江汶鈺，張明星，李 潔，張玄妮，李歡歡，謝 娟，徐學鋒*

（華南農(nóng)業(yè)大學 食品學院，廣東 廣州 510642）

豉香型白酒是嶺南地方性傳統(tǒng)產(chǎn)品之一，盛產(chǎn)于珠江三角洲地區(qū)，至今有近130年的生產(chǎn)歷史[1]，是具有南國特色的地方性產(chǎn)品，其產(chǎn)品酒精度低，具有“玉潔冰清，豉香獨特，醇和甘滑，余味爽凈”的獨特風味[2]。年出口量歷來可達萬t[3]。豉香型白酒生產(chǎn)工藝特點比較獨特，也是我國傳統(tǒng)蒸餾白酒中酒精含量最低的白酒品種，其中酒精度＜40%vol，白酒低度化成為當前白酒發(fā)展的重要趨勢[4-6]。

“曲為酒之魂”，酒曲優(yōu)劣與白酒酒體質量和產(chǎn)酒率密切相關。白酒的發(fā)酵過程是由多種微生物參與的復雜的生化反應的過程[7]。豉香型白酒采用大米為原料，以米飯、黃豆、餅泥、酒餅葉和餅丸所制成的酒餅作為糖化發(fā)酵劑，屬小曲酒。酒餅是熟料培菌，以米飯、黃豆為主要材料，還加入較大量的餅泥及餅葉等輔料，原材料粗糙，夾雜的雜質較多；而餅丸是生料培菌，以米粉為主要原料，加入少量的餅葉及藥材，因而酒餅密度比餅丸大。用大酒餅作為主要糖化發(fā)酵劑，采用邊糖化邊發(fā)酵的工藝，經(jīng)蒸餾、陳肉壇浸、勾調而成的，不直接或間接添加食用酒精及非自身發(fā)酵產(chǎn)生的呈色呈香呈味物質，具有豉香特點的白酒[8]。前人對豉香型白酒酒餅中的霉菌和酵母等微生物進行了初步的分離研究，發(fā)現(xiàn)酒餅中主要有酵母、霉菌、細菌和放線菌等各種微生物，但對細菌、放線菌在其中的作用并沒有做進一步的探討，也沒有對其中的酵母、霉菌進行系統(tǒng)全面的分類研究[9-12]。豉香型白酒一輪完整的發(fā)酵，采用原料一次加曲后的半固態(tài)雙邊發(fā)酵工藝，整個發(fā)酵過程歷時15～20 d，因此酒餅微生物及發(fā)酵過程發(fā)酵醪液中微生物的動態(tài)變化成為影響豉香型白酒風味及質量的重要因素。董士偉[13]以豉香型白酒發(fā)酵原料等為研究對象進行產(chǎn)酯酵母的篩選，得到一株有強產(chǎn)酯能力的酵母菌。吳雪梅[14-15]通過對餅丸的微生物種類、數(shù)量及主要理化指標進行為期一年的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)一年內餅丸中的霉菌總數(shù)較酒餅中的波動較大；對豉香型酒曲和發(fā)酵醪液的微生物組成、數(shù)量及主要理化指標進行初步分析，結果表明，從一級種到白酒醪液，其微生物種類及數(shù)量變化較大；由于培養(yǎng)條件不同，酒曲理化指標及酶活力也相差較遠。

本課題組通過聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chainreaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術結合系統(tǒng)發(fā)育同源研究豉香型白酒在生產(chǎn)過程中的酒丸、酒餅和發(fā)酵醪液中的微生物群落結構，分析豉香型白酒酒曲中微生物區(qū)系的構成及變化，對判斷和鑒定白酒生產(chǎn)中與特征風味物質相關的關鍵微生物、指導生產(chǎn)工藝改進具有重要的理論和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豉香型白酒生產(chǎn)用酒丸（0、1 d、2 d、3 d、4 d）、酒餅（0、1 d、10 d、22 d、33 d）和發(fā)酵醪液（0、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d）：均由廣東省九江酒廠提供。

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）Marker、PCR試劑、DNA提取試劑盒和感受態(tài)細胞：大連Takara公司；丙烯酰胺（分析純）、甲叉雙丙烯酰胺（分析純）、去離子甲酰胺（分析純）、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）：廣州捷瑞生物工程有限公司；尿素、氯化鈉、NaOH（均為分析純）：天津市福晨化學試劑廠；冰乙酸（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司；溴化十六烷基三甲銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SOD）：廣州威佳科技有限公司；Tris base（分析純）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）；北京普博欣生物科技有限公司；乙醇（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；氨芐青霉素（分析純）：美國Biosharp公司；甲醛（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；回收純化試劑盒：上海生物工程有限公司；Goldview：北京賽百盛基因技術有限公司；硝酸銀：廣東光華化學廠有限公司；蛋白酶K（40 U/mg）：百川開泰生物技術（北京）有限公司；RNase A：翌圣生物科技（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

PC 300PCR 儀：Eppendorf Master personal；Tanon EPS 100電泳儀：上海天能科技有限公司；TDL-5-A低速臺式大容量離心機：上海安亭科學儀器廠；ChemiDocXRS+凝膠成像系統(tǒng)、JY-TD331A型變性梯度電泳儀：美國Bio Rad公司；BIOBASE高速冷凍離心機：Eppendorf（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵原料樣本預處理

酒餅和酒丸樣品預處理[16]：稱取7 g樣品，用15 mL無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）懸浮，漩渦振蕩5 min，1 000 r/min離心5 min，取上清，沉淀用PBS緩沖液重復洗滌2～3次，離心后收集全部上清。10 000 r/min離心5 min，收集細胞沉淀。分別用PBS洗3次，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

醪液樣品預處理：將發(fā)酵醪液1 000 r/min離心5 min，去沉淀，取25 mL上清液于50 mL離心管，10 000 r/min離心5 min，收集細胞沉淀，用PBS洗滌2～3次，洗凈的菌體懸浮在1.5 mL PBS（pH 7.0）中，用槍吹打后振蕩均勻，轉入2 mL EP管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 微生物總DNA的提取純化

首先加入565 μL TE緩沖液（pH 8.0）重懸菌體，取40 μL 10%SDS和20 μL蛋白酶K（10 mg/mL），混合均勻，置于37 ℃反應1 h，再加入100 μL 5 mol/L NaCl，混勻，65 ℃2 min。將80 μLCTAB/NaCl裂解液混勻，65 ℃反應30 min，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1，V/V），12 000 r/min離心10 min。再加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1，V/V），混勻12 000 r/min離心5 min。然后取0.7倍體積異丙醇以沉淀DNA，12 000 r/min離心10 min，取500 μL體積分數(shù)70%乙醇洗滌，提取得到DNA加50 μL雙蒸水（ddH2O）溶解，在DNA粗提液中加2 μL RNase A，37 ℃反應1 h，-20 ℃保存。

1.3.3 PCR擴增

擴增的DNA片段為細菌的16S部分序列，擴增長度約230 bp。PCR引物采用16S rRNA細菌V3區(qū)通用引物[17]。引物序列為：R518-GC（CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCATTACCGCGGCTGCTGG）和F341（TACGGGAGGCAGCAG）。PCR擴增體系（50 μL）為：5 μL 10×buffer，0.25 μLTaq酶（5 U/μL），4 μL脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）Mixture，0.25 μL引物（40 μmol/L），2.5 μL DNA。Touch Down PCR擴增程序為94 ℃預變性4 min后進入20個循環(huán)，94 ℃、30 s；60 ℃、30 s（每循環(huán)一次后溫度降低0.5 ℃）；72 ℃、1 min；進入10個循環(huán)，94 ℃、30 s；50 ℃、30 s；72 ℃、1 min，最后72 ℃延伸10 min。

針對真菌18SrRNA基因進行相關真菌群落結構的解析，PCR擴增引物為GC-fung*[18]和NS1[19]。引物序列為：GC-fung*：CGCCCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCATTCCCCGTTACCCGTTG；NS1：GTAGTCATATGCTTGTCTC。PCR擴增體系（50μL）為：10×buffer 5 μL，Taq酶（5U/μL）0.25μL，4 μL dNTPs Mixture，0.25 μL引物（40 μmol/L），2.5 μL DNA。PCR擴增程序94 ℃預變性5 min后進入20個循環(huán)，94 ℃、45 s；50 ℃、45 s（每循環(huán)一次后溫度降低0.5 ℃）；72 ℃、1 min；接著進入10個循環(huán)，94 ℃、45 s；50 ℃、45 s；72 ℃、1 min，最后72 ℃延伸10 min。

1.3.4 DGGE分析

參考江汶鈺等[20]的方法，取5 μL PCR產(chǎn)物進行DGGE分析。采用變形梯度為30%～60%、濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠在1×TAE緩沖液中85 V，60 ℃電泳9 h，銀染法。

1.3.5 DGGE條帶的克隆測序及分析

擴增回收片段，試劑盒純化PCR產(chǎn)物，克隆并挑取克隆子，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。根據(jù)測序結果，利用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）在美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫進行同源序列搜索，以比較代表菌株與已知相應序列的相似程度。

1.3.6 軟件分析

將DGGE圖譜經(jīng)Quantity One V4.62軟件數(shù)字化分析后，對圖譜進行了Shannon-Wiener多樣性指數(shù)[21]分析；采用DNAMAN等軟件對細菌16S rRNA V3區(qū)和真菌PCR測序序列進行比對聚類分析，鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵原料中細菌群落結構分析

結合圖1、圖2和表1發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）（條帶4、6、15）、胚牙乳桿菌（Lactobacillus plantarum）（條帶28）和乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）（條帶7、10）在酒丸和酒餅兩個階段條帶均明顯存在，但在醪液發(fā)酵階段則開始急劇減弱；乳酸乳球菌（Lactococcus lactissubsp.Cremoris）（條帶8、9）和鹵代單胞菌（Halomonas arcis）（條帶2）僅存在0 d酒丸樣品中出現(xiàn)，金黃桿菌屬（Chryseobacteriumsp.）（條帶5）也僅出現(xiàn)在0 d酒丸和0 d酒餅中；發(fā)酵醪液多樣性指數(shù)隨發(fā)酵時間的增加，細菌種類先減少后增加，細菌總量（條帶數(shù)）分布趨于均勻。魏斯氏菌屬（Weissella）（條帶11、22）僅在酒丸0 d和醪液發(fā)酵后期出現(xiàn)，據(jù)報道此菌種在此之前只有在濃香型和芝麻香型酒中釀造微生物中檢測到，推測該菌種在酒類釀造過程中形成的某種特殊代謝產(chǎn)物可能造就了某些白酒不同的品質[22]。干酪乳桿菌（Lactobacillus panis）（條帶1）在三個階段的條帶均有出現(xiàn)，但處于較低水平，在醪液發(fā)酵后期略有增長；干酪乳桿菌（Lactobacillus pontis）（條帶18）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）（條帶19、20）胃腸乳桿菌（Lactobacillus gastricus）（條帶21）僅出現(xiàn)于發(fā)酵醪液階段，處于優(yōu)勢地位，且保持穩(wěn)定。彎曲乳酸桿菌（Lactobacillus crispatus）（條帶13、17、29）僅在醪液發(fā)酵期出現(xiàn)，且處于優(yōu)勢地位，并在14 d醪液種群數(shù)量增加；未培養(yǎng)的乳酸桿菌屬（UnculturedLactobacillussp.）（條帶14、25）僅存在于14 d發(fā)酵醪液出現(xiàn)。

圖1 細菌16S rRNA V3基因DGGE電泳圖（A）及泳道識別圖（B）Fig.1 Electrophoretic diagram (A) and lane identification map (B)DGGE bacterial 16S rRNA V3 gene

圖2 分離條帶基于16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of separated strips based on 16S rRNA

表1 細菌16S rRNA V3區(qū)基因的DGGE切膠條帶的測序結果分析Table 1 Analysis of sequencing results of DGGE cut tape of bacteria gene in 16S rRNA V3 region

由表2可知，酒丸多樣性指數(shù)隨著貯藏時間的增加，優(yōu)勢細菌種類有所下降，貯藏第4天細菌種類又有所上升；而酒餅隨著貯藏時間增加，微生物種類隨之減少，貯藏22 d后則保持穩(wěn)定；醪液中隨著發(fā)酵時間的延長，細菌多樣性有所減少。

表2 微生物的DGGE指紋圖譜多樣性指數(shù)Table 2 Diversity indexes of microorganisms DGGE fingerprint

結合表2和圖2，此次研究發(fā)現(xiàn)了許多尚未在豉香型白酒的研究中報道過的細菌菌屬，如鹵代單胞菌類（Halomonas），金黃桿菌屬（Chryseobacterium），假單胞菌屬（Pseudomonas），腸桿菌屬（Enterobacter），未培養(yǎng)的細菌（Uncultured bacterium）及多種乳桿菌屬（Lactobacillus），這些細菌的理化特性和在豉香型白酒生產(chǎn)過程中發(fā)揮的功能性作用有待于進一步深入研究。

2.2 發(fā)酵原料中真菌群落結構分析

由圖3 和表2可知，在白酒生產(chǎn)過程中各樣本的真核微生物種類和數(shù)量都發(fā)生了不同程度的變化，其中，三類樣本中0 d樣本均有較高的多樣性。DGGE圖譜顯示，酒餅微生物多樣性隨著貯藏時間的增加也隨之下降，而酒丸儲藏后期和發(fā)酵醪液后期真菌的檢出條帶數(shù)及豐度值卻有較大幅度的回升。

圖3 豉香型白酒真菌DGGE電泳圖（A）及泳道識別圖（B）Fig.3 Electrophoretic map (A) of fungal DGGE and lane identification map (B) of Chi-flavor Baijiu

由圖4和表3可知，存在于三個階段中且在整個酵母群落中處于優(yōu)勢地位的是乳酸菌（Kluyveromyces lactis）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、奧默柯達菌（Kodamaea ohmeri）三種酵母菌?？勰覐湍そ湍福⊿accharomycopsis fibuligera）在酒餅丸時期處于優(yōu)勢地位，特別是發(fā)酵初期，隨發(fā)酵時間的增加而逐漸減弱。它能夠表達生成淀粉液化酶和糖化酶，能夠產(chǎn)生淀粉分解酶類的子囊酵母菌之一，可提高出酒率及酒質，且可以產(chǎn)生甲羥戊酸促進其他微生物的生長[23-24]。乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）（條帶11）存在于三類樣品中，且處于優(yōu)勢地位，并隨發(fā)酵時間增加而逐漸減弱，是一種能夠以乳酸作為其唯一的碳源和能源的酵母，并能生產(chǎn)芳香族化合物，同時還可能會刺激乳酸菌的生長[25]。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（條帶4﹑5、10）和光滑假絲酵母（Candida glabrata）（條帶6、8）在酒丸和酒餅時期較為活躍，而在白酒發(fā)酵期則開始減弱，與我們通常的預期存在差異，原因可能與DGGE的呈現(xiàn)效果有關。熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）（條帶15）和奧默柯達菌（Kodamaea ohmeri）（條帶17）僅在酒餅階段出現(xiàn)，且較為活躍，在其他兩個階段并未出現(xiàn)。皮炎芽生菌（Endom-ycessp.）（條帶7）和印度毛黴菌Mucor indicus（條帶13）僅存在于0 d酒餅樣品中，而青霉亞曲霉（Aspergillus penicillioide）（條帶19）僅出現(xiàn)于0 d和33 d酒餅中。

圖4 分離條帶的18S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strains 18S rRNA

表3 真菌18S rRNA區(qū)基因的DGGE切膠條帶的測序結果分析Table 3 Sequencing results of DGGE bands of fungal 18S rRNA region genes

3 結論

利用PCR-DGGE技術研究酒丸、酒餅和發(fā)酵醪液的不同發(fā)酵期的細菌和真菌群落結構，其中細菌除乳桿菌屬（Lactobacillus）外，同時還檢測到了鹵代單胞菌（Halomonas）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、小球菌屬（Pediococcus）、融合魏斯氏乳酸菌（Weissella cibaria）、木質素溶解腸桿菌（Enterobacter lignolyticus）和未培養(yǎng)的細菌屬（uncultured bacterium）等不同種屬的細菌，這些類群在不同時期、不同類型的樣本中的呈現(xiàn)存在一定差異，或始終存在，或階段性出現(xiàn)，或數(shù)量不同等。而且多樣性指數(shù)顯示，隨著貯藏時間的增加，酒丸和發(fā)酵醪液中優(yōu)勢細菌種類有所下降，后期細菌種類又有所上升；酒餅則隨著貯藏時間增加，微生物種類隨之減少，貯藏22 d后則保持穩(wěn)定；在真菌群落結構及多樣性的分析中，除酵母外，其他菌有印度毛黴菌（Mucor indicus）、帚狀曲霉（Aspergillus penicillioide）、栗蕈寄生菌屬（Endomycessp.）等，各類群在不同時期、不同類型的樣本中的呈現(xiàn)同樣存在一定差異。其中酒丸和發(fā)酵醪液中微生物的多樣性隨著時間的增加，優(yōu)勢真菌種類有所下降，貯藏后期真菌種類又有所上升；酒餅隨著貯藏時間增加，微生物種類不斷減少，趨于穩(wěn)定。實驗檢測出多種未培養(yǎng)微生物，表明相較于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法，采用PCR-DGGE技術分析豉香型白酒的細菌菌落結構，結果更全面、更直觀，這也為進一步提高白酒質量提供有力的支撐。