孫一帆，任廣喜，史啟今，姜丹，劉春生

北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488

甘草為豆科甘草屬植物烏拉爾甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、光果甘草G.glabraL.或脹果甘草G.inflateBat.的干燥根及根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是我國最常用的大宗藥材之一，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛等功效[1]。甘草酸是甘草的主要活性成分之一?，F(xiàn)代藥理學研究表明，甘草酸具有抗腫瘤[2]、抗炎[3]、保肝[4]、免疫調(diào)節(jié)[5]、抗病毒[6]和抗癌[7]等藥理活性，在藥品、保健品、食品添加劑、化妝品等行業(yè)廣泛應用，需求量日漸增多[8-9]。野生甘草資源經(jīng)歷多年的掠奪性采挖，已日趨枯竭[10-11]。目前，栽培甘草是甘草藥材的主要來源[12]。研究表明，不同產(chǎn)地野生和栽培甘草的甘草酸含量存在顯著差異，栽培甘草的甘草酸含量多數(shù)達不到《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020年版規(guī)定2.0%的最低標準[13]。因此，提高栽培甘草的甘草酸的含量是甘草產(chǎn)業(yè)發(fā)展中亟須解決的問題之一。

內(nèi)生真菌(endophytic fungi)是一類定殖在植物體內(nèi)且不會對宿主植物造成致病性影響的微生物，對植物的生長、發(fā)育、適應性和多樣化產(chǎn)生重要的影響[14-16]。1993年，Stierle等[17]首次從短葉紫杉TaxusbrevifoliaNutt.中分離出產(chǎn)紫杉醇(paclitaxel)的內(nèi)生真菌Taxomycesandreanae。截至目前，已從不同的藥用植物中分離出能夠合成喜樹堿(camptothecin)[18]、石杉堿甲(huperzine A)[19]、羅漢果苷Ⅴ(mogroside Ⅴ)[20]、丹參酮Ⅰ(tanshinone Ⅰ)和丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA)[21]、長春堿(vinblastine)和長春新堿(vincristine)[22]等復雜構(gòu)型化合物的內(nèi)生真菌。此外，內(nèi)生真菌也能促進宿主植物次生代謝產(chǎn)物的積累。在藥用植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.中分離的1株曲霉屬內(nèi)生真菌Trichodermaatroviride，其菌絲體提取物能夠促進丹參毛狀根的生長和丹參酮的生物合成[23]。將紅豆杉TaxuscuspidateSieb.et.Zucc.懸浮細胞與一株鐮刀屬內(nèi)生真菌Fusariummairei共培養(yǎng)，5 d后共培養(yǎng)體系中紫杉醇的含量是對照組的2倍[24]。將1株Anteaglonium屬內(nèi)生真菌T010重新定殖至藍莓Vacciniumcorymbosum幼苗的根部，通過比較轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌定殖后引起了藍莓幼苗的細胞代謝、生物合成和信號通路的變化，并促進幼苗生長[25]。上述研究表明，內(nèi)生真菌不僅能夠合成藥用天然化合物，而且在促進植物生長和次生代謝產(chǎn)物合成等方面具有極大的潛力。

內(nèi)生真菌的種類和多樣性受多種因素的共同影響，包括宿主植物的種類、生長環(huán)境、生長年限、氣候條件等。研究表明，內(nèi)生真菌與藥用植物的生長、發(fā)育和成分積累等密切相關，進而對藥材的道地性產(chǎn)生影響[26-27]。通過比較道地和非道地產(chǎn)區(qū)的牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.[28]、丹參[29]、川芎LigusticumchuanxiongHort.[30]等藥用植物內(nèi)生真菌的種類，發(fā)現(xiàn)道地產(chǎn)區(qū)的藥材通常攜帶更多特有種類的內(nèi)生真菌。本課題組前期比較了不同產(chǎn)地栽培甘草內(nèi)生真菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)道地產(chǎn)區(qū)甘草內(nèi)生真菌的分離率、定殖率、多樣性指數(shù)均高于非道地產(chǎn)區(qū)[31]。然而，關于野生和栽培2種不同的生長環(huán)境對甘草內(nèi)生真菌種類多樣性的影響鮮有報道。因此，本研究以2種不同生境(野生和栽培)的甘草為研究對象，分離、鑒定兩者的內(nèi)生真菌，系統(tǒng)分析比較2種不同生境甘草的內(nèi)生真菌種類和多樣性，為甘草內(nèi)生真菌資源利用和開發(fā)提供參考，也為進一步研究內(nèi)生真菌對野生和栽培甘草藥材的質(zhì)量影響提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品

5年生野生甘草于2019年6月份采自內(nèi)蒙古鄂爾多斯市杭錦旗吉日嘎朗圖鎮(zhèn)(E107.94°W40.79°)，5年生栽培的甘草采自北京中醫(yī)藥大學望京藥園(E116.42°W39.97°)。挖取新鮮健康的甘草根(無病斑傷口或腐爛)，采后迅速放入液氮保存。樣品經(jīng)北京中醫(yī)藥大學中藥學院劉春生教授鑒定為烏拉爾甘草GlycyrrhizauralensisFisch.。

1.2 試藥

內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)基由本實驗室配制。馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基：取200 g去皮的土豆切成小塊，加入去離子水煮沸30 min；8層紗布過濾，向濾液中加入瓊脂20 g，葡萄糖20 g，定容至1 L，121 ℃滅菌30 min。

75%乙醇(批號：KGDN6，北京百諾威生物科技有限公司)；瓊脂(批號：A7002)、葡萄糖(批號：S11022)、一次性塑料培養(yǎng)皿(批號：JSHM0125)、甘油(批號：S24784)、乳酸酚棉藍(LPCB)染色液(批號：S0245)、TAE緩沖液50×(批號：BN20121)均購于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；真菌基因組DNA提取試劑盒(批號：D2300，北京索萊寶科技有限公司)；Trans2K?DNA Marker(批號：BM101-01)、瓊脂糖(批號：GS201-01)、2×EasyTaq?聚合酶鏈式反應(PCR) SuperMix(+dye) 酶(批號：AS111-11)均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 儀器

LS-B35型立式壓力蒸汽滅菌器(江陰濱江醫(yī)療設備廠)；3K15型臺式高速冷凍離心機(德國SIGMA公司)；SW-CJ-1D型潔凈工作臺(江蘇蘇州蘇潔凈化設備廠)；JY-SP3型水平電泳槽(北京君意東方電泳設備有限公司)；PowerPac Basic Power Supply型基礎電泳儀、GelDoc 2000型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；HZQ-F100型立式恒溫振蕩培養(yǎng)箱(北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司)；Research Plus型單道可調(diào)量程移液器(德國Eppendorf公司)；MM400型混合冷凍球磨儀(德國Retsch公司)；ML51型生物顯微鏡(廣州市明美光電技術(shù)有限公司)；Veriti 96型梯度PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；GL-88B型旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

2 方法

2.1 樣品處理

先用樹枝剪將新鮮的甘草根剪成長約5 cm的甘草小段，再用流動的自來水沖洗1 h，最后用濾紙吸干水分，備用。樣品在4 ℃冰箱中保存不超過2周。

2.2 甘草的表面消毒及內(nèi)生真菌的分離

在超凈工作臺中，用75%乙醇和0.1%升汞對甘草小段進行表面消毒。表面消毒方法：先用0.1%升汞消毒8 min，無菌水漂洗1 min；再用75%乙醇消毒1 min，無菌水漂洗1 min并重復漂洗5次；最后用無菌濾紙吸干表面水分。將甘草小段切成0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm的組織塊，置于PDA培養(yǎng)基平皿中，每皿1塊。采用組織印跡法和漂洗液檢測法作為對照處理[32]，以驗證表面消毒是否徹底。將接種甘草組織塊的培養(yǎng)基置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗倒置培養(yǎng)7 d。采用菌絲尖端純化法，挑取組織塊表面新生的菌絲接種于新的PDA培養(yǎng)基中，反復分離純化直到形成單一菌落。采用PDA斜面試管保存和甘油凍存法進行內(nèi)生真菌的保存[33]。

2.3 內(nèi)生真菌的形態(tài)學和顯微學鑒定

形態(tài)學：每天觀察并記錄PDA平皿中菌落的直徑、顏色、形態(tài)、生長速度。顯微學：先在無菌載玻片的中央滴加1滴乳酸酚棉藍染色液，再用解剖針挑取少量菌絲，混勻染色30 s；最后，加入1滴甘油，蓋上蓋玻片并輕輕壓片。在光學顯微鏡下觀察真菌的孢子結(jié)構(gòu)、菌絲特征、有無橫隔并進行拍照。參考《真菌鑒定手冊》[34]、《中國真菌志》[35]等，初步鑒定內(nèi)生真菌。

2.4 內(nèi)生真菌的分子鑒定

利用真菌基因組DNA提取試劑盒提取內(nèi)生真菌基因組DNA。采用真菌通用引物內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)1和ITS4進行PCR擴增反應，引物序列：ITS1(5′-TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3′)。擴增體系：DNA模板1 μL，正反引物各1 μL，2×EasyTaq?PCR SuperMix (+dye) 15 μL，dd H2O補至30 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min(30個循環(huán))；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性結(jié)果送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。利用ContigExpress 9.10軟件對測序結(jié)果進行拼接，將拼接序列在美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中進行Blast比對。利用軟件MEGA 7.0進行聚類分析，應用鄰接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，kimura 2-parameter model計算進化距離，1000次重復檢驗發(fā)育樹的可靠性。

2.5 統(tǒng)計分析方法

統(tǒng)計2種不同生境甘草內(nèi)生真菌的分離率(isolation rate，IR)、相對頻率(relative frequency，RF)、多樣性指數(shù)/Shannon-Wiener指數(shù)(H)和相似系數(shù)/Sorenson系數(shù)(CS)[36]。

IR=(組織塊中得到的菌株數(shù)/總組織塊數(shù))×100%

(1)

RF=(分離的某種內(nèi)生真菌的菌株數(shù)/總菌株數(shù))×100%

(2)

(3)

(3)式中，n指內(nèi)生真菌種類的總數(shù)，Pi指某種內(nèi)生真菌的數(shù)量占全部內(nèi)生真菌總數(shù)的百分數(shù)。

CS=2j/(a+b)

(4)

(4)式中，j指2種不同生境甘草共有的內(nèi)生真菌種類數(shù)，a是野生生境甘草內(nèi)生真菌的種類數(shù)，b是栽培生境甘草內(nèi)生真菌的種類數(shù)。以上數(shù)值均利用SPSS 22.0進行計算。

3 結(jié)果與分析

3.1 甘草內(nèi)生真菌ITS序列PCR擴增結(jié)果

本實驗從2種不同生境的甘草中各取220個組織塊，分別分離得到214株和151株內(nèi)生真菌，共計365株。提取全部菌株的基因組DNA，以每株內(nèi)生真菌的DNA為模板，ITS1和ITS4為引物，擴增得到500～750 bp的條帶，電泳結(jié)果見圖1。

注：M.DNA marker；1～18.不同的菌株。圖1 2種不同生境甘草部分內(nèi)生真菌的rDNA ITS序列PCR擴增條帶

3.2 甘草內(nèi)生真菌的形態(tài)、顯微及分子鑒定

統(tǒng)計每株內(nèi)生真菌的菌落形態(tài)特征和菌絲體顯微特征，利用NCBI數(shù)據(jù)庫Blast比對rDNA ITS的測序拼接結(jié)果，下載相似度最高的菌株序列，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析親緣和進化關系，最后結(jié)合形態(tài)學、顯微學進行菌種鑒定，歸屬為4綱5目6科9屬30種內(nèi)生真菌(表1)。部分菌株的具體形態(tài)學、顯微學和分子鑒定結(jié)果見表2、圖2～3。

表1 2種不同生境甘草內(nèi)生真菌的分類結(jié)果

續(xù)表1

表2 甘草部分內(nèi)生真菌的同源菌株信息

注：A～K.依次為菌株L11、E9、Y9、尖孢鐮刀菌、多見鐮孢菌、腐皮鐮刀菌、C4、C5、Y4、損毀鏈格孢、青霉菌；A1～K1.菌株正面；A2～K2.菌株背面；A3～K3.菌絲和孢子的顯微特征。圖2 甘草部分內(nèi)生真菌的形態(tài)和顯微特征(LPCB,×400)

注：紅色方框表示本研究中分離的內(nèi)生真菌編號。圖3 甘草部分內(nèi)生真菌與同源菌株的聚類分析

3.2.1菌株L11 在PDA培養(yǎng)基中，該菌株有稀疏的白色菌絲；菌落開始是褐色，隨后顏色逐漸加深，最后為深褐色；分生孢子梗有重復分枝，有單生，頂部較細；小型分生孢子大量產(chǎn)生，無色，橢圓形。

將菌株L11 ITS測序結(jié)果進行Blast比對，結(jié)果顯示與菌株L11相似度最高的同源性序列均為無性世代Dactylonectria屬真菌，相似度最高為99.78%，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析顯示L11與Dactylonectriamacrodidyma親緣關系最近。綜合以上鑒定結(jié)果及查閱參考文獻[37]，鑒定菌種L11為Dactylonectria屬真菌D.macrodidyma。

3.2.2菌株E9 在PDA培養(yǎng)基中，該菌株的菌絲為白色，邊緣整齊，較疏松，菌落底部有橙黃色色素產(chǎn)生；分生孢子梗掃帚狀分枝，分生孢子橢圓形。

將菌株E9 ITS測序結(jié)果進行Blast比對，結(jié)果顯示菌株E9與生赤殼科螺旋聚孢霉屬粉紅粘帚菌Clonostachysrosea的相似度最高，為99.47%。綜合以上鑒定結(jié)果及查閱參考文獻[38]，鑒定菌E9為粉紅粘帚菌C.rosea。

3.2.3菌株Y9 在PDA培養(yǎng)基中，該菌株的菌落呈白粉色，氣生菌絲絨狀，產(chǎn)生大型分生孢子和小型分生孢子；大型分生孢子鐮刀型，有1個隔膜，小型分生孢子卵形或橢圓形；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)為單瓶梗，厚垣孢子多，球形。

將菌株Y9 ITS測序結(jié)果進行Blast比對，結(jié)果顯示菌株Y9與4株叢赤殼科鐮刀屬真菌的相似度最高，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析顯示Y9與Fusariummoniliformis親緣關系最近。綜合以上鑒定結(jié)果及查閱參考文獻[39]，鑒定菌Y9為鐮刀屬真菌F.moniliformis。

3.2.4菌株C4 在PDA培養(yǎng)基中，該菌株的菌絲呈白色至褐色，較稀疏，氣生菌絲呈氈狀；菌落背面褐色，邊緣白色；孢子長橢圓形，氣生菌絲不分枝或少分枝。

將菌株C4 ITS測序結(jié)果進行Blast比對，結(jié)果顯示與菌株C4相似度較高的同源性序列共3條，相似度最高為99.56%，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析顯示C4與Ilyonectriadestructans親緣關系最近。綜合以上鑒定結(jié)果及查閱參考文獻[40]，鑒定菌株C4為土赤殼屬真菌I.destructans。

3.2.5菌株C5 在PDA培養(yǎng)基中，該菌株的菌落呈白色絲絨狀，邊緣整齊，厚度適中，培養(yǎng)基背面黃色，分生孢子梗分支或少分支，褐色，或只有產(chǎn)孢細胞；產(chǎn)孢細胞為產(chǎn)孢瓶體，無色，近無色至中度褐色；分生孢子單胞，無色或近無色，黏孢子，解離。

將菌株C5 ITS測序結(jié)果進行Blast比對，結(jié)果顯示與菌株C5相似度較高的同源性序列共3條，相似度最高為100%，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析顯示C5與Cadophorafastigiata親緣關系最近。綜合以上鑒定結(jié)果及查閱參考文獻[41]，鑒定菌株C5為背芽突霉屬真菌C.fastigiata。

3.2.6菌株Y4 在PDA培養(yǎng)基中，該菌株的菌落呈絨狀，灰綠色或棕色；新生菌絲表面白色，成熟時變成橄欖綠色；菌絲分枝、分離。產(chǎn)孢部分合軸式延伸，分生孢子梗橄欖褐色至褐色，圓柱形、紡錘形、橢圓形；分生孢子梗分支，在分支鏈中產(chǎn)生大量分生孢子，在鏈的末端有較小尺寸的分生孢子。分生孢子頂生或側(cè)生，呈單個、深色、橢圓形或圓柱形；分生孢子通過分生孢子梗頂端或側(cè)面壁上的孔發(fā)育，鏈狀、多分支的孢子鏈含有5～11個孢子。

將菌株Y4 ITS測序結(jié)果進行Blast比對，結(jié)果顯示與菌株Y4相似度較高的同源性序列均為分子孢子菌屬真菌，相似度最高為99.82%，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析顯示Y4與Cladosporiumcladosporioides親緣關系最近。綜合以上鑒定結(jié)果及查閱參考文獻[42]，鑒定菌株Y4為枝狀枝孢菌C.cladosporioides。

3.3 2種不同生境甘草內(nèi)生真菌的多樣性比較

本實驗從野生生境的甘草中分離得到214株內(nèi)生真菌，共歸屬為9個屬，鐮刀屬(62.62%)和曲霉屬(12.15%)為優(yōu)勢菌屬，其次是鏈格孢屬(8.41%)；從栽培甘草中分離得到151株內(nèi)生真菌，共歸屬為6個屬，鐮刀屬(62.91%)和土赤殼屬(12.58%)為優(yōu)勢菌屬，其次是青霉屬(7.95%)；綜合本次實驗結(jié)果，鐮刀屬真菌是甘草內(nèi)生真菌的優(yōu)勢菌屬(62.74%)，其次是曲霉屬(10.14%)；螺旋聚孢霉屬(0.27%)、背芽突霉屬(1.37%)、分子孢子菌屬(1.37%)和Dactylonectria屬(3.01%)內(nèi)生真菌均為稀有菌屬，結(jié)果見表3、圖4。

表3 野生和栽培生境甘草內(nèi)生真菌的相對頻率和多樣性指數(shù)

圖4 野生和栽培生境甘草不同屬內(nèi)生真菌的比例

從野生生境甘草分離的特有菌株有交鏈孢霉、枝狀枝孢菌、粉紅粘帚菌、串珠鐮刀菌、Fusariumfalciforme、Cadophorafastigiata等11種真菌；IR用于衡量2種不同生境甘草內(nèi)生真菌的豐富度和每個組織塊受多重侵染的頻率，2種生境甘草內(nèi)生真菌的分離率為97.27%(野生)和68.64%(栽培)；H用于比較2種不同生境甘草內(nèi)生真菌的物種多樣性程度，野生生境甘草內(nèi)生真菌的H是栽培甘草的1.42倍；CS可以比較2種生境甘草內(nèi)生真菌種類的相似程度，2種生境甘草內(nèi)生真菌的CS為77.55%，表明野生生境甘草內(nèi)生真菌的群落豐富度和多樣性高于栽培甘草。

4 討論

本研究從2種不同生境的烏拉爾甘草中共分離得到365株內(nèi)生真菌，歸屬為4綱5目6科9屬30種。在甘草中首次分離得到土赤殼屬真菌，此外還分離出11株野生生境甘草特有的內(nèi)生真菌，極大地豐富了甘草內(nèi)生真菌的種類。

比較不同屬內(nèi)生真菌的分離率可以確定優(yōu)勢菌屬。鄧毅等[43]從甘肅野生烏拉爾甘草中分離得到7株內(nèi)生真菌，優(yōu)勢菌屬為青霉菌屬和曲霉屬；從栽培甘草中分離得到6株內(nèi)生真菌，優(yōu)勢菌屬為青霉菌屬。楊明俊等[44]從烏拉爾甘草中分離得到36株內(nèi)生真菌，歸屬為7個屬，優(yōu)勢菌屬為木霉屬Trichoderma。吳桐等[45]從烏拉爾甘草中分離得到46株內(nèi)生真菌，優(yōu)勢菌屬為鐮刀屬。本實驗從野生和栽培生境的甘草中各取220個組織塊，共計分離365株內(nèi)生真菌，結(jié)果表明，甘草內(nèi)生真菌的優(yōu)勢菌屬為鐮刀屬。鐮刀屬真菌是主要的植物病原屬，也是植物內(nèi)生真菌的常見菌屬[46]。與前人相比，本研究用于分離內(nèi)生真菌的甘草組織塊數(shù)量較多，分離鑒定的內(nèi)生真菌數(shù)量較多，確定優(yōu)勢菌屬更具代表性。

藥用植物內(nèi)生真菌具有地域分布的差異性，與其他區(qū)域的同種植物相比，同一區(qū)域植物微生物種類的相似度更高，這是經(jīng)過長期的自然選擇形成的鮮明的微生態(tài)地域特征[47]。本研究發(fā)現(xiàn)野生生境甘草內(nèi)生真菌的豐富度和多樣性高于栽培生境甘草。從野生生境甘草中分離出11種特有菌株，該現(xiàn)象與2種甘草的生境差異密切相關。野生生境甘草采自內(nèi)蒙古鄂爾多斯市杭錦旗，是甘草的傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)，而栽培甘草種植于北京中醫(yī)藥大學望京藥園，非道地產(chǎn)區(qū)。2種生境的氣候類型、土壤類型、物種豐富度均差異較大。杭錦旗屬中溫帶半干旱高原大陸性氣候，光照充足、降水量小、蒸發(fā)量大、土壤微生物種類豐富、野外環(huán)境變化較大。北京屬于溫帶季風性氣候，植物園生長環(huán)境條件單一，土壤微生物的豐富度低于野外環(huán)境。因此，野生生境甘草在生長過程中面臨更多生物或非生物脅迫，被不同種類微生物侵染的概率大，從而使分離的內(nèi)生真菌種類豐富。

藥用植物內(nèi)生微生物以不同的方式直接或間接影響藥材的生長、性狀、代謝、化學成分等。目前，已檢測到某些內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生3-吲哚乙酸等生長激素，促進藥用植物的生長，因此藥用植物內(nèi)生真菌對藥材品質(zhì)及效用產(chǎn)生一定的影響[47]。有研究報道，野生甘草與栽培甘草的形態(tài)和化學成分存在一定的差異[48]，該差異可能與兩者內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)相關。因此，研究野生和栽培生境甘草內(nèi)生真菌的種類和多樣性差異，可以為提高栽培甘草的品質(zhì)奠定基礎。

不同植物內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物具有特異性，可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物。Zhang等[42]從蛇足石杉HuperziaserrataTrev.葉片中分離到1株能產(chǎn)生石杉堿甲的內(nèi)生真菌LF70，通過形態(tài)和rDNA ITS序列比對，鑒定為枝狀枝孢菌Cladosporiumcladosporioides。從紅豆杉樹皮中分離到同種菌株MD2，在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基生長時可以產(chǎn)生紫杉醇[49]。枝孢屬真菌包括30多種，枝狀枝孢菌是最常見的種類之一，能夠產(chǎn)生枝孢菌素(cladosporin)、大黃素(emodin)和其他毒性較小的物質(zhì)[50]。本研究從野生生境甘草中也分離出枝狀枝孢菌，命名為Y4，未從栽培生境甘草中分離到同種菌株，這為篩選能夠合成甘草次生代謝產(chǎn)物的菌株提供豐富的內(nèi)生真菌資源。

綜合以上結(jié)果，本研究通過分離、鑒定、分析和比較365株野生和栽培生境的甘草內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)野生生境甘草內(nèi)生真菌具有更高的豐富度和多樣性，為進一步研究內(nèi)生真菌對藥材質(zhì)量的影響提供新的思路，也為藥用植物內(nèi)生微生物的資源利用和開發(fā)提供參考。