覃仁柳，龐師嬋，唐小付，黃子粵，肖 健，楊尚東

(廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院/植物科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，廣西 南寧 530004)

【研究意義】番茄是廣西秋冬蔬菜生產(chǎn)的主要品種之一，也是廣西“南菜北運(yùn)”和“西菜東調(diào)”的重要蔬菜種類。我國(guó)番茄連作現(xiàn)象較普遍，土傳病害和連作障礙十分嚴(yán)重，阻礙了番茄產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。嫁接是降低土傳病害、克服連作障礙的一項(xiàng)有效技術(shù)措施，嫁接技術(shù)已在番茄[2]、辣椒[3]、茄子[4]、黃瓜[5]等瓜菜類作物生產(chǎn)上得到較廣泛應(yīng)用。已有研究分別從組織結(jié)構(gòu)[6]、生理生化[7]和抗性誘導(dǎo)[8]等方面闡述了嫁接可增強(qiáng)番茄植株抗性的機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)植物病害的發(fā)生不僅與根際微生物群落組成和功能存在聯(lián)系，與植株根系內(nèi)生微生物也存在顯著相關(guān)性。因此，研究嫁接對(duì)番茄植株根系內(nèi)生微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)特征的影響，對(duì)解析嫁接番茄根系內(nèi)生微生物多樣性與抗性間的聯(lián)系具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】番茄嫁接植株根際土壤中更豐富的細(xì)菌多樣性和更多樣的特有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬是嫁接植株抗性增強(qiáng)的重要原因之一[9]。植物內(nèi)生微生物是微生物研究的重要領(lǐng)域，微生物結(jié)構(gòu)組成和數(shù)量與植物養(yǎng)分循環(huán)、病蟲害發(fā)生及植物健康緊密相關(guān)[10]。植物根系的內(nèi)生細(xì)菌主要入侵和定殖在植物根區(qū)，并利用植物的代謝產(chǎn)物生存和生長(zhǎng)，促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)發(fā)育，增加總生物量，提升植物抗性、產(chǎn)生抗生素類物質(zhì)[11]，同時(shí)增加植物的固氮能力和對(duì)鉀、鈣和磷等營(yíng)養(yǎng)元素的吸收[12]。植物根系內(nèi)生真菌通過(guò)產(chǎn)生生長(zhǎng)素、赤霉素和細(xì)胞激動(dòng)素等植物生長(zhǎng)素促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)[13]，有益內(nèi)生真菌可發(fā)揮抗蟲作用，其中枝頂孢屬(Acrmonium)菌類可控制蚜蟲危害[14]。內(nèi)生真菌作為殺菌劑對(duì)脈孢菌屬(Neurosporasp.)、鐮刀菌(Fusariumsp.)、木霉(Trichodermasp.)等病原真菌具有生長(zhǎng)抑制活性[15]。【本研究切入點(diǎn)】目前，針對(duì)嫁接提高番茄植株抗性的研究多數(shù)是從生理生化和抗性誘導(dǎo)等方面進(jìn)行分析，關(guān)于嫁接對(duì)番茄植株根系內(nèi)生微生物群落結(jié)構(gòu)影響的研究鮮見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】基于Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)分析番茄嫁接植株根系內(nèi)生微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)特征，旨在更深入地探究嫁接番茄植株的抗性機(jī)制，為番茄生產(chǎn)上篩選和開發(fā)利用有益微生物提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

砧木分別采用番茄普通品種新組合1號(hào)和寶砧1號(hào)，接穗為桃太郎。種子均購(gòu)自農(nóng)友種苗(中國(guó))有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)于2019年9月10日至12月30日在廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院蔬菜生產(chǎn)基地(東經(jīng)108°17′25″，北緯22°51′02″)溫室進(jìn)行。設(shè)5個(gè)處理，分別為：新組合1號(hào)番茄砧木自根植株(簡(jiǎn)稱新砧處理)；以桃太郎為接穗、新組合1號(hào)為砧木的嫁接植株(簡(jiǎn)稱桃太郎/新砧處理)；寶砧1號(hào)番茄砧木自根植株(簡(jiǎn)稱寶砧處理)；以桃太郎為接穗、寶砧1號(hào)為砧木的嫁接植株(簡(jiǎn)稱桃太郎/寶砧處理)；桃太郎番茄接穗自根植株(簡(jiǎn)稱桃太郎處理)。每處理種植60株，3個(gè)重復(fù)。當(dāng)砧木長(zhǎng)至3葉1心時(shí)采用插接法[16]嫁接，植株成活后進(jìn)行盆栽定植(盆直徑30 cm，高40 cm)。田間管理按常規(guī)方法進(jìn)行。

1.2.2 樣品采集 定植80 d后，收集根系樣品：采用“S”采樣方法，3株混樣，每處理3次重復(fù)；將盆栽翻轉(zhuǎn)，倒出整個(gè)植株用蒸餾水緩慢沖洗根系，并對(duì)根表面進(jìn)行消毒，收集根系裝入無(wú)菌袋，用于植株根系內(nèi)生細(xì)菌和真菌多樣性[ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Heip指數(shù)、覆蓋度(Coverage)、群落組成和Venn圖]檢測(cè)。

1.2.3 總DNA提取、PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定 根系樣品總DNA提取、PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。測(cè)序具體類型與引物序列見表1。

表1 用于PCR擴(kuò)增的引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010和SPSS 19.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，高通量檢測(cè)數(shù)據(jù)通過(guò)Usearch(vsesion 7.0)及I-sanger平臺(tái)進(jìn)行分析，并構(gòu)建微生物群落組成圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄嫁接和自根植株樣本的測(cè)序序列及分類

由表2可知，桃太郎、新砧、寶砧、桃太郎/新砧和桃太郎/寶砧處理的根系內(nèi)生細(xì)菌數(shù)分別為591、841、639、526和601 OTUs；根系內(nèi)生真菌數(shù)分別為276、293、263、186和306 OTUs；各處理根系的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)和真菌數(shù)在門、綱、目和科分類水平上無(wú)明顯差異，而在屬和種分類水平上，桃太郎/新砧和桃太郎/寶砧處理根系的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)明顯少于其相應(yīng)的新砧、寶砧和桃太郎處理根系?？梢姡鸭藿又仓旮档膬?nèi)生細(xì)菌OTU數(shù)明顯高于內(nèi)生細(xì)菌OTU數(shù)，說(shuō)明番茄嫁接植株根系的內(nèi)生細(xì)菌OTU數(shù)受砧木種類影響較明顯。

表2 各品種番茄及其嫁接植株樣品的測(cè)序序列統(tǒng)計(jì)及分類結(jié)果

2.2 番茄嫁接和自根植株根系內(nèi)生細(xì)菌和真菌的Alpha多樣性特征

由表3可知，番茄各處理植株根系的Coverage均在98.00 %以上，表明測(cè)序結(jié)果可代表樣本中微生物的真實(shí)情況；桃太郎/新砧處理和桃太郎/寶砧處理根系內(nèi)生細(xì)菌的ACE指數(shù)分別為393.53和473.20，Chao1指數(shù)分別為478.54和451.62，均明顯小于相應(yīng)的新砧、寶砧和和桃太郎處理，說(shuō)明嫁接番茄植株根系的內(nèi)生細(xì)菌豐富度低于其相應(yīng)的砧木和接穗實(shí)生自根根系；桃太郎/新砧、桃太郎/寶砧、新砧、寶砧和桃太郎處理根系內(nèi)生真菌的Shannon指數(shù)分別為1.34、1.80、1.93、1.77和2.46，相互間無(wú)顯著差異(P>0.05，下同)，桃太郎/新砧和桃太郎/寶砧處理根系內(nèi)生細(xì)菌的Shannon指數(shù)與其相應(yīng)新砧和寶砧處理的Shannon指數(shù)間也無(wú)顯著差異，但桃太郎/新砧和桃太郎/寶砧處理根系內(nèi)生細(xì)菌的Shannon指數(shù)較大，分別為3.58和3.55，均顯著大于桃太郎處理(P<0.05，下同)；各處理根系內(nèi)生真菌的Simpson指數(shù)間也無(wú)顯著差異，但內(nèi)生細(xì)菌的Simpson指數(shù)以桃太郎處理最大，且顯著大于桃太郎/新砧、桃太郎/寶砧、新砧和寶砧處理，而桃太郎/新砧和桃太郎/寶砧處理內(nèi)生細(xì)菌的Simpson指數(shù)均小于新砧和寶砧處理，但相互間差異不顯著。說(shuō)明嫁接可改變番茄植株根系的內(nèi)生微生物多樣性特征，尤其可提高根系內(nèi)生細(xì)菌的多樣性。

表3 各品種番茄及其嫁接植株根系內(nèi)生細(xì)菌和真菌的多樣性指數(shù)比較

從表3還可看出，桃太郎、新砧、寶砧、桃太郎/新砧和桃太郎/寶砧處理根系內(nèi)生真菌的Heip指數(shù)分別為0.08、0.04、0.04、0.05和0.05，處理間無(wú)顯著差異，而桃太郎/新砧和桃太郎/寶砧處理根系內(nèi)生細(xì)菌的Heip指數(shù)分別為0.14和0.11，均顯著大于桃太郎處理，明顯大于相應(yīng)的新砧和寶砧處理，說(shuō)明番茄嫁接植株的均勻度較高，即嫁接也有助于改善番茄植株根系內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。

2.3 番茄嫁接和自根植株根系內(nèi)生細(xì)菌和真菌的群落組成

2.3.1 門分類水平的優(yōu)勢(shì)菌群分析 對(duì)比圖1各處理番茄植株根系內(nèi)生細(xì)菌門分類水平群落的相對(duì)豐度可知，變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)是各品種番茄及其嫁接植株根系內(nèi)生細(xì)菌的共有優(yōu)勢(shì)菌門。由表4可知，桃太郎/新砧和桃太郎/寶砧處理根系的變形菌門在其內(nèi)生細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)中占比分別為61.23 %和71.21 %，厚壁菌門在其內(nèi)生細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)中占比分別為0.74 %和0.40 %，均低于其相應(yīng)新砧、寶砧和桃太郎處理根系變形菌門和厚壁菌門在其內(nèi)生細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)中的占比；而桃太郎/新砧和桃太郎/寶砧處理根系的放線菌門在其內(nèi)生細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)中占比分別為20.74 %和18.36 %，擬桿菌門在其內(nèi)生細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)中的占比分別為16.60 %和8.71 %，均高于其相應(yīng)新砧、寶砧和桃太郎處理根系放線菌門和擬桿菌門在其內(nèi)生細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)中的占比?？梢?，嫁接具有改變番茄植株根系內(nèi)生細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)占比的作用，且砧木種類不同，其嫁接植株根系內(nèi)生細(xì)菌的組成占比存在差異。

表4 各品種番茄及其嫁接植株根系內(nèi)生細(xì)菌在門分類水平的占比比較

對(duì)比圖2各處理番茄植株根系內(nèi)生真菌門分類水平群落的相對(duì)豐度可知，子囊菌門(Ascomycota)、油壺菌門(Olpidiomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和unclassified_k__Fungi是各處理番茄植株根系內(nèi)生真菌的共有優(yōu)勢(shì)菌門。由表5可知，桃太郎/新砧處理根系的子囊菌門在其內(nèi)生真菌組成結(jié)構(gòu)中占比為46.73 %，較桃太郎處理低6.57個(gè)百分點(diǎn)；擔(dān)子菌門在其內(nèi)生真菌組成結(jié)構(gòu)中的占比為41.48 %，較新砧處理高34.42個(gè)百分點(diǎn)；而油壺菌門在其內(nèi)生真菌組成結(jié)構(gòu)中占比為3.65 %，較新砧處理低43.50個(gè)百分點(diǎn)，較桃太郎處理低3.49個(gè)百分點(diǎn)。從表5還可看出，桃太郎/寶砧處理根系的子囊菌門在其內(nèi)生真菌組成結(jié)構(gòu)中占比為41.33 %，分別較寶砧和桃太郎處理低7.23和11.97個(gè)百分點(diǎn)；擔(dān)子菌門在其內(nèi)生真菌組成結(jié)構(gòu)中占比為18.02 %，較寶砧處理高8.21個(gè)百分點(diǎn)，較桃太郎處理低19.63個(gè)百分點(diǎn)；而油壺菌門在其內(nèi)生真菌組成結(jié)構(gòu)中占比為36.03 %，較桃太郎處理高28.89個(gè)百分點(diǎn)，較寶砧處理低11.12個(gè)百分點(diǎn)?？梢?，采用不同砧木嫁接成活的番茄植株，其根系優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌組成的占比受砧木種類和接穗共同影響。由此判斷，砧穗組合不同是番茄嫁接植株抗性存在差異的重要原因。

表5 各品種番茄及其嫁接植株根系內(nèi)生真菌門分類水平的占比比較

2.3.2 屬分類水平的優(yōu)勢(shì)菌群分析 對(duì)比圖3各處理番茄植株根系內(nèi)生細(xì)菌屬分類水平群落的相對(duì)豐度可知，有命名信息的番茄各處理根系內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬有假單胞菌屬(Pseudomonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、波氏桿菌屬(Bordetella)、不粘柄菌屬(Asticcacaulis)、分支桿菌屬(Mycobacterium)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、微桿菌屬(Microbacterium)、熱單胞菌屬(Thermomonas)、申氏桿菌屬(Shinella)、纖維弧菌屬(Cellvibrio)和鏈霉菌屬(Streptomyces)。由表6可知，桃太郎/新砧處理根系的假單胞菌屬、unclassified_f__Burkholderiaceae、波氏桿菌屬和unclassified_f__Rhodanobacteraceae在其內(nèi)生細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)中占比分別為19.37 %、2.80 %、1.93 %和2.74 %，較新砧處理相應(yīng)屬在其內(nèi)生細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)中的占比分別降低16.32、2.57、3.64和1.90個(gè)百分點(diǎn)，而黃桿菌屬在其內(nèi)生細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)中占比為7.04 %，較新砧處理提高2.1個(gè)百分點(diǎn)；與桃太郎處理相比，桃太郎/新砧處理根系假單胞菌屬在其內(nèi)生細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)中占比降低49.80個(gè)百分點(diǎn)，而黃桿菌屬和unclassified_f__Burkholderiacea在其內(nèi)生細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)中占比分別提高5.19和1.41個(gè)百分點(diǎn)。從表6還可看出，桃太郎/寶砧處理根系的假單胞菌屬和unclassified_f__Rhodanobacteraceae在其內(nèi)生細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)中占比分別為12.22 %和3.34 %，分別較寶砧處理降低33.53和0.97個(gè)百分點(diǎn)，而黃桿菌屬、unclassified_f__Burkholderiaceae、波氏桿菌屬和纖維弧菌屬在其內(nèi)生細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)中占比分別為2.48 %、5.51 %、7.97 %和7.68 %，較寶砧處理分別提高0.26、2.69、5.84和6.48個(gè)百分點(diǎn)；與桃太郎處理相比，桃太郎/寶砧處理根系的假單胞菌屬在其內(nèi)生細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)中占比降低56.95個(gè)百分點(diǎn)，而黃桿菌屬和unclassified_f__Burkholderiaceae在其內(nèi)生細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)中占比分別提高0.63和4.12個(gè)百分點(diǎn)。同時(shí)，桃太郎/新砧和桃太郎/寶砧處理根系均富集了鞘氨醇桿菌屬、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium和纖維弧菌屬細(xì)菌。可見，嫁接番茄植株根系優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌在屬分類水平組成的種類均多于相應(yīng)的砧木和接穗實(shí)生自根植株，這也可能是嫁接番茄植株在正常情況下抗性得以增強(qiáng)的原因之一。

表6 各品種番茄及其嫁接植株根系內(nèi)生細(xì)菌屬分類水平占比比較

對(duì)比圖4各處理番茄植株根系內(nèi)生真菌屬分類水平群落的相對(duì)豐度可知，各處理根系內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)菌屬主要有油壺菌屬(Olpidium)、Cutaneotrichosporon、球囊菌屬(Plectosphaerella)、紅酵母菌屬(Rhodotorula)、枝孢菌屬(Cladosporium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、木霉菌屬(Trichoderma)、杯梗孢屬(Cyphellophora)、柄孢殼屬(Zopfiella)、微座孢屬(Microdochium)、彎孢屬(Curvularia)和鏈格孢屬(Alternaria)等。由表7可知，桃太郎/新砧處理根系的油壺菌屬和unclassified_f__Chaetomiaceae在其內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)菌屬中占比分別為3.65 %和1.55 %，分別較新砧處理降低43.50和1.35個(gè)百分點(diǎn)，而Cutaneotrichosporon、球囊菌屬、紅酵母菌屬、木霉菌屬和unclassified_k__Fungi在其內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)菌屬中占比分別為12.26 %、29.20 %、29.10 %、3.65 %和7.87 %，分別較新砧處理提高6.36、26.12、28.0、2.65和6.65個(gè)百分點(diǎn)；同時(shí)，枝孢菌屬和unclassified_o__Branch06真菌富集，unclassified_f__Didymellaceae、鐮刀菌屬、unclassified_f__Nectriaceae和unclassified_c__Sordariomycetes真菌缺失；與桃太郎處理相比，桃太郎/新砧處理根系的油壺菌屬、Cutaneotrichosporon、枝孢菌屬、木霉菌屬和unclassified_f__Chaetomiaceae在其內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)菌屬中占比分別降低3.49、7.68、4.34和3.64個(gè)百分點(diǎn)，但球囊菌屬、紅酵母菌屬和unclassified_k__Fungi在其內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)菌屬中占比分別提高11.75、27.71和6.09個(gè)百分點(diǎn)；同時(shí)，unclassified_o__Branch06真菌富集、unclassified_f__Nectriaceae真菌缺失。從表7還可看出，桃太郎/寶砧處理根系的油壺菌屬、Cutaneotrichosporon、枝孢菌屬和鐮刀菌屬在其內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)菌屬中占比分別為36.03 %、5.17 %、2.37 %和8.41 %，分別較寶砧處理降低2.13、3.38、17.17和10.65個(gè)百分點(diǎn)，而球囊菌屬、紅酵母菌屬、unclassified_k__Fungi、unclassified_f__Nectriaceae和青霉菌屬在其內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)菌屬中占比分別為2.28 %、12.39 %、4.56 %、2.60 %和4.60 %，分別較寶砧處理提高0.17、11.31、1.8、0.38和3.59個(gè)百分點(diǎn)；此外，unclassified_f__Didymellaceae屬真菌富集；與桃太郎處理相比，桃太郎/寶砧處理根系的Cutaneotrichosporon、球囊菌屬和枝孢菌屬在其內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)菌屬中占比分別分別降低30.29、15.17和11.06個(gè)百分點(diǎn)，而油壺菌屬、紅酵母菌屬、unclassified_k__Fungi和unclassified_f__Nectriaceae在其內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)菌屬中占比分別提高28.89 %、11.00 %、2.78 %和1.14 %；同時(shí)，unclassified_f__Didymellaceae、鐮刀菌屬和青霉菌屬真菌富集，木霉菌屬和unclassified_f__Chaetomiaceae真菌缺失。綜上所述，與砧木和接穗實(shí)生自根植株相比，嫁接番茄植株根系內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)屬的占比雖然發(fā)生了一定變化，但嫁接植株根系優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌屬的數(shù)量與砧木或接穗實(shí)生自根番茄植株基本一致，未呈現(xiàn)如內(nèi)生細(xì)菌一樣增加的變化趨勢(shì)。由此推測(cè)，嫁接番茄植株根系的內(nèi)生真菌可能比內(nèi)生細(xì)菌更難定殖。

表7 各品種番茄及其嫁接植株根系內(nèi)生真菌屬分類水平的占比比較

2.4 番茄嫁接和自根植株根系內(nèi)生細(xì)菌和真菌基于OTU水平的Venn圖分析

基于OTU水平的Venn圖(圖5)顯示，桃太郎、新砧和桃太郎/新砧處理根系的共有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌OTU為362個(gè)，新砧處理特有的OTU為90個(gè)，桃太郎處理特有的OTU為81個(gè)，桃太郎/新砧處理特有的OTU為43個(gè)；桃太郎、寶砧和桃太郎/寶砧處理根系的共有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌OTU為409個(gè)，寶砧處理特有的OTU為55個(gè)，桃太郎處理特有的OTU為58個(gè)，桃太郎/寶砧處理特有的OTU為43個(gè)。從圖6可看出，桃太郎、新砧和桃太郎/新砧處理根系的共有優(yōu)勢(shì)真菌OTU為107個(gè)，新砧處理特有的OTU為110個(gè)，桃太郎處理特有的OTU為103個(gè)，桃太郎/新砧處理特有的OTU為31個(gè)；桃太郎、寶砧和桃太郎/寶砧處理根系的共有優(yōu)勢(shì)真菌OTU為118個(gè)，寶砧處理特有的OTU為64個(gè)，桃太郎處理特有的OTU為99個(gè)，桃太郎/寶砧處理特有的OTU為90個(gè)?？梢姡藿臃阎仓旮抵刑赜械腛TU可能是其抗性增強(qiáng)的原因之一，同時(shí)，嫁接植株根系內(nèi)生細(xì)菌和真菌的種類受砧木種類和接穗共同影響。

3 討 論

根系健康的微生物一方面可抑制植物病原菌過(guò)度繁殖，另一方面可酶解產(chǎn)生誘導(dǎo)物質(zhì)并積累大量次生抗病物質(zhì)，提高作物的抗病性[17]。植物根系的內(nèi)生細(xì)菌在植物生長(zhǎng)發(fā)育、病蟲害生防及生物修復(fù)等方面發(fā)揮著重要作用，其多樣性是植物內(nèi)生菌與植物間微生態(tài)關(guān)系平衡的重要保障[18]。植物根系內(nèi)生真菌能與宿主植物形成互利共生關(guān)系，產(chǎn)生次生代謝物質(zhì)提高宿主植株的抗逆性[19]。對(duì)于嫁接植株，砧木的基因型直接影響接穗對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)化[20]。因此，從內(nèi)生微生物角度探究嫁接對(duì)番茄植株抗性的影響，對(duì)番茄生產(chǎn)上篩選和開發(fā)利用有益微生物具有重要的指導(dǎo)作用。

任奎瑜等[21]研究認(rèn)為，Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)越大，說(shuō)明物種的豐富度越高；Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，說(shuō)明物種的多樣性越高；Heip指數(shù)越大，說(shuō)明物種的均勻度越高。本研究中，嫁接番茄植株根系內(nèi)生細(xì)菌的Shannon指數(shù)顯著大于其桃太郎接穗實(shí)生自根植株，說(shuō)明嫁接有助于提高番茄植株根系內(nèi)生細(xì)菌的多樣性。已有研究表明，植株根系的內(nèi)生細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生抗生素類物質(zhì)、水解酶、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等途徑控制植物病害[22]。由此推測(cè)，多樣性更豐富的根系內(nèi)生細(xì)菌會(huì)促進(jìn)番茄植株分泌抗生素類物質(zhì)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性，從而提高番茄嫁接植株的抗性。本研究還發(fā)現(xiàn)，嫁接番茄植株根系內(nèi)生細(xì)菌的Heip指數(shù)均顯著大于其桃太郎接穗實(shí)生自根植株，明顯大于相應(yīng)的砧木實(shí)生自根植株，說(shuō)明嫁接番茄植株根系內(nèi)生細(xì)菌的均勻度較高，群落結(jié)構(gòu)更均勻；番茄嫁接植株根系的內(nèi)生真菌種類及其多樣性不僅受砧木品種影響，還受接穗類型影響，其中，與相應(yīng)的新砧和寶砧處理相比，桃太郎/新砧處理根系內(nèi)生真菌的多樣性和豐富度呈下降趨勢(shì)，而桃太郎/寶砧處理根系內(nèi)生真菌的多樣性和豐富度呈增加趨勢(shì)，與文才藝[23]等的研究結(jié)果一致，可能與不同品種番茄植株內(nèi)生真菌占據(jù)不同生態(tài)位、植物體內(nèi)或表現(xiàn)為分離頻率高、數(shù)量大的優(yōu)勢(shì)種群，或?yàn)橐恍┫∮蟹N群緊密相關(guān)。

本研究基于門分類水平分析發(fā)現(xiàn)，變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和厚壁菌門細(xì)菌雖然都是番茄接穗、砧木和嫁接植株根系的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌門，但嫁接后番茄植株根系內(nèi)生放線菌門和擬桿菌門細(xì)菌在其內(nèi)生細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)中占比增加，變形菌門細(xì)菌在其內(nèi)生細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)中占比降低，與Mendes等[24]研究認(rèn)為放線菌門的相對(duì)豐度與抗病能力呈正相關(guān)、對(duì)植物病害具有防御作用的觀點(diǎn)一致，說(shuō)明嫁接能增加有益細(xì)菌門的數(shù)量，從而提高植株抗性；子囊菌門、油壺菌門、unclassified_k__Fungi和擔(dān)子菌門真菌都是番茄接穗、砧木和嫁接植株根系的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌門，但番茄嫁接植株子囊菌門在其內(nèi)生真菌組成結(jié)構(gòu)中的占比低于其接穗實(shí)生自根植株，其中，寄生型子囊菌門可引起植物病害[25]，說(shuō)明嫁接會(huì)降低有害真菌門的數(shù)量，這可能是嫁接可提高番茄植株抗性的原因之一。

本研究基于屬分類水平分析發(fā)現(xiàn)，假單胞菌屬、黃桿菌屬、波氏桿菌屬、unclassified_f__Burkholderiaceae、不粘柄菌屬、分支桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、鞘氨醇桿菌屬、微桿菌屬、熱單胞菌屬、申氏桿菌屬、纖維弧菌屬和鏈霉菌屬細(xì)菌都是番茄砧木、接穗和嫁接植株根系的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬。桃太郎/新砧和桃太郎/寶砧處理植株根系假單胞菌屬在其內(nèi)生細(xì)菌屬組成結(jié)構(gòu)中占比低于相應(yīng)的砧木和接穗實(shí)生自根植株，假單胞菌屬細(xì)菌作為植物病原菌[26]，會(huì)危害番茄、黃瓜和甜菜等作物生長(zhǎng)，說(shuō)明嫁接可降低番茄植株根系病原菌數(shù)量；同時(shí)，嫁接番茄植株根系均富集了具有解磷功能的鞘氨醇桿菌屬和固氮功能的Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium[27]，說(shuō)明嫁接能富集對(duì)番茄植株根系生態(tài)循環(huán)有益的微生物；與砧木和接穗實(shí)生自根植株相比，嫁接番茄植株根系具有更豐富的功能內(nèi)生細(xì)菌，同時(shí)可降低致病內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量，這可能是嫁接番茄植株抗性得以提高的主要原因之一。

本研究中，油壺菌屬、Cutaneotrichosporon、球囊菌屬、紅酵母菌屬、枝孢菌屬、鐮刀菌屬、木霉菌屬、杯梗孢屬、柄孢殼屬、微座孢屬、彎孢屬和鏈格孢屬真菌都是番茄接穗、砧木和嫁接植株根系的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌屬；與砧木和接穗實(shí)生自根植株相比，番茄嫁接植株根系中優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌屬在其內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)屬組成結(jié)構(gòu)中占比雖然發(fā)生了一定的變化，但番茄嫁接植株根系優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌屬種類的數(shù)量基本與砧木或接穗實(shí)生自根植株一致；嫁接番茄植株根系的油壺菌屬在其內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)屬組成結(jié)構(gòu)中占比低于相應(yīng)的砧木實(shí)生自根植株，而油壺菌屬是一種在植株根系轉(zhuǎn)性寄生的傳毒真菌[28]，說(shuō)明嫁接番茄植株根系的有害真菌數(shù)量較少；嫁接番茄植株根系紅酵母菌屬占比顯著大于接穗和砧木實(shí)生自根植株，而紅酵母菌屬中的微生物具有促進(jìn)宿主對(duì)礦物質(zhì)和有機(jī)質(zhì)養(yǎng)分的吸收[29]，提高宿主植物抗逆性[30]的作用?；贠TU水平的Venn分析可知，嫁接番茄植株根系特有的OTU可能是其抗性增強(qiáng)的原因之一。

綜上所述，番茄嫁接可改變植株根系內(nèi)生微生物的多樣性特征，尤其能提高根系內(nèi)生細(xì)菌的多樣性，改善根系內(nèi)生細(xì)菌的均勻結(jié)構(gòu)；在門分類水平，嫁接番茄植株根系內(nèi)生細(xì)菌具有抗病功能的放線菌門占比增加，可引起植物病害的子囊菌門占比降低；在屬分類水平，嫁接番茄植株根系內(nèi)生細(xì)菌病原菌假單胞菌屬和傳毒真菌油壺菌屬的占比降低；嫁接番茄植株根系除擁有與砧木和接穗實(shí)生自根植株相同的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬外，還富集了具有誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性物質(zhì)的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬，以及根據(jù)不同砧木種類富集或缺失部分優(yōu)勢(shì)真菌屬。目前人們對(duì)內(nèi)生真菌與病原真菌及內(nèi)生真菌與宿主植物之間的關(guān)系仍知之甚少[31]，因此，番茄嫁接植株根系富集與缺失的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌屬功能仍有待深入探究。

4 結(jié) 論

番茄嫁接植株根系具有較其砧木和接穗實(shí)生自根植株根系更豐富的內(nèi)生細(xì)菌多樣性和更均勻的群落結(jié)構(gòu)；在門和屬分類水平，番茄嫁接植株根系的內(nèi)生細(xì)菌和真菌數(shù)量增加，病原微生物數(shù)量減少，并富集有解磷和固氮等促生功能的有益內(nèi)生菌屬，擁有更豐富的微生物OTU和特有OTU，是番茄嫁接植株抗性增強(qiáng)的重要原因之一。