代艷娜，潘 虎，劉青海*，楊曉鳳

(1. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)研究所， 西藏 拉薩 850032；2. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，四川 成都 610066)

【研究意義】根據(jù)中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部市場(chǎng)預(yù)警專家委員會(huì)統(tǒng)計(jì)分析，2018年我國(guó)蔬菜種植面積約2043.89萬(wàn)hm2，產(chǎn)量約7.035億t，人均占有量為504.14 kg，普通白菜和大白菜等葉類蔬菜是我國(guó)播種面積較大、產(chǎn)量較高、種植戶喜植的省工蔬菜品種[1]。葉類蔬菜的大面積種植導(dǎo)致菜青蟲、小菜蛾和甜菜夜蛾等蟲害頻發(fā)，造成葉類蔬菜產(chǎn)量和品質(zhì)的降低[2]。滅幼脲(Chlorbenzuron)是一種苯甲酰脲類昆蟲幾丁質(zhì)合成抑制劑，該藥可妨礙昆蟲內(nèi)表皮中幾丁質(zhì)的沉積和生物合成，抑制昆蟲蛻皮，最終導(dǎo)致幼蟲死亡[3]。目前，該藥主要用于潛葉蛾、菜青蟲、毒蛾類及夜蛾類等鱗翅目害蟲的防治[4]，但其使用量較大、藥效慢、果蔬殘留檢出率較高、對(duì)水生甲殼動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物毒害較大[5-6]，故其殘留消解動(dòng)態(tài)和生物安全性需持續(xù)關(guān)注?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，有關(guān)滅幼脲在果蔬和土壤中的殘留及消解動(dòng)態(tài)的報(bào)道較少，國(guó)內(nèi)僅針對(duì)大白菜[7-8]、甘藍(lán)[9]、蘋果[10]、桃[11]等少數(shù)果蔬開展了相關(guān)研究，且上述研究主要集中在北京、上海、山東、湖北等低海拔地區(qū)，而尚無(wú)西藏等高海拔地區(qū)的相關(guān)研究報(bào)道，滅幼脲在高海拔地區(qū)蔬菜上的殘留安全性有待進(jìn)一步探討?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】農(nóng)藥的殘留及消解動(dòng)態(tài)與生態(tài)環(huán)境、氣候有著密切關(guān)系[12-13]，西藏自治區(qū)拉薩市是地處青藏高原腹地，海拔約3667 m，高寒、缺氧、強(qiáng)日照等特殊的自然環(huán)境導(dǎo)致滅幼脲等農(nóng)藥的殘留及消解動(dòng)態(tài)與四川等溫和、濕潤(rùn)、多霧的低海拔地區(qū)存在較大差異，但目前尚無(wú)開展相關(guān)研究報(bào)道。本文采用UPLC-MS/MS法分析了滅幼脲在西藏自治區(qū)拉薩市和四川省彭州市設(shè)施蔬菜種植基地的4種葉類蔬菜和土壤中的消解動(dòng)態(tài)及最終殘留量的差異?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以期明確蔬菜品種和不同海拔地區(qū)的種植環(huán)境對(duì)滅幼脲的殘留及消解動(dòng)態(tài)的影響，為將滅幼脲用于高海拔地區(qū)葉類蔬菜蟲害的防治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，促進(jìn)西藏地區(qū)蔬菜等凈土健康產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試材料 供試農(nóng)藥：20 %滅幼脲懸浮劑(京博農(nóng)化科技有限公司)。供試作物：四季王大白菜和法國(guó)皇后西芹(鳳鳴雅世種業(yè)有限公司)，意大利生菜和寒春快菜(昆明市華興種業(yè)有限公司)。

1.1.2 試劑和耗材 滅幼脲標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000 μg/mL，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所)，甲醇、乙腈(進(jìn)口色譜純，美國(guó)Fisher公司)，氯化鈉(分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司)，乙酸銨(色譜純，迪馬科技有限公司)，有機(jī)系濾膜(0.22 μm，島津技邇上海商貿(mào)有限公司)，CAPCELL PAK MG-Ⅲ C18色譜柱 (100 mm×2.0 mm×3 μm，日本資生堂)。

1.2 儀器

美國(guó)Waters公司的ACQUITY UPLC H-class超高效液相色譜系統(tǒng)(包括二元梯度泵、真空在線脫氣機(jī)、柱溫箱和自動(dòng)進(jìn)樣器)，美國(guó)AB SCIEX公司的4500 Qtrap三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(配置TurbolonSprap離子源、HARVARD pumpⅡ針泵及安裝Analyst軟件的計(jì)算機(jī))，德國(guó)BRAUN公司的CombiMax K600型蔬菜粉碎機(jī)，德國(guó)IKA公司的T18型勻漿機(jī)，電子天平(d=0.001 g、上海菁海儀器有限公司)，美國(guó)Millipore公司的Milli-Q超純水制備系統(tǒng)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2018年3月至2020年3月在西藏自治區(qū)拉薩市堆龍德慶區(qū)羊達(dá)蔬菜種植專業(yè)合作社(海拔3667 m)和四川省彭州市濛陽(yáng)鎮(zhèn)四川農(nóng)科院植物高技術(shù)育種試驗(yàn)基地(海拔593 m)設(shè)施蔬菜基地開展相關(guān)殘留試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[14]和《植物源性農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留貯藏穩(wěn)定性試驗(yàn)準(zhǔn)則》[15]。

1.3.1 最終殘留試驗(yàn) 設(shè)3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積約50 m2，各試驗(yàn)小區(qū)間設(shè)保護(hù)隔離區(qū)，另設(shè)清水空白對(duì)照區(qū)。按照采收期倒推施藥時(shí)間，按照滅幼脲570 mL/hm2[114 mL(a.i)/hm2,最大推薦劑量)]的劑量噴霧施藥2次，施藥間隔7 d，于末次施藥后7、14、21 d采集蔬菜整株樣待測(cè)。

1.3.2 消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn) 植株。設(shè)3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積約50 m2，各試驗(yàn)小區(qū)間設(shè)保護(hù)隔離區(qū)，另設(shè)清水空白對(duì)照區(qū)。4種葉菜約生長(zhǎng)到成熟個(gè)體1/2時(shí)，按滅幼脲855 mL/hm2[171 mL(a.i)/hm2,最大推薦劑量1.5倍]的劑量均勻噴霧施藥1次，于施藥后2 h，1 d、2 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d采集整株蔬菜待測(cè)。

土壤。選擇在種植地附近的空地中進(jìn)行，試驗(yàn)小區(qū)面積為 50 m2(分3個(gè)重復(fù)小區(qū)); 施藥劑量855 mL/hm2[171 mL(a.i)/hm2]，施藥后 2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d采樣，另設(shè)清水對(duì)照。

1.3.3 樣品采集、運(yùn)輸、制備和儲(chǔ)存 植株采樣。隨機(jī)采集2份蔬菜樣品，每份樣品不少于12個(gè)個(gè)體且不少于2 kg。小區(qū)邊行和每行距離兩端0.5 m 內(nèi)不采樣。蔬菜鮮樣2 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，去除表面泥土和明顯腐壞、萎蔫部位后切段、勻漿，留取約250 g樣品于-20 ℃冷凍保存、備用。

土壤采樣。隨機(jī)選取5～10個(gè)樣點(diǎn)，用土鉆采集0～10 cm 的土壤1～2 kg，除去土壤中的碎石、雜草和植物根莖等雜物，混勻后采用四分法留樣250 g，于-20 ℃冷凍保存、備用。

1.4 分析方法

1.4.1 樣品前處理[16]植株。稱取25.00 g(精確至±0.01 g)蔬菜樣品于250 mL燒杯中，加入50 mL乙腈，12 000 r/min高速勻漿2 min，用定量濾紙快速過濾至裝有5～7 g 氯化鈉的具塞試管中，劇烈振蕩1 min，室溫靜置30 min，精確吸取上層乙腈相溶液1 mL，加入1 mL甲醇水溶液(1∶1/v∶v)，渦旋混勻后過0.22 μm微孔濾膜，裝瓶待測(cè)。

土壤。稱取10.00 g(精確至±0.01 g)土壤樣品于50 mL離心管中，依次加入10 mL水、20 mL乙腈，渦旋混勻1 min后，超聲提取10 min，放入水浴振蕩器中振蕩30 min，用定量濾紙快速過濾至裝有5～7 g 氯化鈉的具塞試管中，劇烈振蕩1 min，室溫靜置30 min，精確吸取上層乙腈相溶液1 mL，加入1 mL甲醇水溶液(1∶1/v∶v)，渦旋混勻后過0.22 μm微孔濾膜，裝瓶待測(cè)。

1.4.2 儀器條件[17]色譜條件：進(jìn)樣體積3 μl；柱溫40 ℃；流動(dòng)相A相為含0.1 %甲酸的0.2 mmol/L乙酸銨水溶液，B相為甲醇，流速0.3 mL/min；洗脫梯度程序：A∶B=70∶30(v/v)，2.0 min；A∶B=60∶40(v/v)，5.5 min；A∶B=5∶95(v/v)，6.5 min；A∶B=3∶97(v/v)，9.0 min；A∶B=70∶30(v/v)。質(zhì)譜條件：采用ESI正離子MRM監(jiān)測(cè)模式，霧化氣流速50.0 L/h，輔助加熱氣流速50.0 L/h，氣簾氣流速30.0 L/h，噴霧電壓5500 V，輔助加熱氣溫度550 ℃。離子對(duì)和碰撞能量參數(shù)見表1。

表1 滅幼脲的特征監(jiān)測(cè)離子

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制作和添加回收試驗(yàn) 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：精確移取0.5 mL的滅幼脲標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000 μg/mL)于10 mL棕色容量瓶中，乙腈定容，得到50 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再移取1.0 mL的滅幼脲標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL棕色容量瓶中，乙腈定容，得到5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別用4種葉菜空白基質(zhì)和土壤空白基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到質(zhì)量濃度分別為 0.001、0.002、0.005、0.08、0.1、0.2、0.3、0.5和1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。添加回收試驗(yàn)：在4種葉菜空白樣品和土壤空白樣品中添加一定量的滅幼脲標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為 0.01、0.1 和 0.5 mg/kg，重復(fù)5次，按1.4.1 和 1.4.2所述方法進(jìn)行樣品前處理及上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)效應(yīng)的消除及典型色譜圖

在實(shí)際樣品分析中共洗脫基質(zhì)成分會(huì)引起分析信號(hào)的抑制或增強(qiáng)，是LC-MS/MS 定量分析中產(chǎn)生誤差的根本原因[18-19]。本試驗(yàn)采用基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)樣品來(lái)補(bǔ)償實(shí)際樣品溶液對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)，在1.4.2液相色譜-質(zhì)譜條件下未出現(xiàn)雜質(zhì)干擾峰(圖1)，滅幼脲的響應(yīng)值較好，能夠確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2 方法線性范圍和檢出限

標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.005～0.5 mg/L范圍內(nèi)滅幼脲呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系， 相關(guān)系數(shù)r為0.9985～0.9996，檢出限為3.34×10-6～2.55×10-5mg/kg，定量限均為0.01 mg/kg，能夠滿足儀器分析相關(guān)系數(shù)要求(表2)。

表2 滅幼脲在4種葉類蔬菜和土壤中的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.3 方法準(zhǔn)確度和精密度

添加回收試驗(yàn)結(jié)果表明，滅幼脲在小白菜、生菜、大白菜、芹菜和土壤中的回收率分別為82.31 %～117.28 %、77.25 %～117.87 %、84.59 %～111.69 %、87.99 %～117.47 %和82.52 %～113.40 %(表3)。RSD在3.1 %～8.2 %，結(jié)果均符合《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》要求。當(dāng)添加濃度0.005 mg/kg

表3 滅幼脲在4種蔬菜和土壤基質(zhì)中回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

續(xù)表3 Continued table 3

2.4 消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)結(jié)果

在西藏拉薩市和四川彭州市設(shè)施蔬菜基地開展的消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)結(jié)果顯示，兩地4種葉類蔬菜和土壤中滅幼脲的消解動(dòng)態(tài)曲線均呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系，滿足一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程Ct=C0e-kt(圖2)。滅幼脲在高海拔設(shè)施蔬菜基地的4種葉菜和土壤中的原始沉積量低于在低海拔設(shè)施蔬菜基地的4種葉菜中的原始沉積量(表4)，但滅幼脲在不同海拔地區(qū)的4種葉類蔬菜和土壤中的原始沉積量總體上差異性較小，說明農(nóng)藥原始沉積量跟海拔高度沒有明顯相關(guān)性。但同一地區(qū)4種葉類蔬菜上滅幼脲的原始沉積量由大到小依次為芹菜、生菜、小白菜和大白菜。半衰期結(jié)果顯示，滅幼脲在蔬菜中的半衰期比土壤中半衰期短，且高海拔地區(qū)4種葉類蔬菜及其土壤中滅幼脲的半衰期均短于低海拔地區(qū)，滅幼脲在4種蔬菜中的半衰期由短到長(zhǎng)依次為小白菜、生菜、大白菜、芹菜，其中滅幼脲在拉薩設(shè)施基地的芹菜和大白菜中的消解半衰期為7.0和3.4 d，而在彭州設(shè)施蔬菜基地的芹菜和大白菜中消解半衰期為11.6和6.2 d，差異較大，可能是由于拉薩地區(qū)日照強(qiáng)度大，導(dǎo)致該地區(qū)設(shè)施蔬菜中的農(nóng)藥降解速率較快。

表4 滅幼脲在4種作物和土壤中的消解動(dòng)態(tài)及半衰期

2.5 最終殘留試驗(yàn)結(jié)果

最終殘留量與施藥次數(shù)和施藥量均有關(guān)，農(nóng)藥殘留量隨著施藥次數(shù)和施藥量的增加，殘留量增大。最終殘留試驗(yàn)結(jié)果表明，間隔 7、14、21 d 采集樣品，滅幼脲在4種葉菜中的殘留量分別為 0.160～0.576、0.002～0.284 和 ND～0.175 mg/kg，拉薩市和彭州市小白菜中的滅幼脲殘留量均符合最大殘留限量(MRL)標(biāo)準(zhǔn)[20]，滅幼脲在小白菜菜中的安全風(fēng)險(xiǎn)較小。第2次施藥7 d后，滅幼脲在芹菜中的殘留量最大，在相同施藥條件下，拉薩市4種葉類蔬菜中滅幼脲的殘留情況優(yōu)于彭州市(表5)。由于我國(guó)尚未制定滅幼脲在芹菜、大白菜、生菜中的最大殘留限量值，此次殘留試驗(yàn)的結(jié)果，可以作為制定芹菜、大白菜、生菜中滅幼脲最大殘留限量值數(shù)據(jù)參考。

表5 滅幼脲在4種葉菜和土壤中的殘留量

3 討 論

本研究建立了UPLC-MS/MS 測(cè)定葉類蔬菜及其種植土壤中滅幼脲的消解動(dòng)態(tài)方法，該方法前處理操作簡(jiǎn)便，具有較好的精密度、靈敏度和準(zhǔn)確度，能夠滿足不同海拔地區(qū)滅幼脲的殘留檢測(cè)要求。殘留消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)結(jié)果表明，滅幼脲在拉薩市和彭州市的四種葉類蔬菜及其土壤中的消解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，滅幼脲的年際間消解動(dòng)態(tài)及最終殘留差異較小，但高、低海拔地區(qū)的消解動(dòng)態(tài)及最終殘留差異較大。作物本身對(duì)農(nóng)藥吸附能力和生物稀釋作用影響農(nóng)藥的降解速率，芹菜對(duì)滅幼脲的吸附能力強(qiáng)于其他3種蔬菜，因此滅幼脲在芹菜上的原始沉積量大于其他3種蔬菜，半衰期相對(duì)長(zhǎng)于其他3種蔬菜。2018 和2019年滅幼脲在拉薩市的4種葉類蔬菜及其土壤中的半衰期和最終殘留量均小于彭州市，其中芹菜、大白菜和土壤中差異尤為顯著，上述結(jié)果表明地域環(huán)境(溫差、光照等)、土壤類型(有機(jī)質(zhì)、pH、陽(yáng)離子代換率)等因素對(duì)滅幼脲的殘留有著較大影響[21-22]。目前，有關(guān)滅幼脲在果蔬和土壤中的殘留及消解動(dòng)態(tài)的報(bào)道較少，而尚無(wú)西藏等高海拔地區(qū)的相關(guān)研究報(bào)道，農(nóng)藥降解速率與光照強(qiáng)度有很大關(guān)系，畢望富等[8]研究發(fā)現(xiàn)低海拔地區(qū)滅幼脲在大白菜上半衰期為13.2～14.0 d，在土壤中為8.8～27.0 d。而滅幼脲在高海拔地區(qū)在大白菜上的半衰期僅為3.4 d，土壤中11 d，可能是西藏地區(qū)光照強(qiáng)度大的原因。因此，根據(jù)本文的研究結(jié)果，在西藏地區(qū)可以適當(dāng)縮短滅幼脲的安全間隔期。同時(shí)，滅幼脲在4種不同葉類蔬菜上的降解半衰期也有較大差異，這可能與不同作物的生長(zhǎng)速率、對(duì)藥物的吸收性等差異有關(guān)[23-24]。本文首次探討了蔬菜品種和不同海拔地區(qū)的種植環(huán)境對(duì)滅幼脲的殘留及消解動(dòng)態(tài)的影響，為將滅幼脲用于高海拔地區(qū)葉類蔬菜蟲害的防治提供了詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)。

4 結(jié) 論

滅幼脲在拉薩市4種葉類蔬菜和土壤中的半衰期均短于彭州市，但其半衰期的長(zhǎng)短在不同地區(qū)的4種葉類蔬菜中無(wú)差異，即小白菜<生菜<大白菜<芹菜。在相同施藥條件下，拉薩市4種葉類蔬菜的滅幼脲殘留情況優(yōu)于彭州市，高海拔地區(qū)較低海拔地區(qū)為滅幼脲的殘留低風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域。