林秋雨，陳志偉，王園朝

(杭州師范大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院，浙江 杭州 311121)

甲醛是生物體正常代謝過程中自然產(chǎn)生的物質(zhì)，空氣、天然食品、加工食品特別是干制食品和冷凍食品中的防腐劑都含有甲醛[1-2].例如，香菇在正常發(fā)育過程中涉及將精氨酸轉(zhuǎn)化為蛋氨酸[3]的反應(yīng)，該反應(yīng)過程中產(chǎn)生的甲醛高達(dá)40～380 mg/kg[4]．微量的甲醛不會(huì)危害到人類健康，但當(dāng)人體攝入大量的甲醛時(shí)，可能會(huì)引起嘔吐、昏迷，甚至死亡．因此，甲醛早已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)列為第一類“致癌物質(zhì)”．由此說明食品中甲醛的控制與測定十分重要．

目前，食品中甲醛的檢測方法主要采用分光光度法和液相色譜法[5]．分光光度法是通過將甲醛與某種顯色試劑反應(yīng)生成一種有色化合物產(chǎn)物，在特定波長測定該產(chǎn)物的吸光度從而獲得甲醛的質(zhì)量濃度，其中最常見的分光光度法有乙酰丙酮法[6]、AHMT法[7]、鹽酸苯肼法[8]和間苯三酚法[9]．王燕[6]優(yōu)化了水發(fā)食品中甲醛的檢測條件，利用乙酰丙酮法對(duì)水發(fā)食品中的甲醛進(jìn)行定量測定；陳永鋒等[7]利用AHMT分光光度法測定生活飲用水的甲醛，水中甲醛的檢出限為 0.05 mg/L；李敏等[8]探討了不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)顯色的影響，并采用鹽酸苯肼分光光度法對(duì)腐竹中甲醛殘留量進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明，其方法檢出限為0.001 μg/mL；羅悅[9]研究了用間苯三酚定量測定甲醛的方法，該方法可應(yīng)用于水發(fā)食品、環(huán)境空氣等樣品中甲醛的快速定量．液相色譜法需先將甲醛衍生化以便紫外檢測，再經(jīng)色譜分離后得到相應(yīng)的色譜峰，通過峰面積進(jìn)行定量分析[10]．如Netto等[11]利用甲醛與2,4-二硝基苯肼的衍生化反應(yīng)，建立了一種測定牛奶中甲醛的高效液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)，檢出限為20.0 μg/L．以上兩種常見的甲醛分析方法均存在分析速度慢、靈敏度低等問題．

近十幾年來，常壓電離質(zhì)譜技術(shù)得到了迅速發(fā)展，是一種開放環(huán)境中對(duì)樣品直接進(jìn)行電離分析的質(zhì)譜新技術(shù)，具備高靈敏度、高效率和高選擇性等優(yōu)點(diǎn)[12]．其中，紙噴霧質(zhì)譜法[13-14]不但具有常壓電離質(zhì)譜技術(shù)的普遍優(yōu)點(diǎn)，而且簡化了操作步驟，降低了分析成本，擴(kuò)大了質(zhì)譜分析的應(yīng)用范圍．因此，紙噴霧質(zhì)譜法被廣泛地應(yīng)用于生物[15-16]、藥物[17]和環(huán)境分析[18]等方面．由于其獨(dú)特的技術(shù)特點(diǎn)，紙噴霧質(zhì)譜法也被認(rèn)為是高通量質(zhì)譜分析[19]的理想選擇，它可以通過對(duì)噴霧進(jìn)樣裝置進(jìn)行簡單的改造，進(jìn)一步提高儀器對(duì)樣品的分析能力，使其適用于批量分析．如Shen等[20]設(shè)計(jì)了一種新的高通量裝置，利用紙噴霧質(zhì)譜法應(yīng)用于牛血液樣本中蘇尼替尼和尼古丁這兩個(gè)組分的檢測，方法的檢測速度達(dá)到了7 s/樣品，大大提高了分析效率．

質(zhì)譜法中食品的前處理方法主要有超聲法[5]、蒸餾法、浸泡法和蛋白沉淀法．其中超聲法是一種提取效率較高，操作較簡單的前處理方法．以超聲法作為樣品的前處理方法，選擇丹磺酰肼為衍生化試劑，標(biāo)準(zhǔn)丹酰胺溶液為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，設(shè)計(jì)并應(yīng)用了一套簡便的多樣品噴霧進(jìn)樣裝置，建立了一種批量測定食品中微量甲醛殘留的高通量反應(yīng)紙噴霧質(zhì)譜法，對(duì)10種常見蔬菜水果食品中的甲醛進(jìn)行了快速檢測．該方法具有高效率、高靈敏度和高選擇性的檢測特點(diǎn)，為食品中甲醛的批量檢測提供了一種新的途徑．

1 材料和方法

1.1 主要儀器與材料

軌道離子阱質(zhì)譜儀(LTQ-Orbitrap XL ETD型，美國Thermo公司)；電子天平(BS124S型，德國賽多利斯公司)；超純水儀(Milli-Q型，美國Millipore公司)；攪拌機(jī)(BL25B31型，中國佛山市美的集團(tuán)有限公司)；超聲波清洗器(Q-250型，中國昆山超聲波儀器有限公司)；高速離心機(jī)(TGL-16型，中國金壇榮華儀器制造有限公司)．

丹磺酰肼、2,4 -二硝基苯肼、苯肼、2,4,6-三氯苯肼、吉拉德T試劑、丹酰胺均購自上海百靈威化學(xué)；甲醛(9.6 mg/mL)購自阿拉丁，用超純水配成標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 mg/mL)；冰醋酸購自國藥化學(xué)試劑有限公司；定性快速濾紙由杭州雙圈濾紙有限公司提供；所有蔬菜水果樣品均從當(dāng)?shù)厥袌鲭S機(jī)采購．

1.2 儀器工作條件

軌道離子阱質(zhì)譜儀的工作條件會(huì)影響最終檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度與精密度．優(yōu)化后的儀器工作條件如表1所示．該儀器控制均通過Xcalibur軟件執(zhí)行．

表1 軌道離子阱質(zhì)譜儀的工作條件

1.3 樣品前處理

食品樣品經(jīng)打碎研磨后，準(zhǔn)確稱取10.000 0 g倒入100 mL燒杯中，再加入50 mL超純水．用超聲波清洗器超聲處理30 min后，將燒杯中的溶液轉(zhuǎn)入離心試管中，于高速離心機(jī)上以12 000 r/min離心15 min，收集上層清液于50 mL離心管中，備用．

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

濾紙被切割成11個(gè)等腰三角形組成的陣列，其尖端角度均為30°，底邊長度均為10 mm，附在一塊長為15 cm的玻璃板上．用刀切割底部的矩形部分，使每個(gè)三角形濾紙均不相連．玻璃板被安放于升降臺(tái)上，根據(jù)圖1所示，通過升降臺(tái)的高度調(diào)整，控制玻璃板上的第一個(gè)三角形濾紙尖端和質(zhì)譜儀入口之間的距離為5 mm．使用一臺(tái)鐵架臺(tái)固定用于通電的銅條，調(diào)整鐵架臺(tái)的高度，使銅條緊貼在三角形濾紙的后端．用移液槍將10 μL含質(zhì)量濃度為500 μg/L的丹酰胺(內(nèi)標(biāo))的樣品溶液滴加在濾紙上．干燥1 min后，滴加20 μL噴霧溶劑(由質(zhì)量濃度為20 mg/L的丹磺酰肼和體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸組成的乙腈溶液)進(jìn)行在線衍生化反應(yīng)．接著，在銅條末端施加+4.0 kV的電壓，產(chǎn)生噴霧進(jìn)樣，質(zhì)譜儀在正離子模式下檢測并記錄相應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)．完成第一次樣品溶液的測定后，平移玻璃板，使下一個(gè)三角濾紙尖端距質(zhì)譜儀入口5 mm處，進(jìn)行第二次樣品溶液的檢測(與第一個(gè)樣品步驟相同)，其他系列樣品依次檢測．

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生劑種類的選擇

衍生劑種類是影響衍生產(chǎn)物信號(hào)強(qiáng)度的重要因素之一．因此，選擇了丹磺酰肼、2,4-二硝基苯肼、苯肼、2,4,6-三氯苯肼、吉拉德T等作為衍生化試劑，分別研究了5種衍生化試劑與甲醛溶液的衍生化反應(yīng)，對(duì)產(chǎn)生的衍生產(chǎn)物信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行比較，結(jié)果如圖2所示．發(fā)現(xiàn)丹磺酰肼作為衍生劑時(shí)，衍生產(chǎn)物——腙的信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他衍生產(chǎn)物．

丹磺酰肼與甲醛的衍生化反應(yīng)如圖3所示．在正離子模式下以丹磺酰肼為衍生劑進(jìn)行反應(yīng)紙噴霧質(zhì)譜分析得到的質(zhì)譜圖(圖4)和采用碰撞誘導(dǎo)解離(CID)得到的甲醛與丹磺酰肼的衍生產(chǎn)物——腙的MS/MS譜圖(圖5)，均驗(yàn)證了這個(gè)反應(yīng)在紙噴霧質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)過程中能夠正常進(jìn)行．

圖3 丹磺酰肼與甲醛的反應(yīng)式

圖4 在全掃描模式下以丹磺酰肼為衍生劑進(jìn)行紙噴霧質(zhì)譜分析得到的質(zhì)譜圖

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為了檢測出有適當(dāng)強(qiáng)度和穩(wěn)定性的衍生產(chǎn)物腙(m/z278.095 8)的質(zhì)譜信號(hào)，研究利用單變量法優(yōu)化了紙噴霧質(zhì)譜法在正離子模式下的工作條件．實(shí)驗(yàn)在0.1～3.0 mg/L范圍內(nèi)對(duì)丹酰胺(內(nèi)標(biāo))的質(zhì)量濃度進(jìn)行了優(yōu)化．當(dāng)?shù)０返馁|(zhì)量濃度為0.5 mg/L時(shí)，質(zhì)子化的腙與質(zhì)子化的丹酰胺的峰面積比相對(duì)適中(圖6)，有利于定量分析．噴霧電壓的高低影響著濾紙的毛細(xì)作用．噴霧電壓越高，毛細(xì)作用越強(qiáng)，提高了目標(biāo)分析物的離子化效率．但過高的噴霧電壓會(huì)造成較強(qiáng)的電暈放電，從而影響了目標(biāo)分析物的信號(hào)檢測[21]．結(jié)果表明，+4.0 kV的噴霧電壓能產(chǎn)生最大的質(zhì)譜信號(hào)(圖7)．噴霧溶劑的酸度在衍生化反應(yīng)中起著重要的作用，適當(dāng)?shù)乃岫拳h(huán)境促進(jìn)了質(zhì)子化過程，使羰基更親電，有利于丹磺酰肼中-NH2的進(jìn)攻，從而加速了衍生化反應(yīng)的進(jìn)行[22]．由圖8可知，當(dāng)乙酸的體積分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)，質(zhì)子化的腙與質(zhì)子化的丹酰胺的峰面積比最高，質(zhì)譜數(shù)據(jù)最佳．

圖7 噴霧電壓對(duì)峰面積比的影響

圖8 乙酸在噴霧溶劑中的體積分?jǐn)?shù)對(duì)峰面積比的影響

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

將10 μL含質(zhì)量濃度為500 μg/L的丹酰胺(內(nèi)標(biāo))的不同質(zhì)量濃度甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液(3、5、10、50、100、150、200、250、300 μg/L)分別加載到三角形濾紙上，干燥后分別滴加20 μL噴霧溶劑(由質(zhì)量濃度為20 mg/L的丹磺酰肼和體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸組成的乙腈溶液)，然后向銅條施加+4.0 kV的噴霧電壓，每1 min檢測1種質(zhì)量濃度的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，在正離子模式下記錄質(zhì)譜數(shù)據(jù)．以甲醛的濃度為橫坐標(biāo)，質(zhì)子化的腙與質(zhì)子化的丹酰胺的峰面積比為縱坐標(biāo)，作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖9).由圖9可知，甲醛的質(zhì)量濃度在3～300 μg/L 范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系(R2=0.999 3)，方法檢出限(LOD)為1.0 μg/L．

圖9 高通量反應(yīng)紙噴霧質(zhì)譜法測定甲醛的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 樣品的定量分析及加標(biāo)實(shí)驗(yàn)

該高通量反應(yīng)紙噴霧質(zhì)譜法已成功應(yīng)用于10種蔬菜水果樣品中甲醛的定量分析．每種樣品提取液各取10 μL，用超純水稀釋20倍，再分別加入相同體積(200 μL)的質(zhì)量濃度為1 mg/L的丹酰胺作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)．在上述優(yōu)化儀器參數(shù)和實(shí)驗(yàn)條件下分別測定，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程計(jì)算樣品中的甲醛．為驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度，在每種樣品中分別按大、中、小3個(gè)級(jí)別量加入甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)．結(jié)果計(jì)算出的所有樣品加標(biāo)回收率在93.5%～117.9%范圍，測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10.5%(表2)．通過方法檢出限換算出樣品的檢出限為0.2 mg/kg．

表2 高通量反應(yīng)噴霧質(zhì)譜法測定食品中甲醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、回收率及精密度(n=3)

3 結(jié)論

以丹磺酰肼為衍生劑、丹酰胺為內(nèi)標(biāo)物、超聲法為樣品前處理方法，建立了一種新型的高通量反應(yīng)紙噴霧質(zhì)譜法，可快速批量檢測食品中微量甲醛．該方法已應(yīng)用于10種不同蔬菜水果中甲醛的檢測．與傳統(tǒng)的分光光度法和HPLC-UV法相比，該方法不涉及復(fù)雜的分離過程，大大節(jié)省了分析所需的時(shí)間，檢測靈敏度高、選擇性好、操作簡便，為快速大批量測定食品中甲醛提供了一種新的可選擇的方法．