張梅花，楊 芳，馬 露，宋嘉馳，申亞桐

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

【研究意義】馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是茄科茄屬一年生草本植物，具有較強的適應(yīng)性，且產(chǎn)量較高，富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，可用作多種產(chǎn)品的加工原料，是重要的糧菜兼用及經(jīng)濟(jì)性作物之一。全球每年生產(chǎn)馬鈴薯近4億t，與小麥、水稻、玉米統(tǒng)稱為世界4大糧食作物[1-2]。隨著中國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，目前中國已成為世界馬鈴薯第一生產(chǎn)大國，馬鈴薯種植面積和產(chǎn)量均占世界的 1/4[3]，居于首位。馬鈴薯作為中國重要的糧食作物，分布廣，可周年生產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)效益好，對于保證中國食物安全、促進(jìn)貧困地區(qū)脫貧增收和地區(qū)經(jīng)濟(jì)振興崛起意義重大[4]。但是，馬鈴薯塊莖在收獲、運輸和儲藏等過程中均易受到各類機(jī)械損傷，若不及時修復(fù)，會造成含水量下降，并且為病原的侵染提供了路徑，增加感病率，加速馬鈴薯塊莖品質(zhì)的退化，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5]。因此，如何加速薯塊創(chuàng)傷后的愈合成為一個亟待解決的問題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】塊莖損傷或受到外界壓力時，損傷細(xì)胞會釋放多種信號，刺激產(chǎn)生各種保護(hù)性或創(chuàng)傷誘導(dǎo)的反應(yīng)，其中就包括木栓化[6-7]。木栓化的組織能夠?qū)⑹韷K內(nèi)部組織與外界環(huán)境隔離開，抑制水分的快速散失和病原菌的進(jìn)一步侵染。軟木脂是塊莖創(chuàng)傷后木栓化過程中合成的重要物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)損傷愈合和受環(huán)境脅迫的組織中，如因非生物脅迫和微生物侵染等造成損傷的部位含有大量的軟木脂。軟木脂是由甘油、脂肪酸與酚類化合物形成的高分子雜聚物，它可以控制水分和溶質(zhì)的流出，在植物抵抗環(huán)境脅迫和病原微生物侵染等脅迫過程中發(fā)揮重要作用[8]。硝普酸鈉(sodium nitroprusside，SNP)是“自發(fā)”的一氧化氮(nitric oxide，NO)供體，在水溶液溶解中就可釋放NO。2-(4-羧基苯基)-4，4，5，5，-四甲基-1，3-二氧咪唑啉鉀鹽(Carboxy-PTIO potassium salt，cPTIO)為NO專用清除劑，廣泛用于消除植物中NO的累積。是植物發(fā)育和病理生理過程中必不可少的信號分子和調(diào)節(jié)分子。在植物生長發(fā)育過程中，NO在抵御各種生物和非生物脅迫中發(fā)揮著不同的生理作用。Pari′s等研究證明NO參與了馬鈴薯葉片的傷口愈合反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞壁葡聚糖的沉積，并且對創(chuàng)面細(xì)胞胼胝質(zhì)的累積有促進(jìn)作用，創(chuàng)傷相關(guān)基因如苯丙氨酸解氨酶(phenylalanin ammonia-lyase，PAL)、伸展蛋白的表達(dá)經(jīng)SNP處理呈現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，增加的NO水平可能增強植物的愈合反應(yīng)，加快受損組織的恢復(fù)[9]。PAL是軟木脂形成過程中所需木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶，其轉(zhuǎn)錄水平的上升可能暗示NO與創(chuàng)傷后軟木脂的累積有關(guān)聯(lián)。脫落酸(Abscisic acid，ABA)是植物體內(nèi)重要的激素，它能抑制植物生長發(fā)育和細(xì)胞分裂、伸長，同時也促進(jìn)脫落、衰老和休眠，調(diào)節(jié)氣孔開閉，提高植物的抗逆性，是一種重要的脅迫激素[10]。研究表明ABA能提高植物對干旱和高溫等非生物脅迫的抗性，它通過調(diào)節(jié)氣孔的開閉以及小分子有機(jī)化合物的積累，降低水勢，維持較高的滲透壓，從而抑制水分的散失[11-13]。Cottle等用ABA處理馬鈴薯培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)ABA能使軟木脂生物合成過程中軟木脂、蠟質(zhì)的積累增加[14]。此外，ABA 處理能促進(jìn)塊莖愈傷閉合層的形成和愈傷周皮的成熟，木質(zhì)素和閉合層細(xì)胞聯(lián)接成矩形網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞壁強度和厚度[15]?！颈狙芯壳腥朦c】影響薯塊創(chuàng)傷后愈合的因素有很多，主要包括內(nèi)部因素和外部因素兩方面，內(nèi)部因素包括品種和生理年齡等，外部因素主要包括溫度、濕度、創(chuàng)傷程度和外源化學(xué)試劑等。由于不同的因素使得塊莖創(chuàng)傷愈合的效果和速率及形成軟木脂的成分存在較大差異，其中外源NO和ABA具有提高植物抗逆性和形成愈傷的重要作用，但目前有關(guān)二者協(xié)同原生周皮在調(diào)節(jié)不同品種馬鈴薯薯塊創(chuàng)傷后軟木脂積累方面的研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用2個不同品種的馬鈴薯來探討外源NO和ABA以及原生周皮對薯塊創(chuàng)傷后軟木脂積累的影響，進(jìn)一步豐富薯塊創(chuàng)傷后的愈合機(jī)制，同時為加快馬鈴薯創(chuàng)傷愈合的方法提供理論支撐和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試馬鈴薯品種“網(wǎng)紋108”和“滇薯47號”(分別以“W108”和“D47”表示)由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)薯類研究所提供?！癢108”薯塊橢圓形，薯皮白色，薯肉黃色，薯塊表面呈網(wǎng)紋狀開裂；“D47”薯塊圓形，薯皮白色，薯肉白色，薯塊表面光滑。采收時挑選形態(tài)、大小一致，薯皮完整，無機(jī)械損傷、無病蟲害的塊莖，裝入塑料網(wǎng)袋，每袋約10 kg。采后于常溫下放置14 d后儲存在2～8 ℃條件下的冷庫內(nèi)。實驗前從倉庫取出后在常溫條件下平衡2 d，再進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2 實驗方法

將準(zhǔn)備好的馬鈴薯用清水將薯皮洗凈，每個品種挑選40個馬鈴薯，將馬鈴薯分成兩等份，一份去除原周皮，一份保留。后將每個馬鈴薯用刀平均切成8等份(10～15 g)，用純水將薯塊表面游離的淀粉顆粒洗去，以切面為創(chuàng)面。NO和ABA處理濃度均通過前期試驗進(jìn)行篩選。實驗共分為5個試劑處理：對照(超純水，CK)；處理1(1 mmol·L-1SNP)；處理2(2 mmol·L-1SNP)；處理3(0.13 mmol·L-1cPTIO)；處理4(0.1 mmol·L-1ABA)。

將切好的馬鈴薯小塊分成5等份分別放入5個處理燒杯中浸泡1 h，每20 min更換一次處理液。處理后用定性濾紙將傷口表面的處理液除去，整齊放在覆蓋有保鮮薄膜的磁盤上，放置在溫度為22 ℃，相對濕度為90%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行創(chuàng)傷愈合。在塊莖創(chuàng)傷后24、72、120和168 h隨機(jī)取樣，進(jìn)行切片染色觀察。實驗共重復(fù)3次。

軟木脂的積累觀察參考LuLai等的方法并修改[16]。每個處理隨機(jī)選取3個薯塊，用不銹鋼刀片將愈傷塊莖垂直于創(chuàng)面切成厚 0.2～0.3 mm的切片，蒸餾水洗去切片表面的淀粉顆粒，用0.05%的甲苯胺藍(lán)染液染色60 min，染色過程中每10 min輕微震蕩一次，以使染色均勻。后分別用75%乙醇和超純水脫染3次。脫染后再用0.1%中性紅染液復(fù)染90 s，再用75%乙醇和超純水分別脫染3次，將脫染后的切片放于載玻片上制成臨時水封片，于熒光顯微鏡(型號:Leica MD 3000)下觀察，記錄拍照。用軟件LAS Version 4.6.2測量有明顯熒光的組織厚度(圖1)。

A：保留原周皮的塊莖創(chuàng)面；B：去除原周皮的塊莖創(chuàng)面；C：左為保留原周皮的塊莖，右為去除原周皮后的塊莖

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)分析采用SAS 9.3計算機(jī)程序包(SAS Institute Inc.，Cary，NC)的通用線性模型(GLM)程序進(jìn)行分析。文中顯示的數(shù)據(jù)均取3個數(shù)字的統(tǒng)計平均值，統(tǒng)計顯著性為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同試劑處理對馬鈴薯塊莖創(chuàng)傷周皮中軟木脂積累的影響

由表1可知，試劑、處理時間以及二者互作效應(yīng)對2個品種馬鈴薯去皮和不去皮薯塊軟木脂積累均有顯著性影響(P<0.05)。

表1 試劑、時間以及二者互作效應(yīng)對2個品種馬鈴薯薯塊軟木脂積累影響的方差分析

由圖2可知，馬鈴薯塊莖創(chuàng)傷后24 h時均未觀察到軟木脂累積，至72 h在塊莖創(chuàng)面下約2～3層細(xì)胞可觀察到軟木脂累積，之后各處理的軟木脂積累隨著時間的延長均呈現(xiàn)整體增加的趨勢，總體表現(xiàn)為前72 h快速增加，隨后增長減緩。

A：“W108”不去皮薯塊軟木脂的積累；B：“W108”去皮薯塊軟木脂的積累；C：“D47”不去皮薯塊軟木脂的積累；D：“D47”去皮薯塊軟木脂的積累。圖中比例尺為200 μm

2.1.1 不同試劑處理對“W108 ”創(chuàng)傷周皮中軟木脂積累的影響 表3-A表明，“W108”不去皮塊莖在創(chuàng)傷愈合期間，ABA處理、SNP處理較CK均表現(xiàn)出顯著促進(jìn)軟木脂累積，cPTIO處理對塊莖軟木脂積累具有抑制作用，并在72和168 h較CK表現(xiàn)為顯著性抑制作用。ABA處理在創(chuàng)傷后至120 h軟木脂累積優(yōu)與其他處理，后期增長變緩，在168 h軟木脂厚度與120 h比較僅增長10.35%，而2 mmol·L-1SNP處理在創(chuàng)傷168 h后軟木脂厚度為569.31 μm，與120 h比較增長了45.38%，比同期的ABA處理高6.49%。

表3-C表明，“W108”去皮塊莖在創(chuàng)傷愈合期間，ABA和SNP處理較CK均表現(xiàn)出顯著促進(jìn)軟木脂累積。ABA處理在120 h軟木脂快速累積，在各處理中累積厚度最大(565.893 μm)，相比24 h增長142.47%，之后增長幅度變緩，在168 h累積厚度為597.18 μm，比120 h僅增長5.53%；2 mmol·L-1SNP處理始終保持較快的增長，其72 h的軟木脂厚度(294.18 μm)在各處理中最高，比ABA處理高26.05%，在創(chuàng)傷168 h，2 mmol·L-1SNP處理軟木脂積累最高(639.41 μm)。在創(chuàng)傷愈合期間cPTIO處理軟木脂累積最少，在處理前期cPTIO處理值較CK沒有顯著性差異，但在168 h時表現(xiàn)出顯著性抑制。

2.1.2 不同試劑處理對“D47”創(chuàng)傷周皮中軟木脂積累的影響 由圖3-B可知，“D47”不去皮塊莖在創(chuàng)傷愈合期間，ABA處理較快促進(jìn)軟木脂的累積，其72 h的軟木脂累積厚度為311.05 μm，比2 mmol·L-1SNP處理高12.98%，較CK高42.88%。2 mmol·L-1SNP處理在創(chuàng)傷72 h后軟木脂快速累積，其168 h的軟木脂累積厚度為512.47 μm，較同時間ABA處理高6.60%。在處理72～168 h內(nèi)，2 mmol·L-1SNP和ABA處理較CK呈顯著促進(jìn)作用；1 mmol·L-1SNP處理值較CK高，二者在120～168 h差異顯著；創(chuàng)傷期間cPTIO處理的軟木脂積累最低，較CK對薯塊軟木脂積累具有顯著的抑制作用。

由圖3-D可知，“D47”去皮塊莖在創(chuàng)傷愈合期間，ABA處理較快促進(jìn)軟木脂的累積，在72 h軟木脂累積厚度為306.73 μm，比2 mmol·L-1SNP處理高20.72%，較CK高68.62%，之后軟木脂積累保持緩慢增長，在168 h軟木脂增長27.52%。而2 mmol·L-1SNP處理在創(chuàng)傷72 h后軟木脂快速累積，在168 h軟木脂累積厚度為454.52 μm，高于其余各處理，與72 h相比軟木脂增長78.89%。在處理72～168 h期間，SNP和ABA處理較CK呈顯著促進(jìn)作用。在處理168 h后，cPTIO處理的軟木脂積累最低，但與CK無顯著差異。

A：“W108”不去皮薯塊軟木脂的積累厚度；B：“D47”不去皮薯塊軟木脂的積累厚度；C：“W108”去皮薯塊軟木脂的積累厚度；D：“D47”去皮薯塊軟木脂的積累厚度。大寫字母表示同一時間不同試劑處理的差異顯著性(P<0.05)，小寫字母表示同一試劑處理下不同時間的差異顯著性(P<0.05)，誤差線為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差

2.1.3 不同試劑處理對馬鈴薯塊莖創(chuàng)傷周皮中軟木脂積累速率的影響 在24～120 h內(nèi)，塊莖創(chuàng)傷周皮中軟木脂累積厚度的增長速率依次為ABA>2 mmol·L-1SNP>1 mmol·L-1SNP>CK>cPTIO，其中24～72 h內(nèi)增長速率范圍為2.53～7.43 μm·h-1，72～120 h內(nèi)增長速率范圍為0.10～6.93 μm·h-1；在120～168 h，整體增長速率依次為2 mmol·L-1SNP>ABA>CK>1 mmol·L-1SNP>cPTIO，增長速率范圍為2.54～11.28 μm·h-1。

2.2 馬鈴薯品種和原生周皮對塊莖創(chuàng)傷周皮中軟木脂積累的影響

由表2可知，在相同時間、相同試劑和相同去皮處理下，2個品種馬鈴薯薯塊軟木脂的累積有顯著性差異(P<0.05)；在相同時間、相同試劑和相同品種下，去除原周皮對塊莖創(chuàng)傷周皮中軟木脂的累積有顯著影響(P<0.05)。

表2 試劑、時間、品種、去皮、不去皮以及它們互作效應(yīng)對薯塊軟木脂積累的方差分析

2.2.1 馬鈴薯品種對塊莖創(chuàng)傷周皮中軟木脂積累的影響 圖4表明，對不同品種塊莖去皮后用相同試劑處理，結(jié)果表明1 mmol·L-1SNP，2 mmol·L-1SNP，cPTIO，CK 4種處理下，“W108”的軟木脂累積顯著高于“D47”，在120 h時差異最大，分別比“D47”高出47.62%，63.45%，52.46%，74.88%；ABA處理后“W108”的軟木脂累積在120～168 h內(nèi)顯著高于“D47”，而在72 h時“D47”的累積顯著高于“W108”，以120 h差異最大，高出81.56%。

對不同品種的塊莖保留原周皮后用相同試劑處理，試驗結(jié)果表明“W108”的軟木脂累積顯著高于“D47”。CK處理在72～120 h時2品種軟木脂累積無顯著差異，在處理168 h時，“W108”的軟木脂累積顯著高于“D47”，高出17.52%；1 mmol·L-1SNP處理在72 h時2個品種軟木脂的累積無顯著差異，在120～168 h時“W108”的軟木脂累積顯著高于“D47”，以168 h時差異最大，高出26.37%；2 mmol·L-1SNP

處理在72和168 h時，“W108”的軟木脂累積顯著高于“D47”，以168 h差異最大，高出26.37%，在120 h時兩品種無顯著差異；ABA處理在72～168 h內(nèi)“W108”的軟木脂累積均顯著高于“D47”，以120 h時差異最大，高出23.24%；cPTIO處理后，在72和168 h時2個品種軟木脂累積均沒有顯著差異，而在120 h時“W108”的累積極顯著高于“D47”，高出17.95%。

2.2.2 原生周皮對塊莖創(chuàng)傷周皮中軟木脂積累的影響 由圖4可知，不同試劑處理 “W108”結(jié)果表明，去皮的薯塊軟木脂累積均顯著高于不去皮的薯塊。在1 mmol·L-1SNP、2 mmol·L-1SNP、ABA、CK和cPTIO試劑處理后在120 h時差異最大，去皮薯塊的軟木脂分別比不去皮薯塊的軟木脂厚度增加31.15%，31.98%；34.81%，32.35%，36.13%；不同試劑處理 “D47”結(jié)果表明，CK處理不去皮薯塊軟木脂的累積均顯著高于去皮薯塊；2 mmol·L-1SNP和ABA處理，在72 h時去皮和不去皮薯塊軟木脂累積無顯著差異，在120～168 h內(nèi)不去皮的軟木脂累積顯著高于去皮薯塊，在120 h時差異最大，分別比去皮薯塊高出26.54%，26.12%；cPTIO試劑處理后，在72～168 h內(nèi)去皮和不去皮薯塊軟木脂累積均無顯著差異。

A：CK；B：處理1(1 mmol·L-1 SNP)；C：處理2(2 mmol·L-1 SNP)；D：處理4(0.1 mmol·L-1 ABA)；E：處理3(0.13 mmol·L-1 cPTIO)。字母表示同一培養(yǎng)時間下的顯著差異性(P<0.05)，誤差線為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差

3 討 論

NO在抵抗生物和非生物脅迫中發(fā)揮著重要的生理作用。研究表明，NO對馬鈴薯創(chuàng)傷后軟木脂的累積有促進(jìn)作用，而不同濃度的SNP處理對軟木脂累積促進(jìn)效果不同，無論是累積厚度還是累積速率，2 mmol·L-1SNP效果均較1 mmol·L-1SNP 好。研究中SNP促進(jìn)塊莖創(chuàng)傷周皮中軟木脂的快速累積，進(jìn)而加塊傷口愈合，與Pari′s等研究證明NO參與了馬鈴薯葉片的傷口愈合反應(yīng)的結(jié)論一致[9]。同時，cPTIO處理后軟木脂的累積被抑制，進(jìn)一步印證了NO參與了創(chuàng)傷周皮中軟木脂的累積。

ABA是植物體內(nèi)重要的脅迫激素之一，對植物抗脅迫反應(yīng)至關(guān)重要。研究表明，ABA能顯著促進(jìn)薯塊軟木脂的累積，Cottle 等[14]和李雪等[15]的研究也有類似結(jié)果。2 mmol·L-1SNP和ABA都能促進(jìn)薯塊創(chuàng)傷后軟木脂的積累，但2種試劑的響應(yīng)并不完全一致，ABA在前期(72 h)較好，而2 mmol·L-1SNP是在后期(168 h)響應(yīng)較高。

NO作為信號分子與ABA調(diào)控植物生理生化作用有很多聯(lián)系，Scuffi等研究證實NO產(chǎn)生受ABA誘導(dǎo)，并作為ABA的下游信號分子誘導(dǎo)調(diào)控氣孔關(guān)閉[17]。Freschi等[18]研究認(rèn)為在幼小的鳳梨中，NO被認(rèn)為是ABA上調(diào)景天酸代謝信號通路中的關(guān)鍵組分。研究中呈現(xiàn)ABA和NO的響應(yīng)高效時間的不一致，是否與2種試劑的內(nèi)在偶聯(lián)有關(guān)還有待探討。

薯塊創(chuàng)傷后的愈合能力受多種因素影響，品種差異就是內(nèi)因之一。不同品種塊莖的創(chuàng)傷應(yīng)激能力不同，Lulai等研究表明黃褐皮基因型比紅皮基因型塊莖的愈傷周皮成熟快[20]。Baritelle等[19]則認(rèn)為高比重的塊莖有較低的損傷閾值，損傷抗性較低。研究中，2個供試品種在薯塊的肉色、原生周皮、抗病性等方面都存在差異，受創(chuàng)后“W108”的軟木脂累積顯著高于“D47”，說明2個馬鈴薯品種創(chuàng)傷愈合能力有差異，與前人研究一致。

此外，研究結(jié)果表明，軟木脂的累積受原周皮的影響，但效應(yīng)因品種而異，“D47”不去皮的薯塊軟木脂累積更多，而“W108”去皮的薯塊軟木脂累積更多。

4 結(jié) 論

研究顯示外源NO和ABA處理對薯塊創(chuàng)傷后軟木脂的累積有顯著影響，表明外源NO和ABA處理可有效促進(jìn)馬鈴薯創(chuàng)傷愈合過程。1 mmol·L-1SNP、2 mmol·L-1SNP和ABA均能促進(jìn)軟木脂的積累，2 mmol·L-1SNP的促進(jìn)效果較1 mmol·L-1SNP好。不同品種間軟木脂的累積存在顯著差異，“W108”軟木脂的累積顯著高于“D47”。另外，去除原周皮對薯塊軟木脂的累積有影響，但在2個品種中呈現(xiàn)的效應(yīng)和趨勢不一致，在多數(shù)情況下，“D47”不去原周皮的薯塊軟木脂累積更多，而“W108”則去除原周皮的累積更多。