張雪瑩 梁梓豪 陳曉慧 張舒婷 賴鐘雄 林玉玲

摘? 要：為了研究DlDCL家族中DlDCL4基因在龍眼中的功能，本研究通過氨基酸序列比對、系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構(gòu)建、亞細胞定位驗證、實時熒光定量PCR（qPCR）等方法，對其進行初步探究。結(jié)果表明：遺傳進化分析顯示，DCL4氨基酸序列在所選的物種間相似度高于50%，其中龍眼與甜橙（Citrus sinensis）的親緣關(guān)系最近。在激光共聚焦顯微鏡觀察下，洋蔥細胞核發(fā)出綠色熒光，其他部位不發(fā)出熒光，表明龍眼DCL4蛋白定位于細胞核中。在24 h內(nèi)，100 μmol/L的外源脫落酸（ABA）對DlDCL4都有極顯著的下調(diào)效果;100 μmol/L的水楊酸（SA）對其表達量有顯著的上調(diào)效果，其中8 h時表達量最大，提示DlDCL4對不同激素的響應效果不同且不同處理時長下響應效果也會有影響。

關(guān)鍵詞：龍眼;DCL4基因;亞細胞定位;激素處理

中圖分類號：S667.2????? 文獻標識碼：A

Subcellular Localization Analysis and Responses to Exogenous ABA and SA in Longan Callus of DCL4

ZAHNG Xueying*， LIANG Zihao*， CHEN Xiaohui， ZHANG Shuting， LAI Zhongxiong**， LIN Yuling*

Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agricultural and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract： This study carried out amino acid sequence alignment， phylogenetic tree analysis， subcellular localization verification and real-time qPCR analysis to study the function of DlDCL4 gene of DlDCL family in longan. It was found that the similarity of the amino acid sequence of DCL4 was more than 50% in the selected species. In the evolutionary relationship， DlDCL4 and navel orange （Citrus sinensis） were closely related. Under the observation of laser confocal microscopy， the onion cell nucleus emitted green fluorescence， and other parts did not emit fluorescence， so the longan DCL4 protein was localized in the nucleus. In 24 h， 100 μmol/L exogenous ABA hormone had a significant down-regulation effect on DlDCL4. SA had a significant up-regulation effect on its expression， and the effect was higher than other time treatment at 8 h， which suggested that DlDCL4 had different responses to different hormones and this effect would also be affected by different treatment durations.

Keywords： longan; DCL4 gene; subcellular localization; hormone treatment

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.002

Dicer是一種高度保守的核糖核酸酶，在植物中稱為Dicer-like（DCL）蛋白，屬于RNase Ⅲ家族，是RNA沉默途徑中至關(guān)重要的組分，其通常包括DEAD box、helicase-C、DUF283、PAZ、RNase Ⅲ和dsRBD 6個結(jié)構(gòu)域[1]。DCL蛋白是加工dsRNA前體生成小分子RNA的關(guān)鍵酶，可通過剪切dsRNA產(chǎn)生siRNA，啟動RNAi途徑的起始階段，在植物RNA沉默機制中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[2]。由于DCL結(jié)構(gòu)域的多樣性，不同的DCLs在不同的生物中對RNA的剪切功能存在差異[3]。每個DCL蛋白都有其各自的功能，彼此通過功能互補和自我平衡的方式發(fā)揮作用[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，AtDCL4主要在轉(zhuǎn)錄后的基因沉默發(fā)生作用，通過特異性識別大于100 nt的長鏈dsRNA，將其剪切形成20 nt的反式作用siRNA;在水稻中，OsDCL4剪切產(chǎn)生21 nt的反式siRNAs和phasiRNAs4[7-8]。研究表明DCL4在調(diào)控植物生長發(fā)育和適應性方面也發(fā)揮了一定生物學作用。氮缺乏條件下，擬南芥突變體ski2 dcl4和ein5 dcl4中22 nt siRNAs被顯著誘導，韌皮部發(fā)育相關(guān)基因CALS7和NEN4顯著下調(diào)表達，土壤根系生長明顯被抑制，幼苗發(fā)育遲緩[9];在棉花干旱脅迫和病毒侵染過程中，DCL4被誘導顯著性上調(diào)表達[10];撇除水稻OsDCL4基因?qū)е轮仓晟L矮小、結(jié)穗率低，植物內(nèi)源dsRNA含量減少而使植株易受病毒侵染[11]。

外源脫落酸（ABA）和水楊酸（SA）都是植物內(nèi)源性激素，對植物的生長調(diào)節(jié)有重要作用。ABA在植物的生長發(fā)育調(diào)節(jié)和對非生物脅迫的應答方面發(fā)揮了顯著的作用[12]。研究表明，ABA對植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)主要體現(xiàn)在促進器官脫落和休眠、抑制植物生長、促進種子休眠等方面[13]，同時還可以提高植物對于干旱、低溫和高鹽抗性[14]。在龍眼的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)ABA可以提高RNA沉默相關(guān)基因AGO10的表達量[15]，但DlDCLs下調(diào)表達[16]。SA在植物中主要是作為防衛(wèi)激素發(fā)揮作用[17]，目前在多個物種中發(fā)現(xiàn)SA可以增強對生物性病原的抵抗作用，而且時常被應用于種子萌發(fā)前的催種[18]。研究表明，SA信號轉(zhuǎn)導途徑在植物對抗逆境脅迫，尤其是在對抗病害的脅迫過程中起著關(guān)鍵性作用[19-21]。同時，研究發(fā)現(xiàn)50、75 μmol/L濃度的SA可以使龍眼Mn-SOD的表達量顯著上調(diào)，提高龍眼的抗氧化能力[22]，同時對龍眼抗病基因的表達有調(diào)控作用[23]。

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）作為一種熱帶亞熱帶水果，具有非常高的經(jīng)濟價值，同時龍眼干還有著很高的藥用價值，所以龍眼果實的品質(zhì)調(diào)控一直都是研究的熱點。ABA和SA在植物的生長和發(fā)育中有重要的作用，而DCLs作為miRNA作用過程中的關(guān)鍵酶也越來越受到重視，探究它們之間的作用機制對提高龍眼果實品質(zhì)具有重要意義。近年來，研究發(fā)現(xiàn)DlDCLs對龍眼的葉子和花器官發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，并且能響應干旱、低溫和ABA、SA等非生物脅迫[16]。研究表明，在不同種類外源激素處理下，DlDCL4的表達存在顯著性差異，但是關(guān)于短期內(nèi)DlDCL4對外源激素的響應機制還沒有相關(guān)研究成果。因此，本試驗通過比較不同物種DCL4氨基酸序列的保守性，并構(gòu)建進化樹;通過構(gòu)建表達載體轉(zhuǎn)化洋蔥表皮研究龍眼DCL4的亞細胞定位;并通過設(shè)置0、4、8、12、24 h的時間梯度，探究龍眼胚性愈傷組織中DlDCL4是否參與對ABA和SA外源激素的應激反應。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

本試驗所用的‘紅核子龍眼胚性愈傷組織（EC）來自于福建農(nóng)林大學園藝植物生物工程研究所。選擇固體培養(yǎng)基中生長狀態(tài)良好的龍眼胚性愈傷組織繼代于液體培養(yǎng)基中，并且在2次液體培養(yǎng)基繼代以后，選擇生長狀況最好的愈傷組織，在濾紙上濾干后混樣。將0.3 g樣品加入分別含有100 μmol/L脫落酸（ABA）和100 μmol/L水楊酸（SA）的MS液體培養(yǎng)基中，置于25 ℃ 120 r/min的搖床，分別處理0、4、8、12、24 h，每個處理做3次生物學重復，收樣時將3組生物學重復處理的樣品混樣后用濾紙吸干水分，液氮急凍處理后保存于?80 ℃冰箱中備用。

1.2? 方法

1.2.1? DCL4進化樹的構(gòu)建? 使用www.NCBI. com和https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html選擇1821種和龍眼DCL4氨基酸序列相似度較高的物種，下載DCL4氨基酸序列，用MEGA.X軟件進行氨基酸序列比對和構(gòu)建，且對構(gòu)建的進化樹進行自檢（boot-strap）分析，設(shè)置1000次重復檢驗，其他參數(shù)為默認值，并利用在線工具iTOL（https：//itol. embl. de/up-load. Cgi）對進化樹進行美化。

1.2.2? 目的基因序列的獲得和擴增? 參考陳曉慧[16]的方法獲得DlDCL4基因的序列，結(jié)合1302載體的酶切位點，設(shè)計上下游引物并分別命名為DCL4-1302.F和DCL4-1302.R（表1），進行PCR擴增。將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳驗證后用Thermo scientificScientific生物公司的試劑盒對目的條帶進行回收，將回收產(chǎn)物和B-zero載體連接后轉(zhuǎn)化DH5-α大腸桿菌，隨后將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌涂板至含有氨芐霉素的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆進行菌液PCR驗證，將驗證成功的菌液送至上海博尚生物公司測序。

1.2.3? 線性載體的獲得? 將帶有1302質(zhì)粒的大腸桿菌進行擴繁培養(yǎng)，使用TIANGEN公司的TIANGEN試劑盒提取質(zhì)粒。利用NcoⅠ以及BcuⅠ2種核苷酸限制性內(nèi)切酶對上一步驟獲得的質(zhì)粒進行切割得到線性的質(zhì)粒，并且DCL4基因兩端有著可配對序列的線性DNA片段，通過凝膠電泳檢測獲得的DNA片段是否為目的線性DNA片段。

1.2.4 ?龍眼DCL4的亞細胞定位? 將線性載體和目的基因連接以后將含有重組質(zhì)粒菌液涂板至含有抗生素的培養(yǎng)基中進行篩選，同樣地挑菌后進行菌液PCR，將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌使用2種內(nèi)切酶進行酶切驗證，驗證成功后的大腸桿菌可以用于轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。隨后將含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染洋蔥內(nèi)表皮細胞后使用共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.5? 實時熒光定量PCR? 使用Trans geneGene生物公司的TransZol Up試劑盒提取處理后樣品的總RNA，然后用TakaraTaKaRa生物公司PrimeScriptTM IV 1st Strand cDNA Syn-thesis Mix試劑盒進行cDNA

合成，具體步驟參考試劑盒說明書。用DNAMAN設(shè)計用于qPCR的引物后送至尚亞生物公司合成（表1），以EF-1a為內(nèi)參基因，以上一步反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行實時熒光定量PCR，每個模板進行3個重復實驗，反應體系為20 μL，反應設(shè)置為40個循環(huán)。DCL4成員的相對表達量用2?CtCT法計算。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

使用Excel軟件對實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和計算，使用SPSS軟件對結(jié)果進行差異性顯著性分析，并且使用GraphPad Prism 6.01軟件繪制統(tǒng)計圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 龍眼DCL4氨基酸序列比對和進化分析

使用MEGA.X軟件分析龍眼和其他1820個物種的DCL4蛋白的氨基酸序列比對和進化樹分析后發(fā)現(xiàn)，DCL4氨基酸序列在物種間比較保守，氨基酸序列的相似度為57.55%（圖1）;以DCL4的氨基酸序列作為進化依據(jù)，柑橘類的甜橙（Citrus sinensis）和龍眼具有最近的親緣關(guān)系（圖2）。同時DCL4的氨基酸序列在不同物種間的相似性較高，體現(xiàn)了該基因在不同物種之中相對保守。

2.2? 重組質(zhì)粒構(gòu)建

通過PCR擴增獲得帶有限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和BcuⅠ酶切位點的龍眼DCL4目的片段后（圖3A），然后進行菌液驗證和送至生物公司測序，將測序成功的DCL4目的片段和酶切獲得的線性1302質(zhì)粒連接，挑取在含有卡納霉素的LB培養(yǎng)基中的陽性克隆子，再進行酶切驗證（圖3B），酶切驗證成功的載體即為可用于轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中的重組載體，構(gòu)建完成后的載體可用于亞細胞定位（圖3C）。

2.3? DlDCL4亞細胞定位分析

采用農(nóng)桿菌介導法將DlDCL4：GFP瞬時表達于洋蔥鱗葉表皮細胞，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察DlDCL4的亞細胞定位（圖4）。實驗組的洋蔥細胞在暗場下表現(xiàn)為細胞核散發(fā)綠色熒光，但是其他位置不發(fā)出綠色熒光，空白對照組表現(xiàn)為整個細胞都發(fā)出綠色熒光，說明龍眼DlDCL4定位于細胞核中。

2.4? 龍眼DlDCL4在外源ABA和SA處理下表達模式

從圖5可知，濃度為100 μmol/L外源ABA處理能顯著下調(diào)處理可顯著下調(diào)DlDCL4的表達。而在100 μmol/L的外源SA處理下，DlDCL4的表達量明顯上調(diào)，處理8、24 h時，其表達量顯著上調(diào)。

3? 討論

DCL屬于RNase Ⅲ家族，在進化上高度保守。序列分析表明，各物種的DCL都具有相似的結(jié)構(gòu)域。由于DCL4的功能是剪切dsRNA產(chǎn)生siRNA，所以不難理解其作用于細胞核中[3]。本研究的亞細胞定位結(jié)果表明，龍眼DCL4蛋白定位于龍眼細胞核中，本研究結(jié)果與高粱[24]以及擬南芥[25]的DCL4亞細胞定位結(jié)果相同，推測DCL4在這幾個物種間有著相似的功能。

研究表明，在一定濃度范圍下，外源SA激素處理可以誘導煙草對某些病毒的獲得性抗性[23]。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過誘導劑處理后，柑橘對黃龍病的抗性有了極顯著的提高，同時SA代謝通路中的關(guān)鍵基因上調(diào)表達4～10倍[26]。在龍眼中研究發(fā)現(xiàn)，SA處理可以使抗病原相關(guān)基因的顯著性上調(diào)表達[27]。除此之外，在葡萄抗霜霉病[28]、番茄抗葉霉病[29]、蘋果抗輪紋病[30]等植物對生物性病原的抗性研究中均有類似的發(fā)現(xiàn)。以上研究結(jié)果表明，SA信號傳導途徑在植物響應非生物脅迫過程中發(fā)揮了重要作用。同時也有研究發(fā)現(xiàn)，SA可以通過上調(diào)21 nt的siRNA含量導致擬南芥染色體著絲粒區(qū)域的兆堿基規(guī)模的甲基化這一途徑提高其對植物病原體的抗性[31]，DCL4蛋白在大部分生物中的主要功能是特異性切割長鏈dsRNA產(chǎn)生siRNA作用于相關(guān)靶基因，沉默其表達進而調(diào)控植株的生長發(fā)育和抗性反應[32]。研究發(fā)現(xiàn)SA可以沉默馬鈴薯梅豆病毒的RNA的轉(zhuǎn)錄[33]。在本試驗中，外源SA激素處理后，龍眼胚性愈傷組織的DCL4顯著性上調(diào)表達，由此我們推測，外源SA通過誘導DCL4基因的上調(diào)表達響應病害脅迫。

在本研究中分別用含有100 μmol/L的ABA和100 μmol/L的SA處理龍眼胚性愈傷組織，結(jié)果表現(xiàn)出ABA抑制DlDCL4表達甚至沉默，而SA明顯促進DlDCL4表達。已有研究表明，體胚細胞發(fā)生過程中，單獨加入ABA會抑制其發(fā)生[34]，在龍眼胚性愈傷組織中的試驗也證明了在外源ABA存在的情況下，DlDCL4的表達受到明顯的抑制[16]，但是本研究對其進行時間梯度處理下DlDCL4的表達量總體沒有表現(xiàn)出變化趨勢，這可能和ABA處理的濃度有關(guān)，外源ABA濃度太高導致時間梯度處理對DlDCL4的表達量不產(chǎn)生影響;在對抗棉花抗枯萎病相關(guān)基因WRKY的研究中發(fā)現(xiàn)，在使用外源SA處理3 h后WRKY的表達量出現(xiàn)最大值[35]，并且推測SA可以刺激棉花在短時間內(nèi)對枯萎病毒產(chǎn)生應激反應。在本研究中DlDCL4在SA處理8 h時出現(xiàn)最大表達量，和其結(jié)果相類似，因此，猜測8 h是DlDCL4響應外源SA刺激時的關(guān)鍵時間。DlDCL4在龍眼體愈傷組織階段響應激素應答和抵抗非生物脅迫的具體機制還需要進一步深入研究。

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責任編輯：黃東杰