戈勝強(qiáng)，韓乃君，呂 艷，任煒杰，張瀟月，王勤玉，南文龍，吳曉東，王志亮

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東泰安 271001）

在面對大范圍傳播的烈性傳染病時，疫苗免疫接種是最有效的防控手段之一。但大規(guī)模疫苗（特別是弱毒活疫苗）接種又會帶來一些負(fù)面擔(dān)憂，如疫苗毒重組導(dǎo)致毒力返強(qiáng)，免疫壓力導(dǎo)致流行株變異等。非洲豬瘟（African swine fever，ASF）自1921 年公開報道以來，至今仍未有商品化疫苗用于其防控。一直以來，對于ASF 疫苗使用的爭議從未間斷，對其疫苗研發(fā)評估/臨床應(yīng)用尤其謹(jǐn)慎。20 世紀(jì)60 年代，面對ASF 傳入后的快速蔓延，西班牙和葡萄牙曾經(jīng)進(jìn)行過弱毒疫苗田間試驗，但最終以失敗告終，這也是大家對ASF 疫苗抱有“負(fù)面期望”的原因之一。為科學(xué)分析ASF 疫苗的臨床應(yīng)用風(fēng)險，筆者搜集整理了20 世紀(jì)60 年代的關(guān)鍵文獻(xiàn)（以葡萄牙發(fā)表的法語文獻(xiàn)為主），對該時期葡萄牙的“免疫失敗事件”進(jìn)行詳細(xì)闡述，以期科學(xué)看待ASF 疫苗的使用經(jīng)驗和教訓(xùn)，為未來ASF 疫苗研制提供參考。

1 疫苗田間試驗背景

1957 年4 月，ASF 首次從非洲大陸傳出，經(jīng)安哥拉國際航班攜帶的未熟化的帶毒豬肉餐廚垃圾傳入葡萄牙里斯本（首發(fā)疫情養(yǎng)殖場靠近機(jī)場）。隨后，葡萄牙共8 個省份471 個地點暴發(fā)ASF 疫情，損失16 989 頭豬（其中6 352 頭發(fā)病死亡，其余被撲殺銷毀）[1-2]。因采取了快速有效的撲滅措施，如感染畜群的早期發(fā)現(xiàn)、隔離、限制移動、撲殺等，葡萄牙第一波疫情于1958 年6 月19 日被全部消滅[3]。1960 年4 月18 日，葡萄牙再次發(fā)現(xiàn)ASF 疫情。首發(fā)病例發(fā)生在第一波疫情曾經(jīng)出現(xiàn)的里斯本地區(qū)，發(fā)病原因可能是家豬誤食了未合規(guī)處理的病豬豬肉制品（有專家認(rèn)為這次疫情的病原并非來源于境外，但無法確定病毒在這段時間內(nèi)是如何隱藏的，比較明確的是發(fā)病豬群的食物中包含地溝油和餐館垃圾[2]）。但經(jīng)部分序列比對分析認(rèn)為Lisbon60毒株（1960 年傳入）和Lisbon57 毒株（1957 年傳入）可能為不同來源毒株，兩個毒株之間存在一定的抗原差異，如Lisbon57 毒株屬于血清1 群，而Lisbon60 毒株屬于血清4 群[4]。雖然葡萄牙立刻采取了嚴(yán)格的控制措施，對該農(nóng)場的所有動物（發(fā)病和健康）都進(jìn)行了撲殺和銷毀，但可能由于被污染的肉類在首發(fā)病例被發(fā)現(xiàn)前就已進(jìn)入了流通環(huán)節(jié)，導(dǎo)致ASF 還是傳播到了同一地區(qū)的其他農(nóng)場。截至1960 年12 月，葡萄牙共16 個省份187 個地點暴發(fā)ASF 疫情，損失14 629 頭豬（725 頭病死、13 904 頭被撲殺，表1）。同年，ASF 經(jīng)邊境傳入西班牙（首次疫情發(fā)生在靠近葡萄牙邊境地區(qū)）[5]。

表1 1960 年葡萄牙ASF 疫情發(fā)病情況

葡萄牙此輪ASF疫情從1960年開始持續(xù)發(fā)展，1962 年4 月開始快速蔓延，多地出現(xiàn)持續(xù)傳播，疫情進(jìn)一步惡化。因擔(dān)心疫情失控及對養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)產(chǎn)生影響，1962 年5 月葡萄牙啟動ASF 疫苗田間試驗[6]。

2 弱毒疫苗株背景

20 世紀(jì)60 年代葡萄牙使用的疫苗株為細(xì)胞傳代致弱株。因年代久遠(yuǎn)，現(xiàn)有資料已無法準(zhǔn)確找到該疫苗株詳細(xì)信息。目前普遍認(rèn)為，該疫苗株為葡萄牙1960 年分離的里斯本60 毒株（Lisbon 60）或1961 年分離的1455 株（Portuguese isolate 1455）[6]在骨髓細(xì)胞連續(xù)傳代所得。Lisbon60 致弱株接種豬后會使其出現(xiàn)體溫反應(yīng)，但用接種豬抗凝血再次接種試驗豬后，被接種豬無體溫升高和臨床反應(yīng)，且能在第71 天時抵御口腔強(qiáng)毒感染[7]。另有試驗[8]證實，該致弱株以每頭105TCID50/mL 劑量接種22頭豬后，所有接種豬均健康存活，但在第117 天攻毒后，大部分豬只（17/18）出現(xiàn)體溫反應(yīng)且4 頭死亡。

1455株在骨髓細(xì)胞連續(xù)傳代后毒力逐漸下降。40 代和60 代毒可導(dǎo)致接種豬群非特異性運(yùn)動障礙和典型的ASF 癥狀，而60 代毒引起的臨床癥狀明顯減輕，70 代毒已幾乎無法引起運(yùn)動障礙并能抵御強(qiáng)毒株攻擊。為找到最佳傳代代次，對該致弱株的第77 代至第84 代進(jìn)行了大量評估（最終在第80 代通過評價），試驗動物數(shù)量超過400 頭，每月至少對3 頭動物進(jìn)行一次攻毒評價。試驗的10個月內(nèi)，在3～12 月齡的動物中均未觀察到明顯的臨床反應(yīng)，沒有死亡發(fā)生。疫苗接種后，有研究[6]發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動系統(tǒng)中有不良反應(yīng)的個體僅占很小的比例，主要是短暫的體溫升高和輕微的運(yùn)動障礙，而且更容易在體重較重的動物身上觀察到，當(dāng)然有時也有一些個體表現(xiàn)出非常嚴(yán)重的體溫升高。同時，在疫苗接種動物和同群動物中沒有看到明顯的臨床癥狀，免疫接種動物在免疫后第14 天便可以檢測到抗體產(chǎn)生[3]。

3 疫苗使用經(jīng)過和后果

20 世紀(jì)60 年代初的實驗室研究證明，葡萄牙1455 株的細(xì)胞傳代致弱株安全可靠[6]，但在臨床應(yīng)用時卻沒有復(fù)制出實驗室結(jié)果。葡萄牙自1962年5 月18 日開始疫苗田間試驗，至6 月15 日，共對約40 000 頭動物進(jìn)行了第一次田間接種試驗。在疫苗接種地區(qū)，ASF 疫情先呈現(xiàn)下降趨勢但又急劇反彈，這促使葡萄牙進(jìn)一步擴(kuò)大試驗規(guī)模，至7 月份時試驗數(shù)量達(dá)到頂峰。伴隨著ASF 疫情加劇，截止到1962 年12 月底，葡萄牙南部地區(qū)共有超過55 萬頭豬接種了弱毒疫苗（表2）。

表2 1962 年葡萄牙ASF 疫苗接種情況 單位：頭

疫苗接種后的幾個月，葡萄牙感染區(qū)域擴(kuò)大了3～6 倍，免疫動物死亡率達(dá)到10%～50%，且病癥出現(xiàn)時間大幅延后[9-10]。經(jīng)初步統(tǒng)計，在55 萬多頭接種疫苗的豬群中，有3.4%出現(xiàn)了ASF 發(fā)?。òń臃N后3 周內(nèi)發(fā)病的豬），另有7%出現(xiàn)了可能與疫苗接種有關(guān)的疾病，如仔豬呼吸系統(tǒng)疾病、肌肉骨骼疾病、流產(chǎn)、死產(chǎn)或仔豬早期死亡以及泌乳期的泌乳障礙等。這些發(fā)病豬發(fā)展到晚期時還會出現(xiàn)并發(fā)癥，如肺炎、皮膚壞死、關(guān)節(jié)炎、生殖道炎癥或妊娠期疾病、動物生長遲緩、食物加工（消化）指數(shù)下降和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。在這些晚期并發(fā)癥中，肺部疾病是最嚴(yán)重的，在伊比利亞型幼年病例和某些地區(qū)的病例中，還出現(xiàn)較嚴(yán)重的皮膚壞死。所有這些疫苗接種后的并發(fā)癥在伊比利亞種的豬中出現(xiàn)更為嚴(yán)重和頻繁，但在純種和雜交豬中出現(xiàn)頻率較低（杜洛克-澤西品種除外，該品種對ASF 疫苗高度敏感）。

因免疫接種數(shù)量眾多（55 萬多頭），難以詳細(xì)記錄接種豬反應(yīng)，葡萄牙對貝雅（de Beja）地區(qū)接種的1 247 個畜群（共計128 684 頭）進(jìn)行了較詳細(xì)記錄，總結(jié)如下[6]。

3.1 接種后ASF 發(fā)生情況

因疫苗接種時正處于ASF 流行期，故理論上認(rèn)為，疫苗接種后3 周內(nèi)發(fā)病的應(yīng)屬于潛伏期感染豬，不應(yīng)作為疫苗評價數(shù)據(jù)（因?qū)嶒炇覕?shù)據(jù)顯示疫苗接種不發(fā)病）。事實也發(fā)現(xiàn)，在1 247 個接種疫苗的畜群中，共有55 個畜群出現(xiàn)了ASF，其中43個畜群在疫苗接種21 d 內(nèi)發(fā)病，12 個畜群在疫苗接種21 d 后發(fā)?。? 個畜群來自最近暴發(fā)過ASF的農(nóng)場，另外4 個畜群感染原因可能是與受感染豬群同圈飼養(yǎng)，表3）。由此推斷，接種疫苗21 d 后，ASF 的群體發(fā)病率為0.96%（12/1 247），個體發(fā)病率為1.05%（1 356/128 684）。

表3 疫苗接種后ASF 發(fā)病畜群數(shù)統(tǒng)計結(jié)果

3.2 仔豬及育肥豬接種后并發(fā)癥情況

在接種疫苗1 個月后，對各月齡的接種豬進(jìn)行觀察。在觀察的69 658 頭動物中，大約有12.1%（8 441/69 658）出現(xiàn)了呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、肌肉骨骼和皮膚問題，7%～17%的接種豬因上述問題死亡（未斷奶仔豬、3～6 月齡、6～12 月齡、12月齡以上豬死亡率分別為16.9%，10.8%，9.3%，7.0%），見表4。

表4 疫苗接種后仔豬及育肥豬并發(fā)癥發(fā)病情況

3.3 母豬接種后并發(fā)癥情況

試驗記錄表明某些畜群接種后出現(xiàn)流產(chǎn)情況非常頻繁，而未接種畜群則很少出現(xiàn)。流產(chǎn)在妊娠期間的不同時間均可發(fā)生，可發(fā)生在早期、中期或晚期。這可能取決于給懷孕母豬注射疫苗的時間，以及疫苗本身和農(nóng)場所固有的條件。在某些情況下，接種疫苗后可能出現(xiàn)死胎或早產(chǎn)仔豬畸形，然而這些情況隨下一次妊娠而消失。母畜不孕癥也有發(fā)生，特別是在接種疫苗后不久就交配的情況下，但這一情況也隨下一次交配妊娠而消失。由于以上不確定原因，葡萄牙禁止對所有母豬接種ASF 疫苗。

3.4 并發(fā)癥實驗室檢測情況

因疫苗接種后比較容易觀察到的并發(fā)癥是皮膚問題或肺部損傷，故研究者對這兩種樣本進(jìn)行了病毒檢測，結(jié)果未從皮膚樣本中分離到ASF 病毒（ASFV）。更多情況下皮膚壞死由膿桿菌引起（膿桿菌在葡萄牙廣泛分布），有時也會從皮膚樣本中分離到其他細(xì)菌，如化膿性桿菌、化膿性鏈球菌等。但從肺部病變分離出ASFV 的頻率相對較高（強(qiáng)毒為主），分離株接種健康易感豬后有可能誘發(fā)ASF 發(fā)生，說明感染的ASF 具有傳染性和致病力。同時，肺部病料中也能分離到多種細(xì)菌，如多殺性巴氏桿菌、化膿性鏈球菌、葡萄球菌（金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌）、綠膿桿菌、支氣管敗血性博德桿菌、大腸桿菌和變形桿菌等。

3.5 屠宰場調(diào)查情況

為更深入地分析疫苗接種情況，葡萄牙研究團(tuán)隊對1963 年1—3 月免疫接種豬（11 467 頭）和未免疫接種豬（1 078 頭）屠宰后的肺部情況進(jìn)行了比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)疫苗接種豬中有2 513 頭出現(xiàn)了肺部病變（占21.92%），未疫苗接種豬中有52 頭出現(xiàn)肺部病變（占4.82%）。對接種過疫苗的伊比利亞型純種（9 384頭）及雜交豬種（1 794頭）進(jìn)行更細(xì)致的比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜交豬種與伊比利亞品種豬相比，前葉肺炎的發(fā)病率高，而其他類型肺炎的發(fā)病率低，且不同類型肺炎在兩組動物中的差異較大（表5）。

表5 接種疫苗后伊比利亞型純種及雜交豬肺部炎癥發(fā)生比例 %

3.6 二免接種情況

疫苗首次接種7 個月后部分豬群又出現(xiàn)了ASF 病例。同時，為評估疫苗二次接種對無明顯臨床癥狀豬的影響，葡萄牙對1962 年6—9 月和1963 年1—3 月期間接種的豬群（73 個）進(jìn)行了二次疫苗接種。結(jié)果顯示：首次接種無臨床癥狀的19 個畜群（1 210 頭）重新接種疫苗后，16 個畜群（1 151 頭）沒有出現(xiàn)并發(fā)癥，1 個畜群（20 頭）出現(xiàn)ASF，2 個畜群（6 頭和33 頭）出現(xiàn)死亡病例。首次接種有嚴(yán)重肺炎并發(fā)癥的54 個畜群重新接種疫苗后，結(jié)果9 個畜群出現(xiàn)ASF，6 個畜群出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)疾病，剩余的39 個畜群（3 611 頭）中3 417 頭豬恢復(fù)健康，但部分豬在1963 年4 月后又出現(xiàn)明顯的并發(fā)癥。

4 弱毒疫苗使用結(jié)果評判

葡萄牙20 世紀(jì)60 年代研制的弱毒疫苗經(jīng)實驗室驗證，證實接種健康、無寄生蟲感染并且營養(yǎng)良好的豬只是安全的，即它不會在接種過該疫苗的豬只或與其接觸過的豬只中引起ASF。而且據(jù)統(tǒng)計分析，使用該疫苗后的最終損失不超過15%。考慮到疫苗接種時葡萄牙部分地區(qū)豬群健康狀況較差以及該病快速蔓延的惡性進(jìn)程，這一死亡率似乎并不高。但因種種原因，葡萄牙不得不終止ASF 疫苗的大范圍使用。其原因歸根結(jié)底仍是該疫苗臨床使用時不確定性因素較多，特別是因為葡萄牙疫苗接種是在ASF 疫情大流行中進(jìn)行的，接種疫苗的動物被飼養(yǎng)在受污染的環(huán)境中，以至于（實際）感染病毒的劑量可能超過了“疫苗中和病毒”的能力，這直接導(dǎo)致了部分接種豬在疫苗接種后立刻出現(xiàn)呼吸道癥狀，且死亡時呈現(xiàn)的肺部病變與現(xiàn)場觀察的情況相似。此外，受葡萄牙養(yǎng)殖環(huán)境及豬群健康影響，接種豬可能在6 個月或更長時間后開始出現(xiàn)嚴(yán)重的肺部并發(fā)癥，導(dǎo)致免疫失敗。這些現(xiàn)象與同時期實驗室攻毒結(jié)果相似[11]，后者證實接種ASF 弱毒疫苗后，即使沒有強(qiáng)毒株感染，大多數(shù)免疫動物仍會發(fā)生慢性感染且最終死亡率達(dá)到10%～50%。很多病毒攜帶豬雖能長時間內(nèi)保持健康狀態(tài)，但大多數(shù)最終發(fā)展為慢性肺炎或急性發(fā)病死亡。最終的死亡率可能與弱毒株的殘存毒力、試驗動物的種屬差異和接種動物的生存壓力等密切相關(guān)[12]。

葡萄牙弱毒疫苗毒株擴(kuò)散演化常與伊比利亞半島20 世紀(jì)60—90 年代的ASF 流行相關(guān)聯(lián)，如1968 年分離的自然弱毒株NH/P68 毒株（又稱NHV）經(jīng)推測可能是葡萄牙疫苗毒演變而來的[13]。此外，同時期伊比利亞半島可能存在兩個強(qiáng)毒株流行（Lisbon57 和Lisbon60），這可能也是部分免疫失敗的原因。總而言之，葡萄牙弱毒疫苗使用后的并發(fā)癥問題超過了實驗預(yù)期及應(yīng)急準(zhǔn)備，再加上疫苗的超前應(yīng)用可能使得該事件的發(fā)展更加嚴(yán)重，這導(dǎo)致葡萄牙弱毒疫苗的田間大范圍應(yīng)用事件成為“錯誤的毒株在錯誤的地區(qū)”應(yīng)用失敗的典型案例[3]。

致謝：

葡萄牙里斯本大學(xué)的Carlos Martins 研究員為本文提供了相關(guān)材料。