祝友朋，韓長(zhǎng)志

(西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院/云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

【研究意義】近些年，學(xué)術(shù)界關(guān)于植物病原真菌[1]、卵菌[2]、細(xì)菌[3]中碳水化合物活性酶類(lèi)(Carbohydrate-Active Enzymes, CAZymes)的研究已涉及預(yù)測(cè)、遺傳關(guān)系分析、蛋白互作等[3-4]以及在植物與病原菌互作過(guò)程中的功能等領(lǐng)域[5]，并呈現(xiàn)出較快的增長(zhǎng)趨勢(shì)[6]?？莶菅挎邨U菌BEST195作為納豆菌的一種，是納豆生產(chǎn)中重要的工業(yè)菌株之一，CAZymes蛋白影響著納豆的產(chǎn)量，但尚不清楚枯草芽孢桿菌BEST195的CAZymes的情況?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有關(guān)CAZymes形成CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.cazy.org/)[7]，主要涉及以下6大類(lèi)，糖苷水解酶(GHs)、糖基轉(zhuǎn)移酶(GTs)、多糖裂解酶(PLs)、碳水化合物酯酶(CEs)、輔助酶類(lèi)家族(AAs)以及碳水化合物綁定結(jié)構(gòu)(CBMs)[6]。CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)是專(zhuān)業(yè)描述碳水化合物功能域相關(guān)酶的數(shù)據(jù)庫(kù)[7-8]，為開(kāi)展細(xì)菌中CAZymes的注釋與聚類(lèi)分析提供了基礎(chǔ)[9]。到目前為止該數(shù)據(jù)庫(kù)中GH、GT、PL、CE、AA、CBM類(lèi)別的家族數(shù)量分別為167、110、40、17、16、86個(gè)，其數(shù)量相比之前均有一定的增加?？莶菅挎邨U菌BEST195(Bacillussubtilissubsp.nattoBEST195)是日本三菱化學(xué)生命研究所從納豆中分離到的枯草芽孢桿菌納豆亞種[10]，主要產(chǎn)生多聚γ-谷氨酸(poly-γ-glutamic acid, γPGA)[11]，然后將大豆發(fā)酵為納豆。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)納豆菌的研究集中在代謝產(chǎn)物納豆激酶[12]、抗菌作用[13]等方面，細(xì)菌分泌蛋白的研究主要有香蕉細(xì)菌性軟腐病菌[14]、茄青枯病菌[15]、丁香假單胞桿菌番茄致病變種[16]等植物病原細(xì)菌及枯草芽孢桿菌XF-1生防菌[17]等。【本研究切入點(diǎn)】前人根據(jù)枯草芽孢桿菌BEST195的全基因組序列[18-19]與其他枯草芽孢桿菌菌株進(jìn)行比較基因組分析，發(fā)現(xiàn)γPGA的產(chǎn)生與鞭毛蛋白FliF有直接關(guān)系[11]，且CAZymes影響著γPGA的產(chǎn)量，進(jìn)而影響著納豆的產(chǎn)量。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】前期通過(guò)分泌蛋白的預(yù)測(cè)明確枯草芽孢桿菌BEST195含有102個(gè)分泌蛋白[20]，然而，尚不清楚該菌中CAZymes的情況。利用在線工具CAT(CAZymes Analysis Toolkit)進(jìn)行預(yù)測(cè)，網(wǎng)址為(http://cricket.ornl.gov/cgi-bin/cat.cgi)[9]，同時(shí)對(duì)上述CAZymes進(jìn)行遺傳關(guān)系及相互作用分析，為今后研究枯草芽孢桿菌BEST195的CAZymes在納豆發(fā)酵時(shí)的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

首先，利用CAT[9]對(duì)前期獲得枯草芽孢桿菌BEST195的102個(gè)分泌蛋白[18]開(kāi)展CAZymes預(yù)測(cè)，獲得CAZymes，然后對(duì)CAZymes進(jìn)行遺傳關(guān)系分析，先利用ClustalX[21]進(jìn)行多重比對(duì)，隨后利用MEGA 7.0[22]采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[23]；最后，利用STRING v.10[24]開(kāi)展蛋白相互作用預(yù)測(cè)，明確CAZymes蛋白之間的相互關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 CAZymes的預(yù)測(cè)分析

枯草芽孢桿菌BEST195中含有57個(gè)CAZymes，其中尤以GH最多，數(shù)量為27個(gè)，所占比例為47.37%；其次是CBM，為21個(gè)，所占比例為36.84%；PL、CE、GT的數(shù)量分別為4、2、1，所占比例分別為7.02%、3.51%、1.75%。同時(shí)，該菌中僅含有一種復(fù)合型酶類(lèi)，即GH/CBM，數(shù)量為2個(gè)，所占比例為3.51%(圖1)。

圖1 枯草芽孢桿菌BEST195中CAZymes的分布情況

2.2 GH的數(shù)量

進(jìn)一步分析57個(gè)CAZymes中的糖基水解酶蛋白，共有14種，其中GH23數(shù)量最多，為6個(gè)；其次是GH18，數(shù)量為5個(gè)，上述蛋白所占比例為40.74%；再次，還涉及GH3、GH47、GH53、GH73等類(lèi)型，數(shù)量均為2個(gè)，所占比例合計(jì)為29.63%(圖2)。此外，還包括GH1、GH13、GH16、GH19、GH30、GH32、GH46、GH102等類(lèi)型(圖2)。

圖2 枯草芽孢桿菌BEST195中糖基水解酶蛋白的分布情況

2.3 CBM的數(shù)量

碳水化合物綁定結(jié)構(gòu)蛋白含有CBM5、CBM9、CBM12、CBM13、CBM32、CBM50、CBM57、CBM66共8種類(lèi)型，其中CBM50的數(shù)量最多，為11個(gè)，所占比例為52.38%；其次是CBM5，數(shù)量為3個(gè)，再次是CBM32，數(shù)量為2個(gè)(圖3)，其他5種類(lèi)型CBM的數(shù)量均為1個(gè)。

圖3 枯草芽孢桿菌BEST195中碳水化合物綁定結(jié)構(gòu)蛋白的分布情況

2.4 PL、CE和GT的數(shù)量

多糖裂解酶含有PL1、PL3、PL9、PL11共4種類(lèi)型，數(shù)量均為1個(gè)，其ID分別是gi|428278239、gi|428281087、gi|428281263、gi|674709029；碳水化合物酯酶含有CE4、CE12此2種類(lèi)型，數(shù)量均為1個(gè)，其ID分別為gi|428278282、gi|428281562；糖基轉(zhuǎn)移酶僅有GT2這1個(gè)，其ID為gi|428279498。

2.5 復(fù)合型CAZymes的數(shù)量

在所有CAZymes中，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)復(fù)合類(lèi)型：GH102/CBM50、GH32/CBM66，其ID分別為gi|428279554、gi|428280145。

2.6 CAZymes的遺傳關(guān)系分析

通過(guò)對(duì)上述CAZymes的遺傳關(guān)系進(jìn)行分析，明確存在GH/PL/CBM、GH/CBM、GH/CBM/CE/PL、GH/CBM/CE/PL/GT等類(lèi)型，但前期所預(yù)測(cè)的復(fù)合類(lèi)型僅涉及GH102/CBM50、GH32/CBM66 2類(lèi)，還有GH/PL/CBM、GH/CBM/CE/PL、GH/CBM/CE/PL/GT 3類(lèi)未能預(yù)測(cè)(圖4)。對(duì)上述3大類(lèi)進(jìn)行分析，明確上述類(lèi)別中均含有GH、CBM、PL，還有部分CE、GT也存在其中。此外，對(duì)于GH/CBM類(lèi)別，可以很清楚的發(fā)現(xiàn)，存在2個(gè)重要的分支，并未聚在一起(圖4)，其原因有待進(jìn)一步通過(guò)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

圖4 枯草芽孢桿菌BEST195中CAZymes之間的遺傳關(guān)系分析

2.7 CAZymes蛋白的相互關(guān)系分析

利用STRING v.10[22]分析枯草芽孢桿菌BEST195的CAZymes蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中尚缺少枯草芽孢桿菌BEST195的有關(guān)數(shù)據(jù)，利用同源比對(duì)方式，以枯草芽孢桿菌168(Bacillussubtilis168)中同源蛋白進(jìn)行后續(xù)研究，發(fā)現(xiàn)大部分CAZymes蛋白已經(jīng)明確其結(jié)構(gòu)特征(圖5中大球)，因此，為今后進(jìn)一步開(kāi)展大多數(shù)CAZymes功能分析及相互作用關(guān)系研究提供了重要的理論支撐。另外，yvnB(YP_005562834.1)、yngK(YP_005561221.1)、yfhK(YP_005560079.1)、yckB(YP_005559509.1)、ybbC(YP_005559318.1)、lytB(YP_005562902.1)、tcyA(YP_005559538.1)、yurO(YP_005561206.1)、yvbX(YP_005560187.1)、yocH(YP_005561289.1)、wapA(YP_005563320.2)等蛋白，其結(jié)構(gòu)特征尚未明確(圖5)，但在與其他已知關(guān)系蛋白中，發(fā)揮著重要的作用。

圖5 枯草芽孢桿菌BEST195中CAZymes蛋白的相互關(guān)系分析

3 討 論

一般而言，CAZymes是植物病原真菌、細(xì)菌中非常重要的一類(lèi)蛋白，在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中有著不可或缺的作用[3-4,25]。但有關(guān)非植物病原菌CAZymes的研究報(bào)道較少[26-27]?？莶菅挎邨U菌BEST195的分泌蛋白依據(jù)CAT網(wǎng)站獲得其CAZymes，是否能完全預(yù)測(cè)枯草芽孢桿菌BEST195的CAZymes，需要后續(xù)進(jìn)行驗(yàn)證。另外，前人所開(kāi)展CAZymes的具體類(lèi)別有5個(gè)，分別是GH、GT、PL、CE、CBM，而根據(jù)最新的分類(lèi)類(lèi)別，有6個(gè)，分別是GH、GT、PL、CE、AA、CBM，這是CAZymes最新分類(lèi)方面的報(bào)道。

前期通過(guò)分泌蛋白預(yù)測(cè)和CAZymes預(yù)測(cè)得到枯草芽孢桿菌XF-1的分泌蛋白的數(shù)量為104個(gè)，CAZymes的數(shù)量為58個(gè)，其中26個(gè)GH、21個(gè)CBM以及2個(gè)CE、3個(gè)PL、2個(gè)GT、4個(gè)GH/CBM，枯草芽孢桿菌BEST195的分泌蛋白的數(shù)量為102個(gè)，CAZymes的數(shù)量為57個(gè)。2個(gè)枯草芽孢桿菌菌株間的分泌蛋白數(shù)量和CAZymes數(shù)量較為相近，但CAZymes的種類(lèi)存在一定的差異，主要表現(xiàn)為枯草芽孢桿菌BEST195含有GH1、GH16、GH30、CBM13、PL9、PL11、GT39，主要功能為分解木聚糖、葡聚糖、甘露糖和鼠李糖等，枯草芽孢桿菌XF-1含有GH43、GH68、CBM26、CBM63、GH3/CBM50、GH13/CBM26，主要功能為分解木糖、蔗糖、淀粉和纖維素等?？莶菅挎邨U菌BEST195作為納豆發(fā)酵菌，其作用為產(chǎn)生γPGA，進(jìn)而將大豆發(fā)酵成納豆，枯草芽孢桿菌XF-1作為生防菌，其作用為抑制病原菌生長(zhǎng)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)，菌株發(fā)揮的作用與CAZymes的種類(lèi)差異息息相關(guān)。但造成CAZymes的種類(lèi)差異是否與菌株的生長(zhǎng)環(huán)境及其發(fā)揮的作用有關(guān)有待于驗(yàn)證。

通過(guò)對(duì)枯草芽孢桿菌BEST195的CAZymes開(kāi)展遺傳關(guān)系分析以及蛋白相互關(guān)系分析，明確CAZymes的分類(lèi)有待于向更細(xì)、更小的方向進(jìn)行，前人分析也有相同結(jié)果[25]，同時(shí)，對(duì)于CAZymes蛋白之間的互作關(guān)系有待明確。

4 結(jié) 論

利用CAT進(jìn)行預(yù)測(cè)，明確枯草芽孢桿菌BEST195中CAZymes的數(shù)量為57個(gè)，分別為27個(gè)GH、21個(gè)CBM、2個(gè)CE、4個(gè)PL、1個(gè)GT和2個(gè)GH/CBM。同時(shí)，對(duì)上述CAZymes開(kāi)展了遺傳關(guān)系分析及蛋白之間互作研究，明確CAZymes蛋白之間具有相互作用的關(guān)系。為枯草芽孢桿菌BEST195的CAZymes的功能分析以及彼此之間相互作用研究打下了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。