喇燕菲，肖麗梅，黃 涵，張進(jìn)忠，孫明艷，王 翊*

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西大學(xué)林學(xué)院，廣西 南寧 530004)

【研究意義】培育長(zhǎng)花期金花茶組植物品種群一直以來(lái)均為金花茶組植物優(yōu)良品種選育的重要目標(biāo)和方向。目前金花茶組植物共有18個(gè)種，其中，金花茶[Camelliapetelotii(Merrill) Sealy]是世界上著名的觀賞品種之一，僅在冬季開(kāi)花(花期在當(dāng)年12月至次年1月)；四季金花茶(C.perpetuaS. Y. Liang et L. D. Huang)具有一年多次開(kāi)花的優(yōu)良特性，已成為培育四季開(kāi)花山茶新品種的優(yōu)良親本，為長(zhǎng)花期金花茶育種提供了更多可能性[1]；淡黃金花茶(C.flavidaChang)是較少見(jiàn)的夏季開(kāi)花山茶品種。金花茶雖在冬季開(kāi)花，但在夏季已完成花芽分化[2]；四季金花茶一年四季均可完成花芽分化，但在冬季花芽分化數(shù)量相對(duì)較少；淡黃金花茶在夏季完成花芽分化后即開(kāi)始花器官發(fā)育，短期內(nèi)即可開(kāi)花?？梢?jiàn)，金花茶、四季金花茶和淡黃金花茶具有不同的開(kāi)花特性，但原因至今尚不清楚。因此，分析該3種金花茶組植物的花芽分化特征，對(duì)金花茶組植物品種的長(zhǎng)花期育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】花芽分化是一個(gè)復(fù)雜的形態(tài)建成過(guò)程，同時(shí)也是花器官形成的關(guān)鍵階段[3]。目前關(guān)于山茶屬花芽分化的研究多集中于茶樹(shù)[C.sinensis(L.) O. Ktze.][4]、油茶(C.oleiferaAbel.)[5-8]和少數(shù)山茶園藝品種[9-10。符喆[9]研究發(fā)現(xiàn)，耐冬山茶除存在單花芽和葉芽外，還具有能同時(shí)分化多個(gè)花芽和葉芽的混合芽。張軍莉等[11]研究認(rèn)為，植物花芽分化可分為分化初期、萼片分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期和雌蕊分化期5個(gè)時(shí)期。王湘南等[12]研究表明，油茶雌雄蕊原基同時(shí)突起，即雌雄蕊同步出現(xiàn)，子房與花藥隨后形成，因此將油茶花芽分化過(guò)程分為花芽前分化期、萼片形成期、花瓣形成期、雌雄蕊形成期、子房與花藥形成期和雌雄蕊成熟期6個(gè)時(shí)期。張鵬等[13]研究顯示，光照有利于高州油茶花芽提早分化，且花的外部形態(tài)可直觀反映內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化情況。溫玥[14]、蔡婭等[15]研究表明，外源激素赤霉素和多效唑均可提高不同油茶品種的花芽分化率和油茶產(chǎn)量。羅帥[16]研究發(fā)現(xiàn)，增施適量氮、磷和鉀肥也有利于油茶進(jìn)行花芽分化。有關(guān)山茶屬植物花芽分化的研究已涉及形態(tài)學(xué)特征、激素影響和環(huán)境因子影響等方面，但關(guān)于金花茶組植物花芽分化的研究較少。唐健民等[17]研究顯示，東興金花茶的花芽分化始于12月下旬，整個(gè)分化時(shí)期持續(xù)1個(gè)多月，花芽分化的順序是由外至內(nèi)，分為花芽未分化期、花芽分化始期、花萼分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期和雌蕊分化期6個(gè)時(shí)期，各時(shí)期依次發(fā)生，且花芽分化期具有重疊現(xiàn)象。【本研究切入點(diǎn)】目前，針對(duì)單次開(kāi)花金花茶、多次開(kāi)花四季金花茶和夏季開(kāi)花淡黃金花茶花芽分化特性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)金花茶、四季金花茶和淡黃金花茶的花芽分化過(guò)程進(jìn)行動(dòng)態(tài)拍攝，解剖觀察其不同分化階段花芽的形態(tài)學(xué)特征，并利用改良石蠟切片技術(shù)觀察花芽分化不同時(shí)期的結(jié)構(gòu)，確定該3種金花茶組植物花芽分化所需時(shí)間，明確其花芽分化過(guò)程的差異，為金花茶組植物品種的長(zhǎng)花期育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2018年5-12月在廣西大學(xué)熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和廣西大學(xué)林學(xué)院植物制片室進(jìn)行。選取南寧市金花茶基因庫(kù)中生長(zhǎng)良好、無(wú)病蟲(chóng)害發(fā)生的四季金花茶、淡黃金花茶和金花茶成年植株各5株，采集其一年生枝條或當(dāng)年生新梢上的花芽為試驗(yàn)材料。金花茶和淡黃金花茶花芽采樣時(shí)間均為2018年5-8月，四季金花茶花芽采樣時(shí)間為2018年3、6和9月，3種金花茶均各采樣3次，每次連續(xù)采樣1個(gè)月；每隔3～4 d收集花芽1次，每次每種金花茶采集花芽5～6枚保存于FAA固定液中。

1.2 花芽分化物候期及解剖觀察

于2018年5-9月，在上述選定3種金花茶植株的各方位分別選取5根生長(zhǎng)健壯的一年生枝條，每隔3～4 d用照相機(jī)對(duì)生長(zhǎng)的花芽進(jìn)行拍攝，記錄物候期?；ㄑ拷馄试诓趟倔w視顯微鏡(德國(guó)SteREO Discovery.V12)下進(jìn)行，花芽外部大小用ZEN(Blue edition V1.0)測(cè)量。其中，橫徑為花芽最寬處的寬度，縱徑為花芽頂部至基部的距離。每種金花茶每個(gè)發(fā)育階段解剖觀察花芽數(shù)不少于15個(gè)。

1.3 花芽石蠟切片

參照肖麗梅[18]的方法進(jìn)行花芽石蠟切片，主要步驟如下：材料經(jīng)固定、軟化，酒精梯度脫水，TO透明劑(主要成分為優(yōu)質(zhì)松節(jié)油[19])透明，石蠟浸蠟，再進(jìn)行包埋；采用Leica DM 2016切片機(jī)制作8.0 μm厚切片，然后粘片、復(fù)水、0.05 %甲苯胺藍(lán)(Solarbio，G3668)染色，中性樹(shù)膠封片。在蔡司顯微鏡(德國(guó)Axio Imager 2)下選擇結(jié)構(gòu)完整高清的切片進(jìn)行拍攝。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種金花茶的開(kāi)花特性

物候觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，金花茶于10月底萌發(fā)抽梢，翌年大部分花芽著生于新梢長(zhǎng)成的一年生枝條上，花芽分化時(shí)間為5-8月，期間花芽連續(xù)分化，同一植株不同枝條花芽分化不同步。9月后花芽分化基本完成，處于孕蕾階段，該階段花器官逐步發(fā)育直至翌年1月中上旬花朵開(kāi)放；四季金花茶四季均可進(jìn)行花芽分化，4-6月和9月兩次花芽分化比較集中，其中，4-6月分化的花芽數(shù)較多，9月分化的花芽數(shù)較少，而每年11月至翌年2月僅偶爾可見(jiàn)零星花芽分化；淡黃金花茶花芽分化較整齊，5月開(kāi)始分化，花朵8月開(kāi)放，偶爾有少量花芽分化滯后，可在秋冬季節(jié)見(jiàn)零星花朵開(kāi)放。從圖1可看出，金花茶花芽從5月10日開(kāi)始分化，至7月16日分化完成，持續(xù)66 d，此后進(jìn)入花器官發(fā)育(孕蕾)階段，直至花朵開(kāi)放；四季金花茶從6月1日開(kāi)始分化，至6月29日分化完成，持續(xù)30 d，從現(xiàn)蕾至開(kāi)放為90 d；淡黃金花茶從5月2日開(kāi)始分化，至6月15日分化完成，持續(xù)43 d，從現(xiàn)蕾至開(kāi)放107 d。

2.2 3種金花茶花芽的外部形態(tài)

金花茶、四季金花茶和淡黃金花茶花芽分化各時(shí)期的外部形態(tài)、大小和解剖觀察結(jié)果如圖2所示。根據(jù)花芽解剖統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，橫徑和縱徑可直觀反映花芽大小，但花芽橫徑大小可較準(zhǔn)確地反映花芽分化所處時(shí)期。由表1可知，當(dāng)金花茶花芽橫徑生長(zhǎng)至2.3 mm時(shí)啟動(dòng)花芽分化，生長(zhǎng)至3.4 mm時(shí)進(jìn)入雄蕊分化時(shí)期，雌雄蕊分化通常同步進(jìn)行，當(dāng)橫徑生長(zhǎng)至5.0 mm時(shí)進(jìn)入子房形成期，預(yù)示花芽分化即將完成；當(dāng)四季金花茶和淡黃金花茶花芽橫徑生長(zhǎng)至約1.5 mm時(shí)啟動(dòng)花芽分化，生長(zhǎng)至2.4 mm時(shí)進(jìn)入雄蕊分化時(shí)期，生長(zhǎng)至3.9和4.7 mm時(shí)進(jìn)入子房分化期。

2.3 3種金花茶花芽分化的形態(tài)特征

根據(jù)3種金花茶花芽的形態(tài)特點(diǎn)(圖2～3)，可將其花芽分化時(shí)期劃分為未分化期、分化初期、苞片分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期、雌蕊分化期和子房形成期7個(gè)時(shí)期。

2.3.1 未分化期 在花芽未分化期，3種金花茶的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)錐體積較小(圖3-A1、圖3-B1和圖3-C1)，此時(shí)芽生長(zhǎng)點(diǎn)的頂端分生組織(Sam)細(xì)胞較小、排列緊密，隨著營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)錐進(jìn)一步分化，其形態(tài)也有所變化，但從外觀和解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，都較難區(qū)分該階段的芽是葉芽還是花芽。

2.3.2 分化初期 進(jìn)入花芽分化初期，花芽呈圓桃形，先端鈍，花芽形態(tài)較小，但已可從外觀上將花芽和葉芽區(qū)別開(kāi)(圖2-A1、圖2-C1和圖2-E1)。石蠟切片結(jié)果顯示，該階段3種金花茶的花芽分化情形相似，均為生長(zhǎng)錐明顯變寬，呈半圓形，基部膨大，形成染色較深的生殖生長(zhǎng)錐，進(jìn)而發(fā)育為花原基(圖3-A2、圖3-B2和圖3-C2)，且花原基兩側(cè)出現(xiàn)較肥厚的萼片原基。

2.3.3 萼片分化期 該階段花芽外觀形態(tài)多呈橢圓型，外有鱗片包被(圖2-A2、圖2-C2和圖2-E2)。其中，金花茶花芽大小為3.250 mm(橫徑)×3.925 mm(縱徑)，四季金花茶和淡黃金花茶的花芽略小(表1)。解剖觀察發(fā)現(xiàn)，該階段的生長(zhǎng)錐下陷、變寬，逐漸趨于扁平，生長(zhǎng)點(diǎn)周圍已分化出花萼原基，并逐漸將生長(zhǎng)點(diǎn)覆蓋(圖2-B2、圖2-D2和圖2-F2)。石蠟切片結(jié)果顯示，生長(zhǎng)錐由半圓緩慢變寬變平，中間為中央分生組織，兩側(cè)苞片原基迅速分化(圖3-A3、圖3-B3和圖3-C3)；在四季金花茶和淡黃金花茶花芽中央分生組織的兩側(cè)可觀察到兩個(gè)突起(圖3-A3和圖3-B3)，為花瓣原基，而此階段金花茶的花芽中未出現(xiàn)花瓣原基。

分化階段Differentiation stage縱橫徑Vertical and horizontal diameter形態(tài)大小(mm) Shape size金花茶C. petelotii四季金花茶C. perpetua淡黃金花茶C. flavida分化初期橫徑2.699±0.3141.738±0.2251.880±0.381縱徑3.230±0.4472.246±0.3982.391±0.282萼片形成期橫徑3.250±0.1612.043±0.1222.370±0.376縱徑3.925±0.4002.498±0.2912.712±0.401花瓣形成期橫徑3.516±0.3452.274±0.1562.640±0.203縱徑4.492±0.7922.733±0.4113.140±0.374雄蕊分化期橫徑3.920±0.5222.419±0.0462.911±0.235縱徑4.492±0.7923.193±0.1983.762±0.602雌蕊分化期橫徑4.636±0.2913.343±0.3323.421±0.563縱徑5.393±0.6753.673±0.4934.071±0.822子房形成期橫徑5.177±0.1004.437±0.5645.122±0.431縱徑5.406±0.4074.409±0.9575.870±0.514

2.3.4 花瓣分化期 該階段花芽繼續(xù)生長(zhǎng)，呈橢圓形(圖2-A3、圖2-C3和圖2-E3)。其中，金花茶花芽大小為3.516 mm×4.492 mm，四季金花茶花芽大小為2.274 mm×2.733 mm，淡黃金花茶的花芽比四季金花茶的花芽稍大(表1)。解剖觀察發(fā)現(xiàn)，花芽中央的生殖錐明顯變寬變凹，生殖錐周圍已分化出花瓣原基(圖2-B3、圖2-D3和圖2-F3)。石蠟切片結(jié)果顯示，該階段生殖錐繼續(xù)加寬；隨著分化進(jìn)程的進(jìn)行，花瓣原基逐漸形成并向上伸展(圖3-A4、圖3-B4和圖3-C4)。其中，四季金花茶和淡黃金花茶花芽中央的分生組織區(qū)出現(xiàn)很多小突起(圖3-A4和圖3-B4中*所示處)，為雄蕊原基，該處細(xì)胞排列緊密、有規(guī)則，而此階段金花茶的花芽中未出現(xiàn)雄蕊原基。

2.3.5 雄蕊分化期 該階段花芽繼續(xù)膨大，形狀近圓球形(圖2-A4、圖2-C4和圖2-E4)。解剖觀察發(fā)現(xiàn)，花瓣原基形成后在其內(nèi)側(cè)逐漸分化出雄蕊原基。其中，四季金花茶雄蕊原基和雌蕊原基的分化幾乎同步進(jìn)行，而金花茶和淡黃金花茶分化形成多列雄蕊原基后才觀察到雌蕊原基分化(圖2-B4、圖2-D4和圖2-F4)。石蠟切片結(jié)果顯示，該階段的生殖錐繼續(xù)加寬，部分略微凹陷，其上出現(xiàn)雄蕊原基，隨著雄蕊原基的分化，最終形成排列有序的雄蕊群。雄蕊群細(xì)胞分裂旺盛，染色較深(圖3-A5、圖3-B5和圖3-C5)，其中，金花茶和淡黃金花茶花芽中央的分生組織仍不斷分化出雄蕊原基，而四季金花茶花芽中央的分生組織已經(jīng)出現(xiàn)雌蕊原基(圖3-A5中★所示處)。

2.3.6 雌蕊分化期 該階段花芽繼續(xù)膨大，其中四季金花茶花芽明顯變大(圖2-A5)，從雄蕊形成期的2.419 mm×3.193 mm增至3.343 mm×3.673 mm(表1)。解剖觀察發(fā)現(xiàn)，該階段3種金花茶的雄蕊已經(jīng)分化完成，雌蕊正在分化(圖2-B5、圖2-D5和圖2-F5)。石蠟切片結(jié)果顯示，生殖錐的中央緩慢向上凸起，形成心皮原基，心皮原基在分化過(guò)程中繼續(xù)生長(zhǎng)逐漸長(zhǎng)高、加寬，且各心皮聯(lián)合形成子房腔。從圖3-B6和圖3-C6還可看出，淡黃金花茶和金花茶的心皮原基在分化過(guò)程中其邊緣生長(zhǎng)迅速而互相愈合，并繼續(xù)向內(nèi)卷曲生長(zhǎng)(圖3-C6)直達(dá)中心部分，從而形成一個(gè)具有3和5室子房的雌蕊[20]，而四季金花茶在心皮快速分化的同時(shí)，中央軸的分化同步進(jìn)行，最后形成子房(圖3-A6)，分化速度快于金花茶和淡黃金花茶。

2.3.7 子房形成期 進(jìn)入子房形成期預(yù)示著花器官分化即將完成。該階段3種金花茶的花芽均呈球形，被多層鱗片(圖2-A6、圖2-C6和圖2-E6)。解剖觀察發(fā)現(xiàn)，雄蕊群已分化完成，子房也相對(duì)完整(圖2-B6、圖2-D6和圖2-F6)。石蠟切片結(jié)果顯示，隨著雌蕊原基伸長(zhǎng)，上部合攏形成柱頭，下部為花柱，花柱逐漸膨大，形成子房(圖3-A7、圖3-B7和圖3-C7)，其中四季金花茶在子房發(fā)育的同時(shí)形成中軸座，并在中軸座上分化出胚珠原基。

3 討 論

本研究中，同為兩性花植物的金花茶、四季金花茶和淡黃金花茶在花芽分化過(guò)程中雄蕊發(fā)育均略早于雌蕊，但后期基本同步，與韋霄等[2]對(duì)金花茶的研究結(jié)果相似，這也是金花茶組植物在雜交育種中無(wú)需套袋而進(jìn)行異花授粉的原因。

本研究通過(guò)物候觀測(cè)結(jié)合花芽解剖觀察，發(fā)現(xiàn)冬季開(kāi)花的金花茶花芽分化持續(xù)時(shí)間為66 d，夏季開(kāi)花的淡黃金花茶花芽分化持續(xù)時(shí)間為43 d，而四季均可開(kāi)花的四季金花茶花芽分化持續(xù)時(shí)間最短，僅30 d，3種金花茶的花芽分化持續(xù)時(shí)間存在較大差異，可能與其在不同季節(jié)開(kāi)花的品種特性有關(guān)，與陳政等[21]研究認(rèn)為梅樹(shù)早花品種花芽分化持續(xù)時(shí)間較短、晚花品種花芽分化持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的觀點(diǎn)相似；3種金花茶組植物花芽分化所需時(shí)間均與茶樹(shù)[4]、油茶[5]、東興金花茶[17]和杜鵑紅山茶(Camelliaazalea)[22]相近，但明顯較觀賞山茶(Camelliaspp.)[9-10]短；金花茶的花器官發(fā)育(孕蕾)約需8個(gè)月，四季金花茶和淡黃金花茶花器官發(fā)育(孕蕾)均約需2個(gè)月，三者的孕蕾時(shí)間總體上均較長(zhǎng)，是否存在休眠現(xiàn)象需進(jìn)一步探究。

已有研究表明，通過(guò)觀察花芽外部形態(tài)可確定花芽分化階段，如薄殼山核桃(Caryaillinoensis)和香港四照花(Dendrobenthamiahongkongensis)的外部形態(tài)與花芽?jī)?nèi)部分化所處階段聯(lián)系較緊密，這類植物可根據(jù)花芽的外部形態(tài)特征推測(cè)其花芽分化狀況[23-24]。但也有很多植物花芽的外部形態(tài)與內(nèi)部分化階段聯(lián)系不緊密，如簕杜鵑(Bougainvilleaspectabilis)花芽分化前期外觀形態(tài)變化不明顯，不能直觀反映其內(nèi)部的結(jié)構(gòu)變化，而后期分化速度加快，芽體變化明顯，又能從芽體的外部形態(tài)判斷花芽分化進(jìn)程[25]。本研究中，3種金花茶組植物花芽分化過(guò)程中花芽的外部形態(tài)并無(wú)典型區(qū)別，僅花芽的大小變化較明顯，其橫徑與花芽分化所處階段密切相關(guān)，即隨著花芽分化的進(jìn)行，花芽的橫徑逐漸增大，因此可根據(jù)花芽橫徑大小判斷花芽所處分化階段，而根據(jù)縱徑大小判斷發(fā)育階段容易造成誤判(如金花茶花瓣形成期的花芽縱徑為4.492 mm，雌蕊形成期的縱徑也為4.492 mm)，與朱雯等[26]發(fā)現(xiàn)廣寧紅花油茶花芽的橫徑縱徑比變化特征與不同分化期存在一定的對(duì)應(yīng)聯(lián)系，但整體上是先由大變小、再變大的研究結(jié)果存在差異，推測(cè)與廣寧紅花油茶花芽的縱徑變化不規(guī)律有關(guān)。

本研究將3種金花茶組植物花芽分化過(guò)程劃分為未分化期、分化初期、萼片分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期、雌蕊分化期和子房形成期7個(gè)時(shí)期，與何春燕[27]對(duì)普通油茶的劃分結(jié)果一致；3種金花茶組植物的花芽在花瓣形成期、雄蕊形成期和雌蕊形成期或多或少具有重疊分化現(xiàn)象，與張逸[4]對(duì)茶樹(shù)的觀察結(jié)果相似；解剖可觀察到3種金花茶組植物雌蕊和雄蕊分化及以后的分化階段重疊進(jìn)行，石蠟切片結(jié)果則顯示四季金花茶花芽分化階段重疊現(xiàn)象較另外兩種金花茶明顯，萼片分化、花瓣分化、雄蕊分化和雌蕊分化階段均與其他分化階段同步進(jìn)行，且在子房形成過(guò)程中可同步形成中軸座，并分化形成胚珠，這在另兩種金花茶中未有發(fā)現(xiàn)；3種金花茶組植物花芽分化速度不同，其中四季金花茶的花芽分化速度較快，是否與花芽中成花基因的相對(duì)表達(dá)量較高有關(guān)尚待進(jìn)一步探討。

韋霄等[2]研究發(fā)現(xiàn)，金花茶花朵開(kāi)放后花藥即已成熟，柱頭同時(shí)分泌粘液，但在開(kāi)花后2 d內(nèi)花藥便失去散粉能力。本研究對(duì)3種金花茶組植物花芽分化過(guò)程的形態(tài)學(xué)和開(kāi)花日期觀測(cè)結(jié)果表明，四季金花茶、金花茶和淡黃金花茶花朵分別在花芽分化完成(花芽橫徑約5.00、5.27和5.55 mm)后約2個(gè)月、8個(gè)月和2個(gè)月開(kāi)放。因此，在金花茶組植物雜交育種尤其是大量群體雜交育種的工作中，應(yīng)提前做好雜交準(zhǔn)備，以免耽誤最佳授粉日期。

4 結(jié) 論

金花茶、四季金花茶和淡黃金花茶的開(kāi)花習(xí)性存在明顯差異，但花芽分化過(guò)程相似；四季金花茶的萼片分化與花瓣分化、花瓣分化與雄蕊分化等階段可同步進(jìn)行，重疊分化現(xiàn)象較其他兩種金花茶更明顯，可作為金花茶類植物育種、園林應(yīng)用及開(kāi)花調(diào)控機(jī)制研究的參考依據(jù)。