劉 慶 宋建剛 盧 蓉 李元霞

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院兒科一病區(qū)，陜西省延安市 716000，電子郵箱：happymuzi66@163.com)

7～10歲年齡段是兒童肥胖的高風(fēng)險(xiǎn)時(shí)期，食用油的高消耗以及高脂肉類膳食是兒童肥胖的高風(fēng)險(xiǎn)因素[1-3]。研究表明，高脂肪飲食會(huì)增加各種組織的氧化應(yīng)激，這可能會(huì)導(dǎo)致許多退化性疾病發(fā)生[4-5]，而補(bǔ)充抗氧化劑可以預(yù)防許多高脂肪飲食引起的疾病[6]。青錢柳具有抗氧化、降血壓、抗糖尿病等多種生物活性[7]，例如青錢柳的提取物及其多種衍生物可能具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力的功效[8-9]，青錢柳黃酮可降低大鼠血脂、血糖，并具有免疫調(diào)節(jié)的作用[10-11]。然而，青錢柳黃酮對兒童是否同樣具有以上作用仍不明確。本研究探討不同濃度的青錢柳黃酮對高脂合并低免疫力的幼年大鼠的血脂、葡萄糖、免疫平衡的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 青錢柳黃酮(含量:16.2%)購自湖南和然生物科技開發(fā)有限公司(批號：574-12-9)。環(huán)磷酰胺購自西安晨星植物科學(xué)技術(shù)有限公司(批號：180113-14)；總膽固醇檢測試劑盒(批號：MAK043)、三酰甘油檢測試劑盒(批號：TR0100)、LDL-C檢測試劑盒(批號：MAK045)和HDL-C檢測試劑盒(批號：MAK045)購自美國Sigma Diagnostics公司；血液葡萄糖檢測試劑盒(批號：00001869)購于DiaSys Diagnostic Systems GmbH；細(xì)胞裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號：C3702)；RPMI 1640完全培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司(批號：PM150110B)；四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號：C0009S)；兔抗鼠磷酸化核因子κB(phosphorylated nuclear factor κB,p-NF-κB) p65抗體(批號：ab76302)購于美國Abcam公司；戊巴比妥鈉(批號：57-33-0)購于美國Sigma公司；刀豆凝素(批號：11028-71-0)和二甲基亞砜(批號：67-68-5)均購于美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 2周齡的SD雄性大鼠60只，購于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(陜)2019-001]。大鼠在22℃的恒定室溫下飼養(yǎng)于12 h/12 h亮/暗周期環(huán)境中。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為6組，每組各10只，包括對照組、高脂組、環(huán)磷酰胺+高脂組、治療組Ⅰ、治療組Ⅱ、治療組Ⅲ。

1.3 干預(yù)方法及標(biāo)本獲取 實(shí)驗(yàn)前記錄所有大鼠的體重(初體重)。治療組Ⅰ、治療組Ⅱ、治療組Ⅲ的干預(yù)方法：大鼠均自由飲水，并給予高脂飲食，環(huán)磷酰胺50 mg/kg灌胃(1次/d)，在此基礎(chǔ)上治療組Ⅰ、治療組Ⅱ、治療組Ⅲ分別給予大鼠20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg的青錢柳黃酮灌胃(1次/d)。環(huán)磷酰胺+高脂組的干預(yù)方法：除將青錢柳黃酮灌胃替換為同體積的生理鹽水灌胃外，其余干預(yù)方法與治療組相同。高脂組：除將環(huán)磷酰胺灌胃替換為同體積的生理鹽水灌胃外，其余干預(yù)方法與環(huán)磷酰胺+高脂組相同。對照組：只給予相同體積的生理鹽水灌胃，且飲食為基礎(chǔ)飲食。均連續(xù)干預(yù)15 d，每周記錄體重。干預(yù)結(jié)束后，稱量所有大鼠的體重(終體重)，并在剝奪食物12 h后次日的09：30至10：00之間，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后，從尾靜脈收集血液1.0 mL到采血管中。在4℃下以1 500 r/min的速度離心15 min以獲取血漿，并在-80℃下保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采血后立即將大鼠處死，然后取出肝臟、脾臟、胸腺，稱重后在80℃下保存。

1.4 生化指標(biāo)檢測 剝奪食物12 h后于次日的9:30至10:00采血檢測。M179289動(dòng)物生化分析儀購自北京中西華大科技有限公司。采用酶和比色法檢測總膽固醇、三酰甘油、LDL-C、HDL-C水平，使用酶促反應(yīng)方法檢測血糖。

1.5 臟器指數(shù)評測 取胸腺、肝臟和脾臟，用預(yù)冷生理鹽水漂洗，濾紙吸干水分，稱重計(jì)算臟器指數(shù)。胸腺指數(shù)(mg/g)=胸腺質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)，脾臟指數(shù)(mg/g)=脾臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)，肝臟指數(shù)(mg/g)=肝臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.6 脾淋巴細(xì)胞增殖情況的測定 在超凈工作臺內(nèi)，將大鼠脾臟壓碎后加入紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，2 min后加入RPMI 1640完全培養(yǎng)基終止裂解，200目篩網(wǎng)過濾，收集濾液后于4℃下1 000 r/min離心5 min，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸以制備脾淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/mL。將脾淋巴細(xì)胞懸液按100 μL/孔的濃度加入96孔板中，用移液槍在實(shí)驗(yàn)孔加入100 μL的刀豆凝集素(終濃度為5 μg/mL)，對照孔加入100 μL RPMI 1640完全培養(yǎng)基，均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)16 h后加20 μL濃度為5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清,加入150 μL 二甲基亞砜,37℃振蕩10 min，使用ELX800酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)在490 nm處測定吸光值。計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔吸光值-對照孔吸光值)/對照孔吸光值×100%。

1.7 免疫組織化學(xué)法檢測脂肪組織p-NF-κBp65的表達(dá) 分離6組大鼠腹腔的白色脂肪，置于10%中性福爾馬林液中固定后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋。蠟塊切片后進(jìn)行脫蠟及抗原修復(fù)，按試劑盒說明書逐步進(jìn)行免疫組化染色。采用DEIAS-2000丹尼爾醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。由不同的5名病理學(xué)專家，在200倍光鏡下，隨機(jī)取5個(gè)視野，用Image J軟件測定陽性染色區(qū)(視野區(qū)域出現(xiàn)的黃色、棕黃色、棕褐色為陽性區(qū)，5名病理學(xué)專家的意見需統(tǒng)一)的光密度值。計(jì)算5個(gè)視野的均值。

2 結(jié) 果

2.1 6組大鼠體重的比較 6組大鼠的初體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高脂組、環(huán)磷酰胺+高脂組、治療組Ⅰ、治療組Ⅱ、治療組Ⅲ大鼠的終體重均高于對照組(P<0.05)，提示成功建立肥胖大鼠模型；而高脂組、環(huán)磷酰胺+高脂組、治療組之間兩兩對比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 6組大鼠干預(yù)前后的體重比較(±s,g)

2.2 6組大鼠血脂水平的比較 高脂組、環(huán)磷酰胺+高脂組、3個(gè)治療組血清總膽固醇、三酰甘油、LDL-C水平均高于對照組，而高脂組、環(huán)磷酰胺+高脂組、治療組Ⅰ、治療組Ⅱ的血清HDL-C水平低于對照組(均P<0.05)，但環(huán)磷酰胺+高脂組與高脂組的血脂水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。環(huán)磷酰胺+高脂組、治療組Ⅰ、治療組Ⅱ、治療組Ⅲ的血清總膽固醇、三酰甘油、LDL-C水平依次降低(均P<0.05)；3個(gè)治療組的血清HDL-C水平均高于環(huán)磷酰胺+高脂組(均P<0.05)，治療組Ⅱ、治療組Ⅲ的血清HDL-C水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但均高于治療組Ⅰ(均P<0.05)。見表2。

表2 6組大鼠血脂水平的比較(±s,mmol/L)

2.3 6組大鼠血糖和肝臟指數(shù)的比較 高脂組、環(huán)磷酰胺+高脂組的血糖水平和肝臟指數(shù)均高于對照組(均P<0.05)，但環(huán)磷酰胺+高脂組與高脂組的血糖水平和肝臟指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。治療組Ⅰ、治療組Ⅱ、治療組Ⅲ的血糖水平以及治療組Ⅰ、治療組Ⅱ的肝臟指數(shù)均高于對照組(均P<0.05);環(huán)磷酰胺+高脂組、治療組Ⅰ、治療組Ⅱ、治療組Ⅲ的血糖水平和肝臟指數(shù)依次降低(均P<0.05)。見表3。

表3 6組大鼠血糖水平和肝臟指數(shù)的比較(±s)

2.4 6組大鼠免疫臟器指數(shù)和脾淋巴細(xì)胞增殖率的比較 高脂組、對照組、環(huán)磷酰胺+高脂組大鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖率、胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)依次降低(均P<0.05)。治療組Ⅰ、治療組Ⅱ、治療組Ⅲ的脾淋巴細(xì)胞增殖率和胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)均低于對照組，但高于環(huán)磷酰胺+高脂組(均P<0.05)，且治療組Ⅰ、治療組Ⅱ、治療組Ⅲ的脾淋巴細(xì)胞增殖率、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均依次升高(均P<0.05)。見表4。

表4 6組大鼠免疫臟器指數(shù)和脾淋巴細(xì)胞增殖率的比較(±s)

2.5 6組大鼠脂肪組織中p-NF-κB p65表達(dá)水平的比較 對照組中的p-NF-κB p65主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，而高脂組和環(huán)磷酰胺+高脂組亦可見p-NF-κB p65在細(xì)胞核中表達(dá)，見圖1。高脂組、環(huán)磷酰胺+高脂組大鼠脂肪組織內(nèi)p-NF-κB p65表達(dá)水平均高于對照組(均P<0.05)，但高脂組、環(huán)磷酰胺+高脂組及治療組Ⅰ差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與環(huán)磷酰胺+高脂組比較，治療組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的p-NF-κB p65的表達(dá)均下調(diào)(均P<0.05)。3個(gè)治療組的p-NF-κB p65表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表5。

圖1 大鼠脂肪組織p-NF-κB p65免疫組化染色結(jié)果(200×)

表5 6組大鼠脂肪組織p-NF-κB p65表達(dá)水平的比較(±s)

3 討 論

高脂飲食能夠加速幼年和青年階段嚙齒動(dòng)物體重的增加[12]。本研究結(jié)果也顯示，在2周齡到4周齡階段，經(jīng)高脂喂養(yǎng)后的SD大鼠體重明顯高于正常喂養(yǎng)的對照組大鼠，驗(yàn)證了接觸高脂飲食會(huì)加速體重增加，但環(huán)磷酰胺和青錢柳黃酮對大鼠的體重影響不明顯。已有研究表明環(huán)磷酰胺是低免疫動(dòng)物模型的誘導(dǎo)藥物[13]，因此我們利用環(huán)磷酰胺干預(yù)肥胖大鼠，結(jié)果顯示環(huán)磷酰胺+高脂組和3個(gè)治療組肥胖大鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖率、胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)均下調(diào)(均P<0.05)，提示成功利用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)幼年肥胖大鼠的低免疫狀態(tài)。然而，高脂組大鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖率、胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)均高于對照組大鼠，提示高脂可引起與環(huán)磷酰胺相反的免疫反應(yīng)。

總膽固醇、三酰甘油、LDL-C、HDL-C是診斷和評估心血管疾病的關(guān)鍵指標(biāo)，尤其是冠狀動(dòng)脈疾病。本研究中，幾乎在所有高脂飲食大鼠中均可觀察到異常的血脂水平，提示高脂飲食可以升高血脂水平，與既往的研究結(jié)果[14]相似，這也表明高脂飲食亦是幼年大鼠血脂異常的關(guān)鍵誘因[15]。此外，長期高脂飲食可以增加動(dòng)物的血糖水平[16]，我們也發(fā)現(xiàn)幼年大鼠經(jīng)高脂飲食喂養(yǎng)后發(fā)生高血糖現(xiàn)象。本研究結(jié)果還顯示，高脂組和環(huán)磷酰胺+高脂組的大鼠均存在血糖和血脂異常，但兩組的血糖、血脂及肝臟指數(shù)差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明高脂飲食對血糖、血脂和肝臟代謝發(fā)揮關(guān)鍵作用。而已有多項(xiàng)研究表明，青錢柳提取物具有促進(jìn)脂肪代謝、降血脂的作用，可抑制肥胖大鼠血清中總膽固醇的升高[10,17-18]。還有研究證實(shí)，青錢柳黃酮是α-葡萄糖苷酶的抑制劑，其與該酶迅速結(jié)合[19]。另外，含有青錢柳黃酮的青錢柳葉能降低2型糖尿病大鼠的血糖和血脂[20]。本研究結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺+高脂組、治療組Ⅰ、治療組Ⅱ、治療組Ⅲ的血糖以及血清總膽固醇、三酰甘油、LDL-C水平依次降低(均P<0.05)，提示青錢柳黃酮對幼年肥胖低免疫力大鼠具有降血脂、降血糖的作用，并呈一定的劑量依賴性。

研究表明，青錢柳可以保護(hù)機(jī)體免受自由基傷害，且不良反應(yīng)較少[21]；此外，青錢柳提取物對環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的免疫低下小鼠的免疫功能具有明顯的改善和調(diào)節(jié)作用[22]。然而青錢柳黃酮對免疫紊亂的肥胖幼年動(dòng)物免疫功能改善作用的研究較少。本研究結(jié)果顯示，治療組Ⅰ、治療組Ⅱ、治療組Ⅲ的脾淋巴細(xì)胞增殖率和胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)均高于環(huán)磷酰胺+高脂組，且依次升高(均P<0.05)，這表明青錢柳黃酮可以減輕環(huán)磷酰胺對肥胖幼年大鼠的免疫抑制作用，且具有一定的劑量依賴性。高血糖、高血脂等因素可激活核因子(nuclear factor κB,NF-κB)信號通路，并進(jìn)一步激活脂肪合成等病理變化[23]，因此調(diào)節(jié)NF-κB的激活是干預(yù)和治療肥胖的有效措施[24]。當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，NF-κB位于細(xì)胞質(zhì)中，其p65亞基與NF-κB抑制蛋白單體結(jié)合，覆蓋p50蛋白的核定位信號，抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位，被激活的NF-κB則進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[25]。已有研究表明，在2型糖尿病大鼠中，青錢柳葉可以抑制NF-κB的激活并發(fā)揮抗炎作用[26]。在本研究中，免疫組化檢測結(jié)果顯示，高脂組、環(huán)磷酰胺+高脂組及治療組Ⅰ的脂肪組織中p-NF-κB p65都出現(xiàn)核易位，3組的p-NF-κB p65的表達(dá)水平均高于正常大鼠，但高脂組和環(huán)磷酰胺+高脂組比較無明顯差異。而與環(huán)磷酰胺+高脂組比較，3個(gè)治療組的p-NF-κB p65表達(dá)水平均下調(diào)，提示青錢柳黃酮可能通過抑制NF-κB信號激活干擾脂肪合成，進(jìn)而影響肥胖的發(fā)展和免疫炎癥。

綜上所述，高脂飲食聯(lián)合環(huán)磷酰胺可引起幼年大鼠出現(xiàn)高血糖、血脂、免疫力低下；而青錢柳黃酮可劑量依賴性地改善幼年低免疫力肥胖大鼠的血糖、高血脂、免疫異常，并抑制脂肪組織中NF-κB信號的激活。

(致謝：感謝延安大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院王杰老師在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上給予的幫助和支持。)