羅 娜，王 雪，黃麗佳，郭亞東，劉華銀，鄧 亮

(昆明醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500)

梔子為茜草科植物梔子屬綠灌木的近圓形果實[1]，其具有悠久的藥食同源歷史．梔子中含有黃酮類、環(huán)烯醚萜類、三萜類、有機酸酯類等多種化學(xué)成分[2-3]，被廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床，如：梔子中的西紅花苷成分具有治療心血管疾病和保護(hù)內(nèi)臟器官等作用[4]；梔子苷具有降血糖、降血脂、抗炎鎮(zhèn)痛等藥理作用[5]；梔子中的京尼平苷具有利膽功能，對防止膽結(jié)石形成有一定的作用[6]．梔子分布廣泛，主產(chǎn)于我國江西、湖北、福建、湖南、廣西、廣東、云南、四川、貴州等地[7]．由于其化學(xué)成分含量可能與地理環(huán)境因素有關(guān)，造成不同產(chǎn)地的梔子樣品中化學(xué)成分含量不同[8]．因此，本研究建立了梔子HPLC指紋圖譜，并對其進(jìn)行相似度評價，以期為梔子的鑒定及質(zhì)量控制提供參考．

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Agilent 1100型)；可變波長掃描紫外檢測器(VWD)；超聲波清洗器(Grant XUB25)；色譜柱為ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)．

1.2 試藥

梔子苷對照品(編號A0178，純度≥98%)，西紅花苷I對照品(編號A0211，純度≥ 98%)，西紅花苷II對照品(編號A0212，純度≥ 98%),均購自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙醇為色譜純，磷酸為優(yōu)級純，均購自默克股份有限公司；水為超純水；7批不同產(chǎn)地的梔子樣品(表1)均從當(dāng)?shù)刂兴幍曩徺I．

表1 梔子樣品的來源

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件

色譜柱ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)，梯度洗脫程序見表2，檢測波長265 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL．

表2 梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備

分別精密稱定梔子苷對照品、西紅花苷I對照品、西紅花苷II對照品各10 mg，加入體積分?jǐn)?shù)為70%甲醇定容至10 mL容量瓶中，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液．

2.2.2 供試品溶液制備

精密稱定各樣品0.2 g，放入具塞錐形瓶里，再精密加入10 mL甲醇(體積分?jǐn)?shù)為70%)，并稱其質(zhì)量，超聲60 min，然后放冷，再稱其質(zhì)量，并補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，將濾液過0.22 μm微孔濾膜，用于HPLC進(jìn)樣分析．

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實驗

取1號梔子樣品，精密稱定，制成供試品溶液，根據(jù)上述色譜條件，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，并記錄色譜指紋圖譜．結(jié)果顯示，28個共有峰相對保留時間的RSD值<3%，相對峰面積的RSD值<5%，說明儀器的精密度較好，能夠滿足實驗要求．

2.3.2 穩(wěn)定性實驗

取1號梔子樣品，精密稱定，制成供試品溶液，根據(jù)上述色譜條件，在0，2，4，8，12 h進(jìn)樣分析，記錄色譜指紋圖譜．結(jié)果表明，28個共有峰相對保留時間的RSD值<2%，相對峰面積的RSD值<2%，說明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，所測結(jié)果可靠．

2.3.3 重復(fù)性實驗

取1號梔子樣品6份，精密稱定，制成供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣．結(jié)果表明，28個共有峰相對保留時間的RSD值<2%，相對峰面積的RSD值<5%，說明本方法重復(fù)性較好．

2.4 梔子HPLC指紋圖譜的建立

精密稱定7批梔子樣品，制成供試品溶液，按上述色譜條件，采用“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立7批樣品的疊加指紋圖譜(圖1)及對照圖譜(圖2)，7批不同產(chǎn)地的梔子共有色譜峰為28個．通過與對照品進(jìn)行比較，10號為梔子苷峰，20號為西紅花苷I峰，23號為西紅花苷II峰，見圖3．由于10號峰梔子苷峰分離效果較好，峰位居中，并且以梔子苷作為梔子的主要有效成分，其含量高，因此選擇梔子苷為參照峰計算其他共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值，如表3和表4所示，各色譜峰之間的相對保留時間差異不大，但相對峰面積之間存在一定的差異．

2.5 相似度計算和數(shù)據(jù)分析

由表5可知，不同產(chǎn)地梔子指紋圖譜相似度在0.878～0.982之間，其中：以產(chǎn)地為云南和貴州的梔子差異最大，相似度為0.878；產(chǎn)地為安徽和江西的梔子差異最小，相似度為0.982，表明不同產(chǎn)地間以及生長條件對梔子會有一定的影響．

圖1 7批梔子樣品的HPLC疊加圖譜

圖2 梔子指紋圖譜的對照圖譜

圖3 對照品HPLC色譜圖

表3 梔子指紋圖譜共有峰相對保留時間

表4 梔子指紋圖譜共有峰相對峰面積

續(xù)表4

表5 不同產(chǎn)地梔子HPLC指紋圖譜的相似度

3 討論

本研究考察了8種提取溶劑30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇，30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、100%乙醇，以及3種不同的提取時間20，40，60 min．結(jié)果表明，采用70%甲醇超聲提取60 min的提取效果最好．同時，對乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水3種流動相系統(tǒng)和25，35，40 ℃這3種柱溫進(jìn)行了考察．結(jié)果顯示，在柱溫為35 ℃時，采用乙腈-0.1%磷酸水系統(tǒng)分離效果較好，基線平穩(wěn)，有利于指紋圖譜的分析．此外，考察了238，254，265，330 nm處的特征圖譜，發(fā)現(xiàn)在265 nm處可檢測出的成分較多且基線平穩(wěn)，因此選用該波長為檢測波長．

本研究對7種不同產(chǎn)地梔子樣品建立了指紋圖譜，確定了28個共有峰，7批梔子樣品的指紋圖譜相似度在0.878～0.982之間，表明不同產(chǎn)地和生長條件對梔子有一定的影響．綜上所述，HPLC圖譜結(jié)合相似度評價可為梔子的質(zhì)量控制以及對其進(jìn)一步研究提供參考．