余 茜，溫鼎聲，慧

廣東藥科大學臨床藥學院，廣東 廣州 510006

Veratrum viridAlt.和藜蘆Veratrum nigrumL.均為百合科（Liliaceae）藜蘆屬VeratrumL.植物。V.virid主要分布在北美，通過文獻檢索發(fā)現(xiàn)，目前尚無相關文獻報道；藜蘆別名為黑藜蘆、山蔥，多年生的草本植物，環(huán)境適應性強，在我國各地均有分布[1-2]；味苦、辛，性寒，有毒，歸肝、肺、胃經(jīng)。藜蘆入藥的歷史可上溯到《神農(nóng)本草經(jīng)》列“下品”，通常認為其有涌吐風痰、清熱解毒、殺蟲療瘡的功效，用于治療中風痰壅、喉痹、不通、癲癇等，外用治疥廯、禿瘡?！度珖胁菟巺R編》中記載其具有祛痰、催吐、殺蟲功能。甾體生物堿的基本骨架類型主要包括4 類：西藜蘆堿型（cevine type）、介藜蘆胺型（jervine type）、茄次堿型（solanidine type）和維藜蘆堿類（verazine type）[3-5]。這類生物堿具體光學活性和顯著的生理效應，如抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、增強心肌收縮力、降血壓等[6-9]。藜蘆屬植物的主要成分為甾體生物堿，總稱藜蘆堿[10-12]。本研究擬發(fā)現(xiàn)不同地理位置分布的2 種藜蘆屬植物化學成分的異同，為這2 種藜蘆屬植物的進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

在抗真菌活性指導下，對藜蘆屬植物V.virid甲醇提取部位進行了化學成分的研究，分離得到了5個甾體生物堿類化合物和5 個二苯乙烯苷類化合物，分別鑒定為 rubivirine-3-O-β-glucopyranoside（1）、veratrosine（2）、veratramine（3）、pseudojervine（ 4 ）、 rubivirine （ 5 ）、 resveratrol 3,4′-O,O′- di-β-D-glucopyranoside（6）、mulberroside A（7）、resveratrol 4′-O-β-D-glucopyranoside（8）、resveratrol 3-O-β-D-glucopyranoside（9）、oxyresveratrol-2-O- β-D-glucopyranoside（10）。其中化合物1 為新化合物，命名為virinidine；化合物5～10 為首次從該屬植物中分離得到?？拐婢囼灲Y(jié)果表明，這10 個化合物對真菌均不具有抑制活性，其半數(shù)抑制濃度（IC50）值均大于20 μg/mL。

同時，本課題采用“酸溶堿沉”的方法富集藜蘆甲醇提取物中的生物堿。對各個分離層進行抗真菌活性篩選，其中氯仿層對新生隱球菌Canidia neoformansATCC 90113 和克柔念珠菌C.krusei ATCC6258 都具有較強的抑制活性，IC50值均小于8 μg/mL。本課題選擇氯仿層為研究目標，對氯仿層進行系統(tǒng)的化學成分研究。從中分離得到了9 個甾體生物堿類化合物，分別鑒定為2、3、4、5、verussurinine（11）、veralosidine（12）、jervine（13）、γ-chaconine（14）、germidine（15）。其中化合物5和14 為首次從該屬植物中得到。采用紙片擴散法評價化合物的抑真菌活性，結(jié)果顯示化合物14 對新生隱球菌和克柔念珠菌都具有較好的抑制活性，IC50分別為4.1、19.8 μg/mL。并且在100 μmol/L 濃度下對4 株人腫瘤細胞都不具有抑制活性。

1 儀器與材料

Bruker Advance DPX-400 型超導核磁共振儀（德國Bruker 公司）；Perkin Elmer spectrum 100 FT-IR 紅外光譜儀（美國Perkin Elmer 公司）；Hewlett-Packard HP-8453 型紫外可見光光譜儀測定（美國Hewlett-Packard 公司）；柱色譜填料：正相硅膠（230～400 目，美國Baker 公司）；反相填充材料（RP18，40 μm，美國Baker 公司）；薄層色譜正相硅膠為鋁板F254（230～400 目，美國Baker 公司）；RP18F254S 反相薄層硅膠為玻璃片（德國Merck 公司）；顯色劑為碘化鉍鉀；MH 瓊脂平板（青島海博生物）；藥敏紙片（北京天壇生物制品所）；MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco 公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（日本Sanyo 公司）；多功能酶標儀（美國Thermo 公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；MTT（上海翌圣生物科技公司）；兩性霉素B（10 mg，批號1397-89-3）、阿霉素（10 mg，批號246-818-3），美國Sigma 公司。

藜蘆屬植物V.viridAlt.于美國加利福尼亞，藥材經(jīng)美國密西西比大學李興從教授鑒定，憑證標本（NP No.81927）存放在美國密西西比大學國家天然產(chǎn)物研究中心。藜蘆樣品于2017年4月購于安徽普仁中藥飲片有限公司，生產(chǎn)批號140422。藥材經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學劉守金教授鑒定分別為百合科藜蘆屬植物藜蘆V.nigrumL.，憑證標本（131579）存放在廣東藥科大學。

真菌菌株：白色念珠菌C.albicansATCC 90028）、光滑念珠菌C.glabrataATCC 90030、克柔念珠菌C.kruseiATCC 6258、煙曲霉菌Aspergillus fumigatusATCC 90906 和新生隱球菌C.neoformansATCC 90113，美國密西西比大學提供。

腫瘤細胞：人黑色素瘤SK-MEL 細胞、人口腔表皮樣癌KB 細胞、人乳腺癌BT-549 細胞、人卵巢癌SK-OV-3 細胞由美國密西西比大學提供。

2 提取與分離

藜蘆屬植物V.virid（500 g）用甲醇在室溫下浸漬提取3 次，每次使用5 L 甲醇提取12 h，合并提取液，在40 ℃的溫度下減壓濃縮成浸膏，得到甲醇提取部位。甲醇提取部位抑制新生隱球菌的IC50為1.5 μg/mL。將甲醇提取部位（4.0 g）通過HP-20 柱色譜分離，用甲醇-水（10∶0→0∶10）梯度洗脫，經(jīng)薄層檢測合并為6 個流分（Fr.A～F）。其中Fr.B（704 mg）經(jīng)反相硅膠柱色譜分離，甲醇-水（2∶8→10∶0）梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜檢測合并為6 個流分（Fr.2A～2F）。Fr.2C（175.9 mg）再經(jīng)反相硅膠柱色譜分離，用乙腈-水（1∶9→2∶8）梯度洗脫，得到化合物6（37.6 mg）和7（8.5 mg）。Fr.2D（56.5 mg）經(jīng)硅膠柱色譜分離，用氯仿-甲醇（5∶1→3∶1）梯度洗脫，得到化合物8（5 mg）。Fr.D（1.7 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，氯仿-甲醇（6∶1→4∶1）梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜檢測合并為4 個流分（Fr.3A～3D）。Fr.3B（432.7 mg）經(jīng)硅膠柱色譜分離，氯仿-甲醇梯度洗脫（5∶1→3∶1），得到化合物1（6.1 mg）、3（6.7 mg）、4（2.5 mg）、5（23.3 mg）。Fr.3C（332.6 mg）經(jīng)反相硅膠柱色譜分離，用甲醇-水（6∶4→10∶0）梯度洗脫，得到化合物2（20.8 mg）和9（29 mg）。Fr.3D（138.8 mg）經(jīng)反相硅膠柱色譜分離，用甲醇-水（6∶4→10∶0）梯度洗脫，得到化合物10（67.3 mg）。

藜蘆的干燥根莖465.8 g，粉碎，用甲醇在室溫下浸漬提取2 次，每次使用4.6 L 甲醇提取12 h，合并提取液，在40 ℃的溫度下減壓濃縮成浸膏，得到甲醇提取物45 g。甲醇的提取物加入5%的酒石酸溶解（酒石酸的用量112.5 g），濾過，濾液（酒石酸層）用乙醚脫脂3 次（乙醚、濾液比例為0.5∶1），合并乙醚，減壓回收，得乙醚層（3.1 g）。用50%的氨水調(diào)pH 10，用氯仿萃取3 次[氯仿-濾液（1∶1）]，合并氯仿層，減壓回收，得氯仿層（1.5 g）。濾渣用正丁醇萃取3 次[正丁醇-濾液（1∶1）]，合并正丁醇層，減壓回收，得正丁醇層（2.4 g）。甲醇提取物、乙醚層、氯仿層、正丁醇層分別測試抗真菌活性，結(jié)果顯示，氯仿層具有抑制新型隱球菌、克柔念珠菌和白色念珠菌的活性，IC50值分別小于8 μg/mL。本課題選擇氯仿層為研究目標，對氯仿層進行系統(tǒng)的化學成分分離，從中發(fā)現(xiàn)天然的抗菌活性化合物。將氯仿部位（1.5 g）通過反相柱色譜分離，乙腈-水（0∶100→100∶0）洗脫溶劑，經(jīng)薄層檢測合并為12 個流分（Fr.A′～L′）。其中流分Fr.B′和 Fr.C′抑制新生隱球菌的 IC50值均小于0.8 μg/mL。Fr.B′（30.4 mg）和Fr.C′（75.2 mg）合并經(jīng)硅膠柱色譜分離，氯仿-甲醇（98∶2→70∶30）梯度洗脫，經(jīng)薄層檢測合并為11 個流分（Fr.2A′～2K′），其中Fr.2J′為化合物3（7.4 mg）。Fr.2K′（200.5 mg）通過硅膠柱色譜分離，氯仿-甲醇（9∶1→8∶2）梯度洗脫，經(jīng)薄層檢測合并為7 個流分（Fr.3A′～3G′），其中流分Fr.3E′經(jīng)重結(jié)晶得到化合物5（5.2 mg）。Fr.I′（450.8 mg）與Fr.J′（447.7 mg）合并通過硅膠柱色譜分離，氯仿-甲醇（98∶2→7∶3）梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜檢測合并為10 個流分（Fr.4A′～4J′）。合并Fr.4D′（11.1 mg）、Fr.4E′（25.7 mg）、Fr.4F′（14.3 mg）、和Fr.4G′（24.4 mg）通過硅膠柱色譜分離（50 cm×1.5 cm，25.0 g），用氯仿-甲醇梯度洗脫（9∶1→6∶4），得到化合物12（2.8 mg）和13（3.4 mg）。Fr.2K′（548.3）通過硅膠柱色譜分離（60 cm×3 cm，50.0 g），用氯仿-甲醇（9∶1→6∶4）梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜檢測合并為7 個流分（Fr.5A′～5G′），合并Fr.5F′（21.2）、Fr.5G′（22.8）和Fr.5H′（137.0）通過硅膠柱色譜分離，氯仿-甲醇（98∶2→8∶2）梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜檢測合并為9 個流分（Fr.6A′～6N′）。其中流分Fr.6B′為化合物2（4 mg），F(xiàn)r.6F′經(jīng)重結(jié)晶得到化合物11（7.5 mg）和15（5.6 mg）。合并Fr.6K′（16.4 mg）和Fr.6L′（40.7 mg），通過硅膠柱色譜分離，氯仿-甲醇（9∶1→8∶2）梯度洗脫，得到化合物4（5.8 mg）和14（3.1 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末，碘化鉍鉀反應呈陽性，ESI-MS 顯示其準分子離子峰為m/z592 [M＋H]+，表明該化合物的相對分子質(zhì)量為591；結(jié)合其HR-ESI-MS 給出的 [M＋H]+峰m/z592.391 1（計算值 592.384 4），可以確定該化合物的分子式為C33H53NO8，不飽和度為8。250 (3.50)；3360, 1630, 1060 吸收顯示結(jié)構(gòu)中有羥基和雙健的存在。

化合物1 在1H-NMR（400 MHz, CD3OD）譜中顯示化合物有3 個甲基峰信號δH0.88 (d,J= 6.6 Hz), 0.98 (s) 和1.05 (d,J= 6.6 Hz)；4 個連氧質(zhì)子信號δH3.49 (dd,J= 4.3, 7.7 Hz), 3.51 (m), 3.67 (d,J= 10.0 Hz), 3.70 (d,J= 10.0 Hz)；1 個環(huán)內(nèi)雙鍵質(zhì)子信號δH5.31 (brs)。13C-NMR (100 MHz, CD3OD) 和DEPT 譜中顯示化合物1 共含有33 個碳，分別歸屬為3 個甲基碳、11 個亞甲基碳、16 個次甲基碳和3個季碳（表1）。在低磁場區(qū)域可以觀察到1 個雙鍵碳信號δC122.5 (C), 142.1 (CH)；1 個葡萄糖的碳信號δC102.4 (CH), 75.1 (CH), 78.0 (CH), 70.5 (CH), 77.8 (CH), 62.8 (CH2)；3 個連氧碳信號δC79.7 (CH), 71.8 (CH), 62.7 (CH2)；3 個連氮碳信號δC75.7 (CH), 61.7 (CH), 57.3 (CH2)；在高場可以觀察到3個甲基碳信號δC19.8 (CH3), 18.8 (CH3), 18.6 (CH3)。通過HSQC 譜觀察到δH4.39 (d,J= 7.8 Hz) 與δC102.4 存在相關，確定其為葡萄糖端基質(zhì)子信號。把化合物1 苷元部分1H-和13C-NMR 數(shù)據(jù)和已知化合物rubivirine 相比[13]，確定其苷元的結(jié)構(gòu)為rubivirine。

表1 化合物1 的1H-NMR 和13C-NMR 數(shù)據(jù) (400/100MHz, CD3OD)Table 1 1H-NMR and 13C-NMR data of compound 1 (400/100MHz, CD3OD)

從化合物 1 的平面結(jié)構(gòu)進一步通過1H-1H COSY 和HMBC 譜的解析得以確認。1H-1H COSY 譜中觀察到H-1/H-2/H3，H-6/H-7/H-8，H-11/H-12, H-14/H-15/H-16，H-17/H-20/H-22，H-23/H-24/H-25存在相關（圖1）。HMBC 譜中可以觀察到Me-19與C-5、C-10、C-1 存在相關；Me-21 與C-17、C-18存在相關；Me-27 與C-26、C-24、C-25 存在相關，這些相關峰證實了各甲基的連接位置；同時，HMBC譜中H-12 與C-9、C-11、C-13 存在相關，H-18 與C-13 存在相關，證實了化合物1 苷元部分的2 個羥基分別位于C-12 和C-18 上；此外，H-6 與C-5、C-7、C-8、C-10 存在相關表明雙鍵位于C-5、C-6 之間。

為了確定化合物1 糖基部分的結(jié)構(gòu)，取化合物2 mg 經(jīng)2 mol/L HCl 水解，糖部分與標準糖共薄層分析，確定所連接的糖為葡萄糖。對水解后的糖進行衍生化，氣相分析其衍生化產(chǎn)物，與標準糖β-D-葡萄糖的衍生化產(chǎn)物的保留時間進行比對，確定其為D-葡萄糖。在HMBC 譜（圖1）中，端基質(zhì)子（δ4.39）和苷元的C-3（δ79.7）有遠程相關，表明葡萄糖連在3 位。1H-NMR 中，糖的端基質(zhì)子的偶合常數(shù)為7.8 Hz，表明其相對構(gòu)型為β-葡萄糖基。

圖1 化合物1 的關鍵1H-1H COSY、HMBC、NOESY 相關信號Fig.1 Key 1H-1H COSY, HMBC and NOESY correlations for compound 1

化合物1 的相對構(gòu)型通過H-4 的自旋偶合裂分和NOESY 譜（圖1）來加以確定。H-4β (2.49, t,J= 10.5 HZ) 自旋出偶合裂分為三重峰，說明J3,4β≈J4α,4β，其中J4α,4β＝10.5 Hz 為同碳氫之間的偶合，因此，J3,4β＝10.5 Hz 為相鄰碳上的氫均處于直立鍵（Jax-ax）產(chǎn)生的偶合，可以推測出H-3 為α 構(gòu)型，C-3 的羥基為β 構(gòu)型。同時，在NOESY 譜中H-3 與H-4α 以及H-4β 與Me-19 相關，證實了Me-19 為β構(gòu)型。H-4α 與H-9、H-12 與H-9 和Me-21、H-22 與Me-21、H-22 與Me-27 的相關，證實了H-9、H-12、H-22、Me-21 和Me-27 為α 構(gòu)型，C-12 的羥基為β 構(gòu)型。綜合以上信息，化合物1 的結(jié)構(gòu)鑒定為rubivirine- 3-O-β-glucopyranoside。結(jié)構(gòu)見圖2。根據(jù)SciFinder Scholar 數(shù)據(jù)庫檢索，確定化合物1 為新化合物。

圖2 化合物1 的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of compound 1

化合物2：白色粉末；碘化鉍鉀反應呈陽性；ESI-MSm/z: 572 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:7.20 (1H, d,J=7.5 Hz, H-16), 7.11 (1H, d,J=7.5 Hz, H-15), 5.51 (1H, brd,J=4.0 Hz, H-6), 2.33 (3H, s, H-18), 1.43 (3H, d,J=7.0 Hz, H-21), 1.14 (3H, s, H-19), 0.94 (3H, d,J=6.5 Hz, H-27)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 146.0 (C-5), 145.1 (C-14), 144.1 (C-17), 138.8 (C-12), 134.4 (C-13), 126.9 (C-16), 123.5 (C-6), 122.0 (C-15), 102.9 (C-1′), 78.3 (C-3′), 77.3 (C-5′), 75.5 (C-2′), 70.2 (C-3), 69.6 (C-23), 69.4 (C-4′), 67.8 (C-22), 63.1 (C-6′), 59.0 (C-9), 53.1 (C-26), 43.6 (C-24), 42.9 (C-8), 39.7 (C-1), 39.2 (C-4), 36.4 (C-10), 31.9 (C-7, 25), 31.4 (C-20), 30.8 (C-11), 29.6 (C-2), 21.4 (C-21), 19.0 (C-19, 27), 16.6 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻對照基本一致[10]，故鑒定化合物2 為veratrosine。

化合物3：白色粉末；碘化鉍鉀反應呈陽性；ESI-MSm/z: 410 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:7.09 (1H, d,J=7.5 Hz, H-16), 7.05 (1H, d,J=7.5 Hz, H-15), 5.50 (1H, brd,J=4.0 Hz, H-6), 2.35 (3H, s, H-18), 1.45 (3H, d,J=7.0 Hz, H-21), 1.15 (3H, s, H-19), 0.97 (3H, d,J=6.5 Hz, H-27)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ:145.1 (C-17), 143.3 (C-14), 142.7 (C-5), 141.7 (C-12), 132.6 (C-13), 125.0 (C-16), 121.3 (C-6), 120.4 (C-15), 72.4 (C-3), 69.6 (C-23), 66.8 (C-22), 57.3 (C-9), 50.7 (C-26), 41.2 (C-24, 8), 41.1 (C-4), 37.8 (C-1, 10), 36.6 (C-20), 34.2 (C-25), 30.6 (C-7), 30.0 (C-11), 29.8 (C-2), 22.3 (C-21), 19.5 (C-19), 18.2 (C-27), 16.9 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻對照基本一致[11]，故鑒定化合物3 為veratramine。

化合物4：白色粉末；碘化鉍鉀反應呈陽性；ESI-MSm/z: 588 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:5.34 (1H, brd,J=6.5 Hz, H-6), 3.57 (1H, m, H-3), 3.16 (3H, s, H-23), 1.12 (3H, d,J=6.8 Hz, H-21), 1.05 (3H, s, H-19), 0.80 (3H, d,J=6.5 Hz, H-27)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ:205.5 (C-11), 146.0 (C-13), 142.1 (C-5), 132.3 (C-14), 121.2 (C-6), 100.9 (C-1′), 84.3 (C-17), 78.6 (C-5′), 76.7 (C-3′), 75.4 (C-23), 76.6 (C-2′), 72.4 (C-3), 70.2 (C-4′), 65.6 (C-22), 61.8 (C-9), 61.5 (C-6′), 53.3 (C-26), 43.2 (C-14), 41.1 (C-4), 40.0 (C-20), 38.6 (C-24), 38.2 (C-8), 37.6 (C-10), 36.0 (C-1), 31.2 (C-25), 31.0 (C-2), 30.9 (C-16), 30.2 (C-7), 30.2 (C-7), 23.6 (C-15), 18.6 (C-27), 18.2 (C-19), 12.9 (C-18), 10.2 (C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻對照基本一致[12]，故鑒定化合物4 為pseudojervine。

化合物5：白色粉末；碘化鉍鉀反應呈陽性；ESI-MSm/z: 430 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:5.31 (1H, brs, H-6), 3.70 (1H, d,J= 10.0 Hz, H-18a), 3.57 (1H, d,J= 10.0 Hz, H-18b), 3.51 (1H, m, H-3), 3.47 (1H, dd,J=7.7, 4.5 Hz, H-12), 1.05 (3H, d,J=6.5 Hz, H-27), 0.98 (3H, s, H-19), 0.87 (3H, d,J=6.6 Hz, H-21)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ:142.1 (C-5), 122.5 (C-6), 75.7 (C-22), 72.7 (C-3), 70.5 (C-12), 57.8 (C-17), 57.3 (C-4), 51.6 (C-26), 50.6 (C-9), 49.9 (C-14), 46.2 (C-13), 38.5 (C-1), 38.0 (C-10), 37.1 (C-20), 33.0 (C-24), 32.7 (C-25), 32.5 (C-11), 31.6 (C-8), 30.6 (C-7), 30.0 (C-2), 29.0 (C-23), 22.2 (C-15), 19.8 (C-19), 18.8 (C-27), 18.6 (C-21), 12.4 (C-21), 11.0 (C-18)。以上數(shù)據(jù)和文獻對照基本一致[13]，故鑒定化合物5 為rubivirine。

化合物6：白色粉末；ESI-MSm/z: 551 [M－H]?；1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 7.25 (2H, d,J=8.5 Hz, H-2′, 6′), 7.07 (2H, d,J=8.5 Hz, H-3′, 5′), 7.04 (1H, d,J=16.0 Hz, H-β), 6.91 (1H, d,J=16.0 Hz, H-α), 6.81 (1H, brs, H-2), 6.60 (1H, brs, H-6), 6.48 (1H, t,J=2.0 Hz, H-19)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 159.0 (C-3), 158.1 (C-5), 157.3 (C-4′), 139.7 (C-1), 131.7 (C-1′), 127.3 (C-2′, 6′), 128.1 (C-β), 126.8 (C-α), 116.5 (C-3′, 5′), 107.2 (C-6), 105.9 (C-4), 101.0 (C-1′′′), 100.7 (C-1′′), 76.7 (C-5′′, 5′′′), 76.5 (C-3′′, 3′′′), 73.5 (C-2′′, 2′′′), 70.0 (C-4′′, 4′′′), 61.1 (C-6′′, 6′′′)。將化合物的核磁數(shù)據(jù)與文獻報道的數(shù)據(jù)[14]進行對比，鑒定化合物6 為resveratrol 3,4′-O,O′-di-β-D-glucopyranoside。

化合物7：白色粉末；ESI-MSm/z: 567 [M－H]?；1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 7.43 (1H, d,J=8.5 Hz, H-6′), 7.31 (1H, d,J=16.0 Hz, H-β), 6.94 (1H, d,J= 16.0 Hz, H-α), 6.76 (1H, brs, H-2), 6.63 (1H, brs, H-6), 6.61 (1H, brs, H-3′), 6.58 (1H, dd,J=8.5, 2.4 Hz, H-5′), 6.45 (1H, t,J=2.0 Hz, H-4)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ:159.0 (C-3), 158.1 (C-5, 4′), 155.8 (C-2′), 141.0 (C-1), 127.0 (C-β), 126.2 (C-α), 123.6 (C-6′), 118.8 (C-1′), 108.0 (C-6), 106.8 (C-5′), 105.8 (C-4), 103.5 (C-3′), 102.6 (C-2), 100.9 (C-1′′′), 100.7 (C-1′′), 76.7 (C-5′′, 5′′′), 76.5 (C-3′′, 3′′′), 73.4 (C-2′, 2′′′), 69.9 (C-4′′, 4′′′), 61.1 (C-6′′, 6′′′)。將化合物的核磁數(shù)據(jù)與文獻報道的數(shù)據(jù)[15]進行對比，鑒定化合物7 為mulberroside A。

化合物8：白色粉末；ESI-MSm/z: 389 [M－H]?；1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 7.44 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-2′, 6′), 7.07 (2H, d,J=8.5 Hz, H-3′, 5′), 7.04 (1H, d,J=16.0 Hz, H-β), 6.91 (1H, d,J=16.0 Hz, H-α), 6.80 (1H, brs, H-2), 6.64 (1H, brs, H-6), 6.48 (1H, t,J=2.2 Hz, H-4)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 159.0 (C-3), 158.0 (C-5), 157.1 (C-4′), 139.5 (C-1′), 131.7 (C-1′), 128.0 (C-β), 127.4 (C-2′, 6′), 126.2 (C-α), 116.4 (C-3′, 5′), 107.2 (C-6), 106.0 (C-4), 103.0 (C-2), 100.7 (C-1′′), 76.7 (C-5′′), 76.5 (C-3′′), 73.5 (C-2′′), 70.0 (C-4′′), 61.1 (C-6′)。將化合物的核磁數(shù)據(jù)與文獻報道的數(shù)據(jù)[16]進行對比，鑒定化合物8 為resveratrol 4′-O-β-D-glucopyranoside。

化合物9：白色粉末；ESI-MSm/z: 389 [M－H]?；1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 7.35 (2H, d,J=8.5 Hz, H-2′, 6′), 7.01 (1H, d,J=16.0 Hz, H-β), 6.84 (1H, d,J=16 Hz, H-α), 6.78 (2H, d,J=8.5 Hz, H-3′, 5′), 6.76 (1H, brs, H-2), 6.63 (1H, brs, H-6), 6.46 (1H, t,J=2.2 Hz, H-4)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 160.0 (C-3), 158.1 (C-5), 157.0 (C-4′), 140.0 (C-1), 128.6 (C-1′), 127.5 (C-2′, 6′), 127.0 (C-β), 126.2 (C-α), 115.1 (C-3′, 5′), 107.0 (C-6), 105.7 (C-4), 102.7 (C-2), 100.9 (C-1′′), 76.7 (C-5′′), 76.6 (C-3′′), 73.5 (C-2′′), 69.9 (C-4′′), 61.1 (C-6′′)。將化合物的核磁數(shù)據(jù)與文獻報道的數(shù)據(jù)[14]進行對比，鑒定化合物9 為resveratrol 3-O-β-D- glucopyranoside。

化合物10：白色粉末；ESI-MSm/z: 405 [MH]?；1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 7.34 (2H, d,J=8.5 Hz, H-3′ 5′), 7.30 (1H, d,J=16.0 Hz, H-β), 6.87 (1H, d,J=16 Hz, H-α), 6.76 (1H, brs, H-2), 6.63 (1H, brs, H-6), 6.45 (1H, t,J=2.2 Hz, H-4), 6.32 (1H, d,J=6.0 Hz, H-6′)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 157.8 (C-4), 157.1 (4′), 140.9 (C-1), 127.4 (C-2′, 6′), 127.2 (C-β), 124.8 (C-6), 123.3 (C-α), 116.4 (C-3′, 5′), 107.1 (C-2, 5), 102.2 (C-4), 100.8 (C-1′′), 76.7 (C-5′′), 76.5 (C-3′′), 73.5 (C-2′′), 69.9 (C-4′′), 61.0 (C-6′′)。將化合物的核磁數(shù)據(jù)與文獻報道的數(shù)據(jù)[15]進行對比，鑒定化合物10 為oxyresveratrol-2-O-β-D-glucopyranoside。

化合物11：白色粉末；碘化鉍鉀反應呈陽性；ESI-MSm/z594 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:6.22 (1H, brs, H-4), 5.35 (1H, d,J=5.0 Hz, H-5), 4.97 (1H, brs, H-7a), 4.66 (1H, brd,J=4.0 Hz, H-3), 4.61 (1H, brd,J=5.0 Hz, H-7b), 4.50 (1H, s, H-14), 4.31 (1H, s, H-20), 4.29 (1H, dd,J=5.0, 3.0 Hz, H-3), 2.76 (1H, dd,J=10.0, 6.0 Hz, H-18), 1.72 (1H, m, H-22), 1.05 (3H, d,J=7.0 Hz, H-27), 0.97 (3H, s, H-19)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ:175.5 (C-1′), 105.5 (C-4), 93.1 (C-9), 81.5 (C-14), 74.5 (C-3), 72.5 (C-20), 70.7 (C-15), 69.3 (C-15), 69.1 (C-16), 61.8 (C-18), 62.0 (C-23), 47.6 (C-12), 46.7 (C-5), 45.1 (C-10), 45.0 (C-17), 41.5 (C-2′), 34.1 (C-11), 33.9 (C-13), 32.7 (C-1), 29.4 (C-24), 27.8 (C-6), 27.2 (C-25), 26.6 (C-3′), 20.6 (C-21), 19.6 (C-19), 18.8 (C-23), 17.7 (C-27), 16.5 (C-5′), 10.8 (C-4′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻對照基本一致[17]，鑒定化合物11 為verussurinine。

化合物12：白色粉末；碘化鉍鉀反應呈陽性；ESI-MSm/z: 472 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:5.34 (1H, brd,J=6.3 Hz, H-6), 4.90 (1H, m, H-16), 3.57 (1H, m, H-15), 3.30 (1H, m, H-3), 1.12 (3H, d,J=6.8 Hz, H-21), 1.08 (3H, s, H-19), 0.90 (3H, d,J=6.5 Hz, H-27), 0.82 (3H, s, H-18)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ:178.5 (C-22), 172.6 (COCH3), 143.0 (C-5), 123.5 (C-6), 81.5 (C-16), 75.4 (C-15), 72.4 (C-3), 60.6 (C-17), 58.1 (C-26), 56.3 (C-14), 50.3 (C-9), 48.2 (C-20), 44.1 (C-4), 42.0 (C-12), 38.6 (C-1), 38.2 (C-10), 33.6 (C-7), 33.0 (C-1), 32.8 (C-8), 31.0 (C-2), 30.9 (C-24), 30.2 (C-25), 30.1 (C-23), 23.6 (C-10), 22.1 (CH3CO), 20.6 (C-19), 20.4 (C-27), 18.6 (C-21), 16.2 (C-18)?以上數(shù)據(jù)和文獻對照基本一致[18]，鑒定化合物12 為veralosidine。

化合物13：白色粉末；碘化鉍鉀反應呈陽性；ESI-MSm/z: 426 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:5.54 (1H, brd,J=6.5 Hz, H-6), 3.57 (1H, m, H-3), 2.56 (3H, s, H-20), 1.42 (3H, d,J=6.8 Hz, H-21), 1.18 (3H, s, H-19), 0.90 (3H, d,J=6.5 Hz, H-27)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ:202.5 (C-11), 146.0 (C-13), 142.5 (C-5), 132.3 (C-14), 121.5 (C-6), 84.5 (C-17), 75.4 (C-23), 70.4 (C-3), 65.6 (C-22), 61.8 (C-9), 53.3 (C-26), 43.2 (C-14), 41.1 (C-4), 40.0 (C-20), 38.6 (C-24), 38.2 (C-8), 37.6 (C-10), 36.0 (C-1), 31.2 (C-25), 31.0 (C-2), 30.9 (C-16), 30.2 (C-7), 30.2 (C-7), 23.6 (C-15), 18.6 (C-27), 18.2 (C-19), 12.9 (C-18), 10.2 (C-21)?以上數(shù)據(jù)和文獻對照基本一致[19]，鑒定化合物13 為jervine。

化合物14：白色粉末；碘化鉍鉀反應呈陽性；ESI-MSm/z: 560 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:5.56 (1H, brd,J=5.0 Hz, H-6), 3.84 (1H, m, H-3), 1.11 (3H, d,J=6.5 Hz, H-21), 1.02 (3H, s, H-20), 0.95 (3H, d,J=6.5 Hz, H-27), 0.75 (3H, s, H-19)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ:140.5 (C-5), 121.5 (C-6), 101.1 (C-1′), 78.4 (C-5′), 78.1 (C-3), 77.8 (C-22), 76.4 (C-3′), 75.2 (C-2′), 73.7 (C-26), 70.4 (C-4′), 67.6 (C-16), 62.5 (C-16), 61.1 (C-6′), 60.0 (C-26) 56.4 (C-14), 55.6 (C-9), 42.5 (C-13), 39.6 (C-4), 39.5 (C-12), 37.4 (C-1), 37.0 (C-10), 36.5 (C-10), 32.1 (C-7), 31.8 (C-8), 31.8 (C-15), 31.6 (C-25), 31.4 (C-24), 29.3 (C-2), 26.9 (C-23), 21.9 (C-11), 18.6 (C-19), 18.2 (C-21), 16.9 (C-27), 16.5 (C-18)。以上數(shù)據(jù)和文獻對照基本一致[20]，鑒定化合物14 為γ-chaconine。

化合物15：白色粉末；碘化鉍鉀反應呈陽性；ESI-MSm/z: 636 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:6.22 (1H, brs, H-4), 5.35 (1H, d,J= 5.0 Hz, H-5), 4.97 (1H, brs, H-7a), 4.93 (1H, brd,J= 4.0 Hz, H-3), 4.61 (1H, brd,J= 5.0 Hz, H-7b), 4.50 (1H, s, H-14), 4.31 (1H, s, H-20), 4.29 (1H, dd,J= 5.0, 3 Hz, H-3), 2.76 (1H, dd,J=10.0, 6.0 Hz, H-18), 1.72 (1H, m, H-22), 1.05 (3H, d,J=7.0 Hz, H-27), 0.97 (3H, s, H-19)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ:175.5 (C-1′′), 170.9 (C-1′), 105.5 (C-4), 93.1 (C-9), 81.5 (C-14), 74.5 (C-3), 72.5 (C-20), 70.7 (C-15), 69.3 (C-15), 69.1 (C-16), 61.8 (C-18), 62.0 (C-23), 47.6 (C-12), 46.7 (C-5), 45.1 (C-10), 45.0 (C-17), 41.5 (C-2′′), 34.1 (C-11), 33.9 (C-13), 32.7 (C-1), 29.4 (C-24), 27.8 (C-6), 27.2 (C-25), 26.6 (C-3′′), 21.3 (C-2′), 20.6 (C-21), 19.6 (C-19), 18.8 (C-23), 17.7 (C-27), 16.5 (C-5′′), 10.8 (C-4′′)。以上數(shù)據(jù)和文獻對照基本一致[21]，鑒定化合物15 為germidine。

4 活性測試

4.1 化合物的抗真菌活性篩選

采用紙片擴散法（K-B 法）[22]評價15 個化合物的抗真菌活性。真菌菌株包括：白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、煙曲霉菌和新生隱球菌。紙片擴散法操作按照真菌藥敏試驗指南（CLSI）方法，化合物1～15 均溶于DMSO 中，使用浸泡的方法讓藥敏紙片含有一定濃度的待測化合物。將含有化合物的紙片分別貼在測試菌的瓊脂平板上，35 ℃孵育48 h。用游標卡尺測量藥敏紙片上抑菌圈的直徑，參考CLSI M60 標準判定結(jié)果。以兩性霉素B為陽性對照藥物，每個樣品平行測試3 次。抗真菌活性結(jié)果表明，化合物14 對新生隱球菌和克柔念珠菌都具有較好的抑制活性，IC50分別為4.1、19.8 μg/mL。陽性對照兩性霉素B 對新生隱球菌和克柔念珠菌的IC50分別為0.7、0.3 μg/mL。

4.2 抗真菌活性化合物的細胞毒活性測定

采用MTT 法[23]測定具有抗真菌活性化合物14的細胞毒活性。收集對數(shù)期的腫瘤細胞（SK-MEL細胞、KB 細胞、BT-549 細胞、SK-OV-3 細胞），37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h；加入不同濃度的含藥培養(yǎng)基，100 μL/孔，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。每孔加入20 μL 2.5 mg/mL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入100 μL DMSO。置于酶標儀檢測490 nm 為檢測波長的吸光值。以阿霉素為陽性對照藥物，每個樣品平行測試3 次。結(jié)果表明，化合物14 對這4 種腫瘤細胞在100 μmol/L 濃度下均無抑制活性。

5 討論

本研究以抗真菌活性為導向的從2 種藜蘆屬植物中尋找天然的抗真菌化合物。從V.virid和藜蘆的根及根莖的甲醇提取物中共分離鑒定了15 個化合物，其中有10 個甾體生物堿類化合物，5 個二苯乙烯苷類化合物?；衔? 為新化合物，化合物5～10、14 為首次從藜蘆屬植物中分離得到。對分離得到的15 個化合物進行抗真菌活性篩選，結(jié)果顯示化合物14 對新生隱球菌和克柔念珠菌具有較好的抑制活性，IC50分別為4.1、19.8 μg/mL。并且對4 株人的腫瘤細胞在100 μmol/L濃度下都不具有抑制活性。本研究為后期藜蘆屬植物在抗真菌活性物質(zhì)方面的研究與開發(fā)提供了一定的基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突