h，然后計數(shù)[15](培養(yǎng)基均來自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。

1.3.2pH值及有機酸測定 取10 g樣品加入90 mL純水，混勻后置于4℃冰箱保存24 h，取出后用定性濾紙過濾，用雷磁PHS-3C型pH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)測定濾液pH值即為青貯樣品pH值[16]。然后將濾液用0.22 μm孔徑的濾膜進行過濾，用島津GC-14型高效液相色譜儀(色譜柱：Shodex Rspak KC-811 s-DVB gel column，日本；檢測器：SPD-M10AVP)測定乳酸、乙酸、丁酸含量(流動相為3 mmol·L-1高氯酸，流速1 mL·min-1；柱溫為50℃；檢測波長為210 nm；進樣量為5 μL)[17]。

1.3.3化學(xué)成分測定 可溶性碳水化合物的測定采用蒽酮比色法：用葡萄糖制作標準曲線，將樣品煮沸10 min，冷卻過濾定容，經(jīng)吸取搖勻后加入蒽酮，在620 nm波長下比色測定吸光度，通過標準曲線計算原料中可溶性碳水化合物含量[18]；干物質(zhì)(Dry Matter，DM)：將柱花草和水稻秸稈青貯樣品分別取樣稱重，放在65℃恒溫烘箱烘干至恒重，樣品烘干后的質(zhì)量與烘干前質(zhì)量的百分比即為干物質(zhì)含量；氨態(tài)氮含量的測定：采用苯酚-次氯酸鈉比色法，將(NH4)2SO4烘至絕干后溶于0.1 N鹽酸，配置成標準銨溶液，測定吸光度，制作標準曲線，取100 μL樣品浸取液，先后加入5 mL苯酚試劑和4 mL次氯酸鈉試劑后置于95℃水浴鍋中顯色反應(yīng)5 min。待冷卻后測定其吸光度，通過標準曲線計算氨態(tài)氮含量[19]；粗蛋白質(zhì)(Crude protein,CP)的測定：稱取樣品0.5 g，加入適量濃硫酸和催化劑(硫酸鉀和硫酸銅按5∶1的比例配置)，420℃消煮2 h，用凱氏定氮儀測定粗蛋白含量；真蛋白(True protein,TP)的測定：稱取0.5 g，用50 mL純水和10 mL三氯乙酸(w/v為15%，TCA)充分浸泡1 h，用定性濾紙過濾，無損失轉(zhuǎn)移殘渣，烘干后通過測定粗蛋白的方法測定真蛋白含量；粗蛋白與真蛋白的差值即為非蛋白氮(Non-protein nitrogen,NPN)含量[15]。

1.4 統(tǒng)計分析

用Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進行初步處理，然后用SPSS 26.0對整理的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，采用Duncan法進行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯原料的特點

青貯前柱花草和水稻秸稈的化學(xué)成份和微生物種群數(shù)量如表1所示，柱花草和水稻秸稈干物質(zhì)含量分別為33.42%，34.59%，粗蛋白含量分別為9.80%和9.40%。水稻秸稈和柱花草可溶性碳水化合物分別為4.77% DM，3.40% DM。原料中微生物數(shù)量豐富，柱花草和水稻秸稈表面附著的乳酸菌和大腸桿菌分別為6.41，7.15 log10cfu·g-1FM和6.05，6.51 log10cfu·g-1FM。

表1 青貯原料的特點(±SD，n=3)

2.2 添加陳皮柑汁對柱花草和水稻秸稈青貯品質(zhì)的影響

由表2可知，與CK相比，試驗組柱花草的pH值顯著降低(P<0.05)，乳酸含量顯著提高(P<0.05)，大腸桿菌數(shù)目降低并低于檢測值(<2.00 log10cfu·g-1)，酵母菌數(shù)量略微提升；試驗組水稻秸稈的干物質(zhì)含量顯著提高(P<0.05)，乳酸菌數(shù)量顯著降低(P<0.05)，大腸桿菌數(shù)量降低但差異不顯著，霉菌和酵母菌數(shù)量都低于2.00 log10cfu·g-1，pH值無顯著變化。所有試驗組的乙酸和丁酸均無顯著變化。

表2 添加陳皮柑汁對柱花草和水稻秸稈青貯品質(zhì)的影響(30 d,n=3)

2.3 添加陳皮柑汁對柱花草和水稻秸稈青貯營養(yǎng)價值的影響

由表3可知，柱花草青貯試驗中，試驗組氨態(tài)氮的含量顯著降低(P<0.05)，2%OL組柱花草真蛋白含量顯著升高(P<0.05)，表明2%陳皮柑汁可以提高柱花草青貯過程中蛋白質(zhì)的保存。水稻秸稈青貯試驗中，氨態(tài)氮和粗蛋白含量略微降低，但差異不顯著。由此可知，陳皮柑汁能有效提高柱花草的青貯發(fā)酵品質(zhì)，而對水稻秸稈蛋白質(zhì)的保存無明顯效果。

表3 添加陳皮柑汁對柱花草和水稻秸稈青貯營養(yǎng)價值的影響(30 d,n=3)

3 討論

3.1 柱花草和水稻秸稈的特點

一般青貯原料的干物質(zhì)含量為32%～38%較為適宜[20]，柱花草和水稻秸稈干物質(zhì)含量為33.42%和34.59%，是較好的青貯原料。原料中柱花草的蛋白質(zhì)含量為9.80%，遠低于王成等[21]報道的15.20%，也小于金莎等[22]報道的11.89%，這可能是受地理環(huán)境、土壤肥力和收獲季節(jié)等因素導(dǎo)致柱花草蛋白質(zhì)含量不同[23]。青貯原料的可溶性碳水化合物達到60～70 g·kg-1DM時，才能滿足乳酸菌快速發(fā)酵的需求[24]，而柱花草和水稻秸稈的可溶性碳水化合物含量不高，特別是柱花草，可溶性碳水化合物的含量較低，不能滿足乳酸菌快速發(fā)酵的需求。因此，添加陳皮柑汁可為乳酸菌提供充足的發(fā)酵底物，提高青貯發(fā)酵質(zhì)量。柱花草和水稻秸稈表面附著的乳酸菌數(shù)量均大于106cfu·g-1，達到了可以快速發(fā)酵的理論要求[25]，但柱花草和水稻秸稈表面的大腸桿菌數(shù)量也較多，這可能導(dǎo)致青貯過程中蛋白質(zhì)的損失和有害物質(zhì)的產(chǎn)生。

3.2 添加陳皮柑汁對柱花草和水稻秸稈青貯品質(zhì)的影響

如表2所示，青貯30 d后，試驗組柱花草的pH值顯著降低，乳酸菌數(shù)量和乳酸含量顯著提高，這可能是因為陳皮柑汁中可溶性碳水化合物含量高，能夠促進乳酸菌繁殖，加速產(chǎn)酸，從而降低柱花草青貯的pH值；試驗組柱花草青貯的酵母菌數(shù)量略微上升，這可能是在青貯后期，一些耐酸型酵母菌利用陳皮柑汁中殘留的碳水化合物生長繁殖的結(jié)果[26]。水稻秸稈青貯后，試驗組水稻秸稈的干物質(zhì)顯著提升，這可能因為陳皮柑汁抑制了不良微生物的發(fā)酵，減少了營養(yǎng)物質(zhì)的損失；試驗組乳酸菌數(shù)量(>8.00 log10cfu·g-1)低于對照組，但乳酸含量高于對照組。這可能是因為添加陳皮柑汁的水稻秸稈可溶性碳水化合物含量高，發(fā)酵產(chǎn)生的大量的乳酸抑制了一些不耐酸乳酸菌的結(jié)果[27]，表2中，水稻秸稈試驗組乳酸含量皆為0.67% DM，說明水稻秸稈青貯時，當(dāng)乳酸含量達到0.67% DM時，可能會抑制乳酸菌自身的繁殖。青貯時，數(shù)量較高的大腸桿菌對青貯飼料的保存是不利的，因為大腸桿菌能夠和乳酸菌競爭發(fā)酵底物，造成營養(yǎng)物質(zhì)的浪費，而且大腸桿菌代謝會產(chǎn)生無用代謝，甚至毒素影響青貯發(fā)酵品質(zhì)[26]。由表2可知，與對照組相比，在柱花草和水稻秸稈青貯試驗中，試驗組大腸桿菌的數(shù)量皆降低。這可能是因為陳皮柑汁中的檸檬酸、蘋果酸等有機酸能夠抑制大腸桿菌。據(jù)Eswaranandam等人研究，檸檬酸和蘋果酸等有機酸能降低微生物細胞內(nèi)的pH值，改變細胞膜的通透性從而破壞細胞結(jié)構(gòu)，抑制細菌[28-30]。且在有機酸存在的情況下，維生素C可以有效抑制大腸桿菌[31-32]，陳皮柑汁可以作為青貯過程中的大腸桿菌抑制劑。

3.3 添加陳皮柑汁對柱花草和水稻秸稈青貯營養(yǎng)價值的影響

如表3所示，2%陳皮柑汁能夠提高柱花草青貯過程中真蛋白質(zhì)的保存；而不同添加量的陳皮柑汁對水稻秸稈蛋白質(zhì)的保存皆無顯著影響。青貯飼料中氨態(tài)氮的積累主要是植物蛋白酶和微生物對蛋白質(zhì)綜合作用的結(jié)果，氨態(tài)氮的存在通常作為蛋白質(zhì)分解標志[33]。本試驗中，試驗組柱花草氨態(tài)氮含量顯著降低，水稻秸稈氨態(tài)氮也有降低，但不顯著。據(jù)Pahlow等報道，pH值在5.0～6.0時，梭菌和植物蛋白酶活性較高[34]。而試驗組柱花草和水稻秸稈青貯的pH值分別為4.74，4.68和5.16，5.18，柱花草青貯過程中較低的pH值可能抑制了梭菌和植物蛋白酶的活性；而水稻秸稈青貯后的pH值(>5.00)都較高，梭菌和植物蛋白酶沒有被抑制導(dǎo)致較多的蛋白質(zhì)損失，這可能就是試驗組和對照組水稻秸稈蛋白質(zhì)保存效果無明顯差異的原因。綜上所述，陳皮柑汁可以降低柱花草青貯過程中蛋白質(zhì)的損失，提高青貯品質(zhì)，陳皮柑汁在柱花草青貯中有較高的應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

添加陳皮柑汁對柱花草和水稻秸稈的青貯品質(zhì)有一定的改善作用。本研究表明，與對照組相比，添加陳皮柑汁可以提高柱花草青貯乳酸的含量，降低pH值和氨態(tài)氮的含量，提高蛋白質(zhì)的保存率；陳皮柑汁處理的水稻秸稈青貯后干物質(zhì)含量也顯著提升。此外，陳皮柑汁對柱花草和水稻秸稈青貯飼料中的大腸桿菌均有抑制作用。本試驗中，陳皮柑汁對柱花草青貯品質(zhì)影響較大，其中添加2%陳皮柑汁的柱花草青貯品質(zhì)較好，但最適宜的添加量尚不確定，有待進一步探究。