王靈艷，戴亞平，薛 潔,2，俞春娜,2，王慧中,2，展曉日,2

(1. 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州311121； 2. 浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311121)

苦蘵PhysalisangulataL.為茄科酸漿屬植物，是一種民間常用藥用植物，其根、莖、葉、帶果實(shí)的宿萼等均可入藥，主要用于瘧疾、哮喘、咽炎、前列腺炎、慢性乙肝、消化和腸道疾病的治療[1].現(xiàn)代研究表明苦蘵中主要化學(xué)成分為甾體類(lèi)化合物，包括酸漿苦味素類(lèi)(physalins)和睡茄內(nèi)酯類(lèi)(withanolides)等，該類(lèi)化合物具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛等藥理作用[2-6]，是苦蘵的主要有效成分.目前苦蘵相關(guān)研究主要集中在化學(xué)成分分離及藥理活性研究方面，質(zhì)量控制研究相對(duì)較少，但通過(guò)前期研究我們發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源苦蘵藥材質(zhì)量差異較大，為了保障苦蘵在臨床上的用藥安全、有效，進(jìn)行苦蘵質(zhì)量控制研究是十分必要的.本研究針對(duì)苦蘵中2個(gè)主要的酸漿苦味素類(lèi)成分physalin H和physalin D，采用液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)其進(jìn)行定量研究，建立了苦蘵中physalin H和physalin D的質(zhì)量控制方法，為進(jìn)一步制定和完善苦蘵藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效控制苦蘵的質(zhì)量提供了依據(jù).

1 儀器與試藥

美國(guó)Waters 公司ACQUITY UPLC液相色譜儀；美國(guó)AB/SCIEX 公司ABI 4000Qtrap質(zhì)譜儀.

physalin D對(duì)照品(純度>98%)由本實(shí)驗(yàn)室制備，physalin H對(duì)照品(純度>98%)為浙江大學(xué)馬忠俊教授課題組提供；甲酸(質(zhì)譜級(jí)，德國(guó) sigma 公司)，乙腈(色譜級(jí)，德國(guó)Merk公司)，水為超純水(Millipore Milli-Q系統(tǒng))，其他試劑均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司).

14批苦蘵帶宿萼果實(shí)采自不同地區(qū)，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室馮尚國(guó)副教授鑒定為茄科Solanaceae酸漿屬Physalis植物苦蘵的帶宿萼果實(shí)，取其宿萼，低溫干燥并粉碎，過(guò)40目篩，密封備用.

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters Acquity BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相A為水(含0.1%甲酸)，流動(dòng)相B為乙腈(含0.1%甲酸)，梯度洗脫程序見(jiàn)表1；柱溫35 ℃；流速0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量1 μL.

表1 梯度洗脫程序

2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；檢測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)模式，采用正離子模式；源噴射電壓：5 500 V；源溫度(TEM)：100 ℃；簾氣(CUR)：1.38×105Pa；霧化氣(gas1)：3.45×105Pa；加熱氣(gas2)：3.79×105Pa，均為氮?dú)?被測(cè)成分與內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)離子對(duì)，解簇電壓(DP)和碰撞電壓(CE)見(jiàn)表2，EP：10 V，CXP：10 V.

表2 質(zhì)譜條件

在上述條件下檢測(cè)得到內(nèi)標(biāo)溶液，physalin H、physalin D對(duì)照品溶液和樣品溶液的MRM圖，見(jiàn)圖1.

A：內(nèi)標(biāo)溶液；B：physalin H對(duì)照品溶液；C：physalin D對(duì)照品溶液；D、E、F：樣品溶液.

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備

取physalin H適量，精密稱(chēng)定，置于容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得10 mg·mL-1的physalin H對(duì)照品儲(chǔ)備溶液.

取physalin D適量，精密稱(chēng)定，置于容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得10 mg·mL-1的physalin D對(duì)照品儲(chǔ)備溶液.

2.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備

取異嗪皮啶適量，精密稱(chēng)定，置于容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得1 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液.

2.3.3 樣品溶液的制備

取苦蘵樣品粉末(40目)0.025 g，精密稱(chēng)定，置于1.5 mL離心管中，分別精密加入800 μL甲醇、200 μL內(nèi)標(biāo)溶液，超聲提取30 min，離心取上清液，0.22 μm濾膜過(guò)濾，即得.

2.4 定量限和檢測(cè)限

定量限：信噪比S/N=10時(shí)樣品的量作為定量限，該實(shí)驗(yàn)中定量限5 ng·mL-1.

檢測(cè)限：信噪比S/N=3時(shí)樣品的量作為檢測(cè)限，該實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)限1 ng·mL-1.

2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，分別制成含physalin H和physalin D 5、10、50、100、500、1 000、5 000、10 000 ng·mL-1的溶液，按“2.1色譜條件”和“2.2質(zhì)譜條件”進(jìn)樣測(cè)定.以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到physalin H和physalin D的回歸方程分別為

Y=146.48X+3 843.7，r=0.999 7；Y=57.839X+2 061.1，r=0.999 5.

說(shuō)明physalin H和physalin D在濃度5～10 000 ng·mL-1范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系良好.

2.6 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取一定量的physalin H和physalin D的對(duì)照品溶液，將其配制成濃度為5 ng·mL-1混合對(duì)照品溶液，按“2.1色譜條件”和“2.2質(zhì)譜條件”重復(fù)進(jìn)樣5次.physalin H和physalin D峰面積的RSD值分別為4.58%和2.16%，說(shuō)明該儀器精密度良好.

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取某一產(chǎn)地的苦蘵樣品，按“2.3.3”方法制備樣品溶液，在4 ℃下放置0、2、4、6、8、24 h，按“2.1色譜條件”和“2.2質(zhì)譜條件”進(jìn)樣.physalin H和physalin D峰面積的RSD值分別為3.94%和2.79%，說(shuō)明苦蘵樣品溶液4 ℃放置24 h穩(wěn)定.

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一產(chǎn)地苦蘵藥材5份，按“2.3.3”方法制備樣品溶液，按“2.1色譜條件”和“2.2質(zhì)譜條件”進(jìn)樣.physalin H和physalin D含量的RSD值分別為2.63%和2.08%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好.

2.9 加樣回收試驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一產(chǎn)地的苦蘵樣品0.025 g，共9份，精密加入對(duì)照品適量，按“2.3.3”方法制備樣品溶液，按“2.1色譜條件”和“2.2質(zhì)譜條件”進(jìn)樣，測(cè)定，計(jì)算回收率.physalin H和physalin D的平均回收率分別為71.1%、71.0%，RSD值分別為1.36%、1.47%.說(shuō)明加樣回收率符合要求.

2.10 不同產(chǎn)地苦蘵中physalin H和physalin D的含量測(cè)定

取14個(gè)不同產(chǎn)地的苦蘵藥材，按“2.3.3”方法制備樣品溶液，按“2.1色譜條件”和“2.2質(zhì)譜條件”進(jìn)樣，分別測(cè)定physalin H、physalin D的含量.結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 不同產(chǎn)地苦蘵宿萼中physalin H和physalin D含量測(cè)定

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

分別比較了不同型號(hào)的色譜柱Waters Acquity BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)、Thermo Hypersil BDS C18(150 mm×2.1 mm，1.9 μm)和 Agilent Zorbax SB C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，結(jié)果顯示：Waters Acquity BEH C18色譜柱對(duì)于分析物的分離效果比較理想.

3.2 流動(dòng)相的選擇

以水-乙腈為流動(dòng)相體系，由于physalin H和physalin D均含有羥基，pH值對(duì)其影響較大，通過(guò)調(diào)節(jié)pH值可獲得較好的峰形，因此在流動(dòng)相中加入適量甲酸可以提高響應(yīng)、改善峰形.考察了流動(dòng)相中甲酸體積分?jǐn)?shù)分別為0、0.05%、0.1%對(duì)于化合物響應(yīng)及峰形的影響，結(jié)果表明甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.1%時(shí)色譜峰的響應(yīng)和峰形均較好，因此選擇以水(0.1%甲酸)-乙腈(0.1%甲酸)為流動(dòng)相.

3.3 結(jié)果分析

本研究建立的UPLC-MS/MS法，可同時(shí)準(zhǔn)確地對(duì)苦蘵中physalin H和physalin D進(jìn)行含量測(cè)定.但是不同來(lái)源苦蘵宿萼中physalin H和physalin D的含量差異較大，這種差異的存在可能是因?yàn)椴煌赜颦h(huán)境引起的化學(xué)成分的天然變異，它對(duì)苦蘵療效的影響需要進(jìn)一步研究，因此不能僅采用指標(biāo)性成分含量測(cè)定作為評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量好壞的標(biāo)準(zhǔn)，后續(xù)可以結(jié)合化學(xué)指紋圖譜法，對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行全面綜合的評(píng)價(jià)，以保證苦蘵應(yīng)用的安全、有效.