任炯羽 張熹 元 張福祿 馮薛煙 趙 倩

1 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，銀川 750004；2 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，長沙410006；3 寧夏醫(yī)科大學(xué)研究生院，銀川 750004

長 鏈 非 編 碼RNA（ long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度超過200 個核苷酸的RNA 分子，雖然大多數(shù)lncRNA 的功能尚不清楚，但近年來已有越來越多的lncRNA 的功能得到鑒定[1]。最近的研究結(jié)果表明，lncRNA 具有穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，可作為多種腫瘤的外周生物標(biāo)志物[2]。它們在很大程度上參與細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳水平上對基因表達(dá)的調(diào)節(jié)[3]，并能通過不同機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[4]，例如：調(diào)節(jié)染色質(zhì)動態(tài)，基因表達(dá)，細(xì)胞的生長、分化和發(fā)育[5-6]。lncRNA 的表達(dá)及突變能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，由于其在多種組織中的全基因組表達(dá)模式和組織表達(dá)特異性，lncRNA有望成為新的腫瘤生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[7]。同源異型盒基因轉(zhuǎn)錄的反義基因間RNA（homeobox gene anti-sense intergenic RNA，HOTAIR）是研究最深入的lncRNA 之一，其來源于染色體12q13.13上同源異型盒基因 C11 和同源異型盒基因 C12 之間的同源異型盒基因 C 反義鏈的轉(zhuǎn)錄，是第一個被發(fā)現(xiàn)具有反式調(diào)節(jié)功能的lncRNA[8-9]。一些研究結(jié)果表明，HOTAIR在不同類型的腫瘤中表達(dá)失調(diào)，例如：乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌、胃腸道癌和結(jié)直腸癌等[4,7]。并且，HOTAIR 參與了多種與腫瘤發(fā)生相關(guān)的過程，例如：影響細(xì)胞的遷移、增殖、凋亡、侵襲、攻擊和轉(zhuǎn)移[10]。鑒于這些重要功能，HOTAIR被用作人類各種腫瘤的潛在生物標(biāo)志物[11]。

反 義 寡 核 苷 酸（ antisense oligonucleotides，ASON）是人工合成的長度為16～22 個堿基的單鏈DNA 類似物，通過沃森-克里克堿基配對與靶基因結(jié)合，可以導(dǎo)致核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄本被敲除，以致靶基因沉默[12-13]。ASON 可以高效、特異、不可逆地與靶基因互補(bǔ)結(jié)合，但標(biāo)記后的探針能否進(jìn)入膠質(zhì)瘤細(xì)胞與HOTAIR 特異性結(jié)合并影響細(xì)胞功能尚不明確。因此，本研究通過制備放射性核素標(biāo)記的靶向lncRNA HOTAIR 的ASON 探針99Tcm-HYNIC-ASON[HYNIC 為聯(lián)肼尼克酰胺（hydrazino nicotinamide）]，在細(xì)胞水平上研究其對人腦膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，為HOTAIR 在膠質(zhì)瘤中的應(yīng)用提供良好的理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

長度為19 個堿基的ASON 探針購自上海生工生物工程股份有限公司，并進(jìn)行化學(xué)合成和修飾。人腦膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；99Tcm-高锝酸鹽溶液購自北京原子高科技術(shù)股份有限公司；HYNIC 購自美國TriLink 公司；交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex） G25 購自美國GE 公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 購自美國Invitrogen 公司；Tricine 購自美國Sigma-Aldrich 公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自西安勵合生物有限公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒8（cell counting kit-8，CCK-8）購自美國APExBIO 公司。超濾管購自德國Sartorius 公司；MR-96A 酶標(biāo)儀購自美國 Thermo 公司；GC-1200 型 γ 放射免疫計數(shù)器購自中國計量科學(xué)研究院；1645050 PowerPac Basic 基礎(chǔ)電泳儀購自美國Bio-Rad 公司。

1.2 ASON 的合成與修飾

設(shè)計與HOTAIR 片段完全互補(bǔ)的ASON 序列：5′-AATTCTTAAATTGGGCTGG-3′，序列兩端分別進(jìn)行2′-O-甲基化修飾，兩端各有2 個堿基進(jìn)行硫代修飾以提高穩(wěn)定性。5′端連接NH2C6，即合成結(jié)構(gòu)式為 3′-ASON-NH2C6-5′，具體見圖1，HYNIC 與Tricine 共同偶聯(lián)99Tcm。

圖1 99Tcm - HYNIC -ASON 探針的結(jié)構(gòu)式 HYNIC 為聯(lián)肼尼克酰胺；ASON 為反義寡核苷酸Figure 1 Structure of 99Tcm-hydrazine nicotinamide-antisense oligonucleotides

1.3 99Tcm-HYNIC-ASON 探針的制備

取1 mg HYNIC 溶于 100 μL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液，濃度10 mg/mL。將0.2 mg ASON溶于50 μL 緩沖液（2 mol/L NaCl、0.5 mol/L NaHCO3、2 mmol/L 乙二胺四乙酸）中。將HYNIC 和ASON以摩爾比為25∶1 的比例混合，避光反應(yīng)1～2 h。反應(yīng)結(jié)束后加入60%甲醇至總體積為500 μL，置于超濾管中以15 000×g離心10 min（保證離心后體積＜50 μL）。隨后向離心后反應(yīng)物中依次加入100 μL Tricine （100 mg/mL）、20 μL 新鮮淋取的99Tcm-高锝酸鹽溶液（111 MBq），最后加入4 μL 新鮮配置的SnCl2·2H2O（1 mg/mL）溶液，混勻，避光反應(yīng)60 min。反應(yīng)完畢后用Sephadex G25 分離純化，每管收集5 滴（約0.6 mL）洗脫液，分別測定每管的放射性活度和核酸濃度，并繪制曲線。取高峰管以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 99Tcm-HYNIC-ASON 探針的穩(wěn)定性檢測

將99Tcm-HYNIC-ASON 分別于室溫（25℃）、37℃條件下在生理鹽水和新鮮人血清中孵育（探針與血清或生理鹽水的體積比為1∶1），于0、2、4、6、8、12 h 時 采 用 快 速 薄 層 層 析（instant thin layer chromatography，ITLC）法測定放射化學(xué)純度。

1.5 瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)鑒定探針的完整性

配置1%的瓊脂糖凝膠，依次加入稀釋的ASON 樣品、99Tcm-高锝酸鹽溶液、純化前的99Tcm-HYNIC-ASON、純化后的99Tcm-HYNIC-ASON。采用電壓120 V，電泳20 min，于紫外光下觀察條帶。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將人腦膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞培養(yǎng)在含15%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素混合液的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，放置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞密度達(dá)到90%進(jìn)行傳代。

配制轉(zhuǎn)染混合液A：取10 μg 純化后的99Tcm-HYNIC-ASON 加入500 μL 無血清、無青霉素和鏈霉素混合液的DMEM 培養(yǎng)基；配制轉(zhuǎn)染混合液B：取25 μL Lipofectamine 2000 加 入475 μL DMEM培養(yǎng)基中，溫和震蕩后室溫放置5 min。隨后將混合液A、B 混勻，室溫放置20 min 得到脂質(zhì)體包裹的99Tcm-HYNIC-ASON（即Lipo-99Tcm-HYNIC-ASON）。將人腦膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞按每孔1.2×106個接種于六孔板中，培養(yǎng)24 h 后每孔加入100 μL Lipo-99Tcm-HYNIC-ASON，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，隨后吸棄培養(yǎng)基，換為含15%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～48 h 完成轉(zhuǎn)染。

1.7 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

將處于對數(shù)生長期的人腦膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞按每孔1×105個接種于12 孔板中。在無青霉素和鏈霉素混合液、含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)分為2 組：Lipo-99Tcm-HYNIC-ASON 組（轉(zhuǎn)染組）和99Tcm-HYNIC-ASON組（未轉(zhuǎn)染組）。轉(zhuǎn)染組每孔加入200 μL DMEM培養(yǎng)基、500 ng99Tcm-HYNIC-ASON（37 kBq）和3 μL Lipofectamine 2000，混勻完成轉(zhuǎn)染；未轉(zhuǎn)染組 每 孔 加 入200 μL DMEM 培 養(yǎng) 基 和500 ng99Tcm-HYNIC-ASON（37 kBq），混勻。將2 組細(xì)胞放置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于加樣后1、2、3、4、5、6 h 時收集一孔培養(yǎng)液于EP 管中，100 μL PBS 沖洗3 遍，收集到同一EP 管中，標(biāo)記為Cout；用含乙二胺四乙酸的胰酶消化細(xì)胞，每孔用100 μL PBS 沖洗3 遍，收集到同一EP 管中，標(biāo)記為Cin。采用γ 放射免疫計數(shù)器檢測Cin 及Cout的放射性計數(shù)，計算各個時間點(diǎn)細(xì)胞對探針的攝取率，細(xì)胞攝取率=Cin 的放射性計數(shù)/（Cin 的放射性計數(shù)+Cout 的放射性計數(shù)）×100%。

1.8 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖能力

收集對數(shù)生長期的人腦膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞接種于96 孔板中，每組設(shè)5 個復(fù)孔，待細(xì)胞密度達(dá)到60%，分為3 組：Lipo-99Tcm-HYNIC-ASON 組（轉(zhuǎn)染組）、99Tcm-HYNIC-ASON 組（未轉(zhuǎn)染組）、99Tcm-Control 組（對照組），并分別處理細(xì)胞（轉(zhuǎn)染組6 h 時換一次液）。根據(jù)CCK-8 試劑盒說明書操作，將細(xì)胞培養(yǎng)1～5 d，每天于同一時間點(diǎn)加入CCK-8。為避免誤差，每孔分別加入無血清、無青霉素和鏈霉素混合液的DMEM 培養(yǎng)基稀釋的CCK-8 110 μL（無血清、無青霉素和鏈霉素混合液的DMEM 培養(yǎng)基100 μL、CCK-8 10 μL），于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2.5 h 后，用酶標(biāo)儀檢測450 nm 處的吸光度（A450值）。

1.9 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)評估細(xì)胞的遷移能力

按“1.8”小節(jié)中分組將細(xì)胞按每孔1.2×106個接種于6 孔板中并分別進(jìn)行處理，待細(xì)胞密度達(dá)到90%時，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，用200 μL 槍頭垂直在6 孔板中央劃線，PBS沖洗2 遍洗去被劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。記錄培養(yǎng)細(xì)胞0、24 h 時的劃痕面積，計算細(xì)胞間隙融合率，細(xì)胞間隙融合率=（0 h 劃痕面積-24 h 劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料 符 合 正 態(tài)分 布以±s表 示，2 組 間 比 較 采 用Studentt檢驗(yàn)（方差齊性），多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 99Tcm-HYNIC -ASON 探針的制備結(jié)果

由圖2 可見，純化前（圖2B）與純化后（圖2C）的99Tcm-HYNIC-ASON 的放射性滯留在同一位置。ITLC 法測得探針的標(biāo)記率為（90.0±5.6）%。

圖2 99Tcm-HYNIC-ASON 探針的快速薄層層析圖譜 A 為99Tcm-高锝酸鹽溶液；B 為探針純化前；C 為探針純化后。HYNIC 為聯(lián)肼尼克酰胺；ASON 為反義寡核苷酸Figure 2 Instant thin layer chromatography of 99Tcm-hydrazine nicotinamide-antisense oligonucleotides

2.2 純化物的放射性活度及核酸濃度

分離純化99Tcm-HYNIC-ASON 共收集到洗脫液15 管，純化物的放射性活度及核酸濃度見圖3。由圖3B 可見，未結(jié)合的ASON 片段經(jīng)1～5 管過濾掉；5～10 管為99Tcm-HYNIC-ASON，與圖3A 的放射性活度峰值相符。

圖3 99Tcm-HYNIC-ASON 探針分離純化后收集每管的放射性活度（A）及核酸濃度（B） HYNIC 為聯(lián)肼尼克酰胺；ASON為反義寡核苷酸Figure 3 Radioactivity (A) and nucleic acid concentration (B)of 99Tcm-hydrazine nicotinamide-antisense oligonucleotides after purified

2.3 99Tcm-HYNIC-ASON 探針的穩(wěn)定性和完整性

由圖4A 可見，99Tcm-HYNIC-ASON 探針12 h的放射化學(xué)純度達(dá)80%以上，在生理鹽水及新鮮人血清中的放射化學(xué)純度無明顯差別；由圖4B 可見，99Tcm-HYNIC-ASON 探針在純化前后都顯示亮的條帶，這說明探針具有完整性并且沒有發(fā)生明顯降解和脫靶。

圖4 99Tcm-HYNIC-ASON 探 針 的 穩(wěn) 定 性 和 完 整 性 A 為99Tcm-HYNIC-ASON 于室溫（25℃）和37℃條件下分別與生理鹽水和新鮮人血清孵育不同時間點(diǎn)的放射化學(xué)純度；B 為瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測探針的完整性（1～4 泳道依次為ASON 樣品、99Tcm-高锝酸鹽溶液、純化前的99Tcm-HYNICASON、純化后的99Tcm-HYNIC-ASON）。HYNIC 為聯(lián)肼尼克酰胺；ASON 為反義寡核苷酸Figure 4 Stability and integrity identification of 99Tcm-hydrazine nicotinamide-antisense oligonucleotides

2.4 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖5 可見，在1 h 后的任一時間點(diǎn)，轉(zhuǎn)染組對Lipo-99Tcm-HYNIC-ASON 的細(xì)胞攝取率均高于未轉(zhuǎn)染組對99Tcm-HYNIC-ASON 的細(xì)胞攝取率，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。轉(zhuǎn)染后5 h，Lipo-99Tcm-HYNIC-ASON 在人腦膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞中的攝取率最大（0.70%），與未轉(zhuǎn)染組（0.16%）相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=17.81，P＜0.01）。 而未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞最大攝取率出現(xiàn)在6 h 時，僅為0.20%。

圖5 轉(zhuǎn)染Lipo-99Tcm-HYNIC-ASON 后不同時間點(diǎn)人腦膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞的攝取率 a 表示與未轉(zhuǎn)染組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=15.60～21.56，均P＜0.01）。HYNIC 為聯(lián)肼尼克酰胺；ASON 為反義寡核苷酸Figure 5 Human glioma U87 cell uptake rates after transfection of Lipo-99Tcm-hydrazine nicotinamide-antisense oligonucleotides at different times

2.5 CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖6 可見，與未轉(zhuǎn)染組和對照組相比，在轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5 d，轉(zhuǎn)染組吸光度均較低，這說明Lipofectamine 2000 可以有效地使探針進(jìn)入細(xì)胞并抑制細(xì)胞的增殖能力，在各個時間點(diǎn)，轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比，吸光度的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖6 轉(zhuǎn)染Lipo-99Tcm-HYNIC-ASON 后不同時間點(diǎn)人腦膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞的增殖能力 a 表示與未轉(zhuǎn)染組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.336～30.230, 均P＜0.05）。HYNIC 為聯(lián)肼尼克酰胺；ASON 為反義寡核苷酸Figure 6 Human glioma U87 cell proliferation after transfection of Lipo-99Tcm-hydrazine nicotinamide-antisense oligonucleotides at different times

2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖7 可見，轉(zhuǎn)染Lipo-99Tcm-HYNIC-ASON 24 h 后細(xì)胞遷移能力下降，這說明Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染可以有效地使探針進(jìn)入細(xì)胞并抑制細(xì)胞的遷移。3 組細(xì)胞間隙融合率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=331.8，P＜0.01），與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞間隙融合率明顯降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（60.0%對23.6%，t=51.54,P＜0.01）。

圖7 轉(zhuǎn)染Lipo-99Tcm-HYNIC-ASON 后人腦膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞的遷移能力 A 為細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果；B 為3 組細(xì)胞間隙融合率的比較結(jié)果（F=331.8，P＜0.01）。a 表示與未轉(zhuǎn)染組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=51.54, P＜0.01）。HYNIC 為聯(lián)肼尼克酰胺；ASON 為反義寡核苷酸Figure 7 Human glioma U87 cell migration after transfection of Lipo-99Tcm-hydrazine nicotinamide-antisense oligonucleotides

3 討論

鑒于HOTAIR 在膠質(zhì)瘤及其他惡性腫瘤中的特異性高表達(dá)，利用放射性核素標(biāo)記與HOTAIR特異性結(jié)合的ASON 探針對膠質(zhì)瘤的早期發(fā)現(xiàn)具有重要意義。本研究成功地利用HYNIC 螯合99Tcm標(biāo)記靶向HOTAIR 的ASON。本研究制備探針的標(biāo)記率高且12 h 內(nèi)血清穩(wěn)定性較好，經(jīng)凝膠電泳鑒定沒有發(fā)生明顯的降解；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的探針可以更有效地進(jìn)入細(xì)胞，并抑制人腦膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞的增殖和遷移。

在標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，首先，由于HYNIC 只有1 個或2 個99Tcm的結(jié)合位點(diǎn)，因此選用Tricine 為協(xié)同配體，2 個分子提供的位點(diǎn)可以與99Tcm形成穩(wěn)定的復(fù)合物，獲得較高的標(biāo)記率。其次，為保護(hù)ASON 免 受 RNA 酶 的 降 解，在ASON 探 針 兩 端各3 個堿基分別進(jìn)行甲基化及硫代修飾，以增加其體內(nèi)外穩(wěn)定性。再次，與其他文獻(xiàn)[14-16]報道的標(biāo)記方法相比，我們采用自配的緩沖液（2 mol/L NaCl、0.5 mol/L NaHCO3、2 mmol/L 乙二胺四乙酸）代替碳酸氫鹽緩沖液，同時提高HYNIC 與ASON 的摩爾比為25∶1，并用超濾管過濾未結(jié)合的ASON 片段。結(jié)果顯示，99Tcm-HYNIC-ASON 的標(biāo)記率為（90.0±5.6）%，并且沒有發(fā)生明顯的降解。然而，ITLC 法結(jié)果顯示，99Tcm-高锝酸鹽溶液中大部分99Tcm被氧化為膠體99Tcm，不能被SnCl2·2H2O還原，反應(yīng)物經(jīng)Sephadex G25 分離純化后，大部分未結(jié)合的ASON 片段提前濾出，因此新鮮淋取的99Tcm對標(biāo)記率有較大影響。

影響ASON 探針結(jié)合的主要因素之一是放射性標(biāo)記的ASON 探針在細(xì)胞內(nèi)的攝取率低[17]。脂質(zhì)體可以通過靜電相互作用將帶負(fù)電荷的ASON包裹起來，這樣親脂性的ASON 就可以很容易地穿過細(xì)胞膜。在細(xì)胞內(nèi)部，脂質(zhì)體破壞了內(nèi)小體的捕獲，使得ASON 能夠逃逸到細(xì)胞質(zhì)中，與其目標(biāo)mRNA 結(jié)合[18-19]。此外，脂質(zhì)體還能增強(qiáng)探針的核定位[20]。我們選擇Lipofectamine 2000 作為載體，在細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)中，Lipo-99Tcm-HYNIC-ASON的攝取率由0.02%上升至0.70%，而未轉(zhuǎn)染組6 h內(nèi)最大攝取率僅為0.20%。另外，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組24 h 細(xì)胞間隙融合率明顯低于未轉(zhuǎn)染組。CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力明顯下降。以上結(jié)果證明，脂質(zhì)體能有效包裹探針穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞并抑制細(xì)胞的增殖及遷移能力。

本研究存在一些不足之處：（1）99Tcm與ASON片段的結(jié)合率還有待提高，目前可以采用的方法是選用新鮮淋取的99Tcm-高锝酸鹽溶液和新鮮配置的SnCl2·2H2O 溶液并盡快將二者混合；（2）探針的放射化學(xué)純度相對偏低，可以進(jìn)一步改進(jìn)標(biāo)記方法，例如通過改變99Tcm-高锝酸鹽溶液體積、SnCl2·2H2O濃度以及反應(yīng)時間等進(jìn)行改善[21]。

綜上所述，99Tcm標(biāo)記的靶向HOTAIR 的ASON探針99Tcm-HYNIC-ASON 具有較高的標(biāo)記率和體外穩(wěn)定性，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后可以進(jìn)入人腦膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞并發(fā)揮抑制作用，為U87 荷瘤裸鼠的腫瘤反義顯像的應(yīng)用提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

利益沖突本研究由署名作者按以下貢獻(xiàn)聲明獨(dú)立開展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明任炯羽負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)的實(shí)施、論文的撰寫與修訂；張熹元、馮薛煙負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)的實(shí)施；張福祿負(fù)責(zé)方法的建立；趙倩負(fù)責(zé)方法的建立、論文的審閱。