宋天曉 蘇文瑾 劉意 饒莉萍 Soviguidi Deka Reine Judesse 楊新筍 朱國鵬

摘? 要：黃烷酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）是黃酮類化合物合成途徑中的一個關(guān)鍵酶。本研究基于前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以‘福菜薯7-6葉片為材料成功克隆CDS序列長度為1107 bp的基因IbF3H，利用生物信息學(xué)分析甘薯F3H基因的序列特征、氨基酸序列對比、蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹、蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)、預(yù)測其跨膜結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位，并利用qRT-PCR分析鹽旱脅迫處理下基因的表達(dá)特性。結(jié)果表明，該基因含有3個外顯子和2個內(nèi)含子，編碼368個氨基酸，蛋白分子量為41.12 kDa，等電點(diǎn)為5.83。存在多種類型的啟動子順式作用元件，如光響應(yīng)元件G-Box、ACE，干旱脅迫相關(guān)的MBS元件，與脫落酸激素響應(yīng)相關(guān)的ABRE元件等。與其他植物的氨基酸序列相似性達(dá)到了80%以上，可見IbF3H的編碼區(qū)高度保守，且黃烷酮3-羥化酶在進(jìn)化上具有較高的保守性。IbF3H蛋白含有非血紅素雙加氧酶結(jié)構(gòu)域（DIOX-N superfamily）和典型的F3H蛋白功能結(jié)構(gòu)域（2OG-FeⅡ-Oxy加氧酶結(jié)構(gòu)域），屬于雙加氧酶超家族。IbF3H蛋白可能在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)并且不具備跨膜結(jié)構(gòu)。qRT-PCR研究結(jié)果表明，IbF3H基因并非組織特異性表達(dá)的基因，葉和莖表達(dá)量高于莖尖和根。模擬鹽脅迫處理后，IbF3H基因表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢;模擬干旱脅迫處理后，IbF3H基因表達(dá)量始終高于對照組，以響應(yīng)逆境脅迫。本研究可為下一步探索IbF3H基因在調(diào)控甘薯類黃酮生物合成途徑和功能作用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甘薯;黃烷酮3-羥化酶基因;qRT-PCR;脅迫表達(dá)

中圖分類號：S531????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Cloning and Expression Analysis of Sweetpotato Flavanone 3-Hy- droxylase Gene IbF3H

SONG Tianxiao1，2， SU Wenjin1， LIU Yi1，3， RAO Liping1，3， Soviguidi Deka Reine Judesse1，3， YANG Xinsun1*， ZHU Guopeng2

1. Food Crops Institute， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan， Hubei 430064， China; 2. College of Horticulture， Hainan University / Key Laboratory for Quality Regulation of Tropical Horticultural Plants of Hainan Province， Haikou， Hainan 570228， China; 3. College of Agriculture， Yangtze University， Jingzhou， Hubei 434025， China

Abstract： Flavanone 3-hydroxylase （F3H） is a key enzyme in the synthesis of flavonoids. In this study， based on previous transcriptome data， a 1107 bp IbF3H CDS sequence was successfully cloned from ‘Fucaishu 7-6 leaves， using bioinformatics to analyze sweetpotato F3H gene sequence characteristics， amino acid sequence comparison， protein phylogenetic tree， secondary and tertiary structure of protein， predicting transmembrane structure， subcellular localization， and using qRT-PCR methods to analysis gene expression characteristics under simulated salt and drought stress. The results showed that the gene contained 3 exons and 2 introns， encoding 368 amino acids， the protein molecular weight was 41.12 kDa， and the isoelectric point was 5.83. There were types of promoter cis-acting elements， such as light-responsive elements G-Box and ACE， MBS elements related to drought stress， ABRE elements related to abscisic acid hormone response， etc. The amino acid sequence similarity with other plants was more than 80%. It could be seen that the coding region of IbF3H was highly conserved， and the flavanone 3-hydroxylase was highly conservative in evolution. The IbF3H protein contained a non-heme dioxygenase domain （DIOX-N superfamily） and a typical F3H protein functional domain （2OG-FeⅡ-Oxy oxygenase domain） and belonged to the dioxygenase superfamily. IbF3H protein may be expressed in the cytoplasm and without a transmembrane structure. The qRT-PCR experiment showed that the IbF3H gene was not a tissue-specific expressed gene， and the expression level of leaves and stems was higher than that of stem tips and roots. After simulated salt stress treatment， IbF3H gene expression showed a trend of decreasing first and then increasing; after simulated drought stress treatment， IbF3H gene expression was always higher than the control group in response to adversity stress. This study could lay the foundation for the next step to explore the IbF3H gene in regulating the sweet potato flavonoid biosynthesis pathway and function.

Keywords： sweet potato; flavanone 3-hydroxylase gene; qRT-PCR; stress expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.004

甘薯[Ipomoea batatas （L.） Lam.]屬于旋花科、甘薯屬的同源六倍體植物[1]，是重要的糧食、飼料、工業(yè)原料作物和新型的生物能源作物，且具有極高的營養(yǎng)保健價值[2]。

甘薯中的酚類化合物主要包括酚酸、花色苷和類黃酮3大類[3]。其中類黃酮是植物的次生代謝產(chǎn)物，廣泛分布于植物界并具有較強(qiáng)的生物活性[4]。研究表明黃酮類化合物對植物的生長、發(fā)育和繁殖尤為重要，也有利于維持人類健康[5-7]。黃烷酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）是黃酮類化合物合成途徑中的一個關(guān)鍵酶，屬于依賴2-酮戊二酸的雙加氧酶家族[8-9]。F3H催化4，5，7′-黃烷酮C3位的羥基化合成二氫山奈素（dihydrokaempferol，DHK），二氫山奈素是合成黃酮醇、前花色素苷、花青素的重要前體物質(zhì)，而編碼黃烷酮3-羥化酶的F3H基因也是調(diào)控植物體內(nèi)類黃酮代謝物積累的關(guān)鍵功能基因[10]。在辣椒和菊花中F3H基因是花青素代謝和積累途徑的關(guān)鍵基因[11-12];阻斷擬南芥F3H基因表達(dá)可以降低黃酮及花色素含量[13]。目前，F(xiàn)3H基因在許多植物中已經(jīng)被克隆和研究，比如龍眼[8]、百合[9]、苦蕎[14]等。就甘薯而言，黃元射等[15]克隆了紫薯‘渝紫7號中的黃烷酮3-羥化酶基因并分析其氨基酸序列和蛋白三維結(jié)構(gòu)特征;Lalusin等[16]研究發(fā)現(xiàn)了甘薯F3H基因在紫色和黃色品種中不同組織部位均有表達(dá)，不同發(fā)育時期表達(dá)情況不同;Hou等[17]研究發(fā)現(xiàn)弱光條件下紫肉甘薯貯藏根中與花色苷生物合成有關(guān)的IbF3H的mRNA水平受到抑制。對于甘薯F3H基因的生物信息學(xué)分析、組織特異性表達(dá)、干旱和鹽脅迫處理下基因表達(dá)情況研究較少。本研究以此為切入點(diǎn)，以前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，篩選出一個與類黃酮生物合成密切相關(guān)的基因F3H，以‘福菜薯7-6為實(shí)驗材料，克隆該基因，并將其命名為“IbF3H”。以生物信息學(xué)方法分析該基因的序列和蛋白結(jié)構(gòu)特征，以qRT-PCR方法分析IbF3H基因在不同品種、不同組織及模擬鹽旱脅迫處理下基因的表達(dá)情況。以期為進(jìn)一步解析IbF3H基因在調(diào)控甘薯類黃酮生物合成途徑和功能研究奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試甘薯品種為‘福菜薯7-6‘EC16和‘福菜薯18，均種植于湖北省農(nóng)科院糧食作物研究所盆栽場。以成熟的‘福菜薯7-6葉片為材料進(jìn)行基因克隆，取栽后20 d的‘福菜薯7-6和‘EC16的根、莖、莖尖、葉進(jìn)行qRT-PCR分析，取樣時液氮速凍1h后置于–80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將經(jīng)胚性愈傷誘導(dǎo)形成的‘福菜薯18再生植株接種于MS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為：28 ℃，光照條件為2000～3000 lx，16 h光照，8 h黑暗。4周后，取30株長勢基本一致的植株，無菌水洗凈殘留培養(yǎng)基后，移至1/2的霍格蘭溶液中馴化培養(yǎng)3 d。馴化后的植株各取15株分別放入含有30% PEG 6000和200 mmol/L NaCl的1/2霍格蘭溶液中，分別模擬干旱和鹽脅迫處理。鹽脅迫處理0、1、6、12 h，干旱脅迫為0、1、6、12、24 h處理，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。將處理后的植株液氮速凍，研磨成粉，置于–80 ℃冰箱保存，用于鹽脅迫和干旱脅迫處理后的qRT-PCR分析。

1.2? 方法

1.2.1? IbF3H基因的克隆? 利用全式金生物技術(shù)的通用植物總RNA提取試劑盒提取‘福菜薯7-6葉片總RNA，置于–80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆茫褂肨aKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

基于轉(zhuǎn)錄組測序獲得的Gene ID在甘薯野生種基因組網(wǎng)站http：//sweetpatato.plantbiology. msu.edu/index.shtml中進(jìn)行檢索，獲得該基因的CDS序列。利用Primer 5.0軟件在參考序列CDS序列兩端設(shè)計特異性引物，克隆獲得IbF3H基因。反應(yīng)總體系為50 μL（表1）?？寺CR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。

利用TaKaRa公司pMD?19-T載體構(gòu)建IbF3H克隆載體。連接反應(yīng)總體積為10 μL：pMD?19-T載體1 μL，反應(yīng)液5 μL，IbF3H的PCR回收產(chǎn)物4 μL，16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，搖菌6～8 h。吸取200 μL轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞，將其均勻涂抹在含有氨芐霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。挑選單克隆搖菌后進(jìn)行陽性克隆檢測，反應(yīng)總體系為25 μL（表2）。

挑選陽性菌液測序，利用DNAMAN V6.0軟件分析序列信息，將測序正確的菌液保存。被保存的陽性菌液進(jìn)一步增殖，提取pMDTM19- T-IbF3H質(zhì)粒。質(zhì)粒PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性35 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。

1.2.2?? IbF3H生物信息學(xué)分析? 利用相關(guān)平臺或軟件對IbF3H基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，相關(guān)生物信息學(xué)分析工具見表3。

1.2.3?? IbF3H基因的表達(dá)分析? ‘福菜薯7-6‘EC16和‘福菜薯18的RNA提取與cDNA反轉(zhuǎn)錄參照IbF3H基因克隆的方法。利用Primer 5.0軟件設(shè)計IbF3H基因的熒光定量特異性引物，以甘薯肌動蛋白β-Actin基因為內(nèi)參基因，參照TransStart Tip Green qPCR SuperMix試劑盒說明書（全式金生物技術(shù)），在熒光定量PCR儀（BIO-RAD）上進(jìn)行擴(kuò)增，每個反應(yīng)3次重復(fù)。反應(yīng)體系如表4所示，熒光定量PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，40個循環(huán);溶解曲線設(shè)置為65 ℃ 5 s到95 ℃，增量為0.5 ℃。檢測IbF3H基因在不同品種、不同組織、不同處理條件下的表達(dá)狀況，利用2-ΔΔCT法計算出基因的相對表達(dá)量。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)利用Excel和SAS 8.1統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），采用Duncan法對處理之間以及同一處理隨時間變化的差異性進(jìn)行多重比較分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? IbF3H基因的克隆

采用同源克隆的方法，以‘福菜薯7-6葉片RNA為模板，以參考基因組CDS序列設(shè)計引物，克隆得到IbF3H，其CDS長度為1107 bp（圖1）。

2.2? IbF3H基因的生物信息學(xué)分析

IbF3H預(yù)測的基因外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)如圖2所示，含有3個外顯子和2個內(nèi)含子。選取IbF3H基因上游1500 bp的序列范圍進(jìn)行啟動子順式作用元件預(yù)測，結(jié)果顯示，啟動子范圍內(nèi)存在多種類型的啟動子順式作用元件（圖3）：（1）光響應(yīng)元件G-Box、ACE、TCCC-motif;（2）起始子和增強(qiáng)子元件TATA-box，CAAT-box;（3）干旱脅迫響應(yīng)元件MBS;（4）植物激素響應(yīng)元件，與脫落酸激素響應(yīng)相關(guān)的ABRE元件;（5）蛋白代謝相關(guān)元件O2-site等。上述結(jié)果表明，IbF3H啟動子可能受光調(diào)控，其活性可能受到一些激素和非生物脅迫的調(diào)控。

IbF3H蛋白編碼368個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量為41.12 kDa，等電點(diǎn)為5.83。氨基酸序列對比結(jié)果顯示：甘薯IbF3H與其他物種F3H基因編碼的氨基酸序列具有較高的同源性，其中與蔦蘿、圓葉牽牛、高杯花、栽培茄子同源一致性分別為92.99%、92.45%、83.02%、82.75%，與其他植物的氨基酸序列相似性達(dá)到了80%以上（圖4）。除此之外，與其他品種甘薯的IbF3H1（GenBank登錄號為BAA75309.1）、IbF3H2（ANA53146.1）、IbF3H3（BAA75307.1）氨基酸序列對比一致性分別達(dá)到了98.92%、97.04%、96.23%，可見IbF3H蛋白的編碼區(qū)高度保守，從而進(jìn)一步證明所克隆的基因確為甘薯F3H基因。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，甘薯IbF3H蛋白與蔦蘿、圓葉牽牛的關(guān)系較近，與枸杞、黑果枸杞等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖5）。

通過PredictProtein平臺在線預(yù)測結(jié)果顯示IbF3H蛋白二級結(jié)構(gòu)中有56.79%的無規(guī)則卷曲（Random coil）、28.26%的α螺旋（Alpha helix），14.95%的β-折疊（β-sheet）結(jié)構(gòu)構(gòu)成?？赡茉诘?5、170、191、206個氨基酸處存在二硫鍵。預(yù)測結(jié)果顯示，IbF3H蛋白中可能含有cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)、酰胺化位點(diǎn)、ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn)motif A（P環(huán)）等功能位點(diǎn)。通過SMART蛋白結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫預(yù)測可知，IbF3H蛋白含有非血紅素雙加氧酶結(jié)構(gòu)域（DIOX-N superfamily）和典型的F3H蛋白功能結(jié)構(gòu)域（2OG- FeⅡ-Oxy加氧酶結(jié)構(gòu)域），屬于雙加氧酶超家族。

通過TMpred在線軟件預(yù)測表明，IbF3H蛋白可能不具備跨膜結(jié)構(gòu)（圖6）。亞細(xì)胞定位預(yù)測IbF3H蛋白可能在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。IbF3H蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測如圖7所示，有30.27%的氨基酸與模板蛋白氨基酸相一致，達(dá)到了建模的要求（>30%），有36%的相似氨基酸序列結(jié)構(gòu)與模板蛋白覆蓋率達(dá)到了92%。

2.3? IbF3H基因的表達(dá)特性分析

qRT-PCR結(jié)果表明（圖8），對于甘薯‘福菜薯7-6品種，IbF3H在莖中表達(dá)量顯著高于莖尖;在‘EC16中，葉的表達(dá)量極顯著高于根部;IbF3H在甘薯多個組織中均有表達(dá)，說明IbF3H并非組織特異性表達(dá)的基因。相對而言，葉和莖表達(dá)量高于莖尖和根，這可能與甘薯黃烷酮3-羥化酶在不同部位合成和作用有關(guān)。

利用200 mmol/L NaCl和30% PEG6000模擬鹽脅迫和干旱脅迫處理（圖9），IbF3H對NaCl響應(yīng)是先降低后升高的趨勢，在1 h和6 h表達(dá)量低于對照組，在12 h表達(dá)量高于對照組;在對PEG6000的響應(yīng)中，處理組一直高于對照，并在24 h時表達(dá)量達(dá)到最高，極顯著高于1、6、12 h。推測IbF3H在鹽脅迫和干旱脅迫處理后，參與類黃酮化合物合成，響應(yīng)逆境脅迫。

3? 討論

隨著植物多酚化學(xué)和藥理學(xué)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到多酚類次生代謝物質(zhì)是具有獨(dú)特生理活性和藥理活性的天然產(chǎn)物[18]。F3H基因作為核心類黃酮——花青素途徑的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因之一[19]，越來越受到人們的關(guān)注。本研究以‘福菜薯7-6甘薯葉片cDNA為模板，成功克隆出IbF3H基因，其CDS序列為1107 bp，與黃元射等[15]克隆的‘渝紫薯7號F3H基因序列長度一致，與前人在檸條錦雞兒[20]、百合[9]、苦蕎[14]等其他植物上研究相接近。該基因含有3個外顯子和2個內(nèi)含子，編碼368個氨基酸，蛋白分子量為41.12 kDa，等電點(diǎn)為5.83。與其他植物的氨基酸序列相似性達(dá)到了80%以上，其中與蔦蘿、圓葉牽牛等相似度較高，達(dá)到了90%以上。蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，甘薯IbF3H與蔦蘿、圓葉牽牛等旋花科植物親緣關(guān)系較近，可見IbF3H的編碼區(qū)高度保守，且黃烷酮3-羥化酶在進(jìn)化上具有較高的保守性。IbF3H蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示含有非血紅素雙加氧酶結(jié)構(gòu)域（DIOX-N superfamily）和典型的F3H蛋白功能結(jié)構(gòu)域（2OG-FeⅡ-Oxy加氧酶結(jié)構(gòu)域），屬于雙加氧酶超家族。與王海竹等[21]關(guān)于醋栗F3H的研究結(jié)果一致。預(yù)測結(jié)果顯示IbF3H蛋白可能不具備跨膜結(jié)構(gòu)，并在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，與曹芳芳[22]關(guān)于F3H基因總結(jié)的規(guī)律類似。干旱脅迫下，紅砂F3H酶活性隨著干旱脅迫處理時間的延長，先升高后降低至處理前水平[23]。枸杞F3H基因的過表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因煙草對干旱脅迫的耐受性，提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗氧化酶和黃酮-3-醇的含量[24]。鹽脅迫下，不同濃度的鹽脅迫均能不同程度地提高枳實(shí)生苗中F3H基因的上調(diào)表達(dá)，進(jìn)行脅迫響應(yīng)[25]。過表達(dá)茶樹F3H基因，可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性[26]。低溫、高鹽、干旱和高溫脅迫均能誘導(dǎo)檸條F3H基因的表達(dá)，推測檸條F3H基因參與了非生物脅迫應(yīng)答[27]。由此可見，當(dāng)植物受到逆境脅迫時，F(xiàn)3H促進(jìn)花青素的積累，增強(qiáng)抗氧化能力，從而抵御逆境。qRT-PCR結(jié)果表明，IbF3H基因并非組織特異性表達(dá)的基因，葉和莖表達(dá)量高于莖尖和根，這與張星等[9]、胡曉婧等[10]在百合和茶樹中關(guān)于LhSorF3H并非組織特異性表達(dá)的基因、CsF3H在葉中表達(dá)量較高觀點(diǎn)一致;模擬鹽旱脅迫處理后，IbF3H基因表達(dá)量在NaCl脅迫響應(yīng)中呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，在30% PEG6000脅迫響應(yīng)中表達(dá)量一直高于對照組，以響應(yīng)逆境脅迫。與鄭晟等[20]、侯伶俐等[28]在檸條錦雞兒、苦蕎等植物中鹽旱模擬處理下F3H基因表達(dá)量變化趨勢相似。

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