劉 華，何長生，苗文萍，王 維，王 倩，王 軍，周迎春，沈 艷，占松鶴，朱良強(qiáng)

（1.安徽省動物疫病預(yù)防與控制中心，安徽合肥 230091；2.獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控安徽省重點實驗室，安徽合肥 230036）

禽流感（avian influenza，AI）是由A 型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的禽類傳染病，最早在意大利報道發(fā)生[1]。A 型AIV 有15 種亞型可感染禽類，但高致病性AI 主要由H5和H7 亞型引起，并可感染人[2-3]。在我國，AI 多發(fā)生于春季和秋季，是國家動物疫病監(jiān)測計劃中重點監(jiān)測的動物疫病之一。為掌握安徽省AIV 的分布和流行情況，2019 年4—6 月（春季）和10—12月（秋季），分別對安徽省家禽養(yǎng)殖場、活禽批發(fā)市場、農(nóng)貿(mào)市場、自然村散養(yǎng)戶及野禽棲息地開展了AIV 群體流行率橫斷面研究，以期為科學(xué)防控AI 提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 目標(biāo)群

以安徽省境內(nèi)的種禽場、商品蛋禽場、商品肉禽場等家禽養(yǎng)殖場，活禽批發(fā)市場和農(nóng)貿(mào)市場等交易市場，以及自然村散養(yǎng)家禽和野禽棲息地野禽為目標(biāo)群。

1.2 抽樣策略和樣本量

采取先抽取群體再抽取個體的兩階段抽樣策略。（1）群體水平，采用估計流行率方法計算樣本量。預(yù)設(shè)群體流行率（p）為15%，置信水平（CL）為95%，可接受誤差（d）為5%，帶入公式：N=1.962×p（1-p）/d2，計算所需場點數(shù)為193 個。采用分層隨機(jī)抽樣法，參考相關(guān)平臺數(shù)據(jù)中各種類型場點的比例并結(jié)合實際，抽取不同類型的場點（表1）。（2）個體水平，按照發(fā)現(xiàn)疫病方法計算樣本量。設(shè)預(yù)期個體流行率15%、置信水平95%，假設(shè)試驗敏感性和特異性均為100%，帶入公 式：n=[1-（1-CL）]1/D×[N'-（D-1）/2]（N'為存欄量或當(dāng)日交易量，野禽為無限群，D為預(yù)期群體中的感染數(shù)量），則每個場點需采集17～19 份樣品。為方便基層操作，統(tǒng)一為每個場點采集20 份樣品。

1.3 樣品采集

在每個家禽養(yǎng)殖場，采集20 份家禽咽喉-泄殖腔雙拭子；在每個活禽交易市場和農(nóng)貿(mào)市場，采集3 個檔口或攤位5 份家禽雙拭子，同時采集5 份環(huán)境拭子（污水溝、地面、墻面、籠具、車輪污物或宰點脫毛機(jī)等）；以自然村為流行病學(xué)單元，每個村采集不少于4 戶散養(yǎng)家禽的雙拭子共20 份；在每個野禽棲息地，采集20 份新鮮野禽糞便拭子。

1.4 實驗室檢測

將背景信息相同的5 份樣品混合成1 份混樣，用A 型AIV 熒光RT-PCR 試劑盒（深圳澳東，批號5B008、60084）進(jìn)行檢測，只要檢出1 份混樣為陽性，則該樣品來源場點被定義為陽性場點。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 群體表觀流行率 一般情況下，群體表觀流行率（HAp）為檢測到的陽性群占抽樣研究群的比值。

1.5.2 群體真實流行率 用文獻(xiàn)[4]的方法，對分層得到的陽性率直接進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計算后，與檢測試驗敏感性（Se）、特異性（Sp）、群體內(nèi)個體抽樣數(shù)量（n）一起，帶入公式HSe=1-[1-p×Se-（1-p）（1-Sp）]n和HSp=Spn，HTp=（HAp+HSp-1）/（HSe+HSp-1），計算群敏感性（HSe）、群特異性（HSp）和群體真實流行率（HTp）。

1.5.4 統(tǒng)計方法 用SPSS 20.0 軟件，對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗和Fisher's 確切檢驗。

2 結(jié)果

2.1 A 型AIV 流行率

春、秋兩季A 型AIV 的HAp 分別為17.9%、12.6%，二者差異不顯著（P＞0.05），標(biāo)準(zhǔn)化率分別為17.4%和12.4%（表1）。參考A 型AIV熒光RT-PCR 試劑盒的試驗敏感性（Se=99.0%）和特異性（Sp=99.9%），計算得HSe=96.1%，HSp=98.0%。春、秋兩季A 型AIV 的HTp 分別為16.4%（95%CI：11.2%～21.6%）、10.4%（95%CI：6.1%～14.7%）。

表1 2019 年安徽省A 型AIV 橫斷面研究場群抽樣數(shù)量及群體流行率

2.2 空間分布

檢測結(jié)果（圖1）顯示：春、秋兩季分別在10 個地級市26 個縣（區(qū)、市）、9 個地級市21 個縣（區(qū)、市）檢出A 型AIV 核酸陽性；全省16 個地市中，有6 個兩次均檢出陽性，分別是六安、馬鞍山、宣城、銅陵、安慶和黃山。春、秋兩季檢出陽性的地級市或縣（區(qū)、市）數(shù)量占對應(yīng)總數(shù)的比例沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

圖1 2019 年安徽省春秋兩季A 型AIV監(jiān)測場點與陽性場點分布

2.3 群間與時間分布

2.3.1 不同類型 對春、秋兩季的養(yǎng)禽場、活禽市場、自然村散戶、野禽棲息地的A 型AIV 群體陽性率，分別按群間、時間進(jìn)行分組并進(jìn)行兩兩比較，經(jīng)卡方檢驗或Fisher's 確切檢驗發(fā)現(xiàn)：春、秋兩季活禽市場與養(yǎng)禽場的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），春、秋兩季活禽市場A 型AIV流行率比（prevalence ratio，PR）分別是養(yǎng)禽場的2.2 倍（95%CI：1.2～4.2）、2.3 倍（95%CI：1.1～5.0）；種禽場、蛋禽場和肉禽場的群陽性率均無群間和時間上的統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）?；钋菖l(fā)市場和農(nóng)貿(mào)（零售）市場之間的群陽性率也無群間和時間上統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。具體結(jié)果見表2。

表2 春秋兩季A 型AIV 監(jiān)測場點與陽性場點群間分布

2.3.2 不同種類 對養(yǎng)禽場、交易市場和散養(yǎng)戶不同種類陽性樣品分布情況進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果春、秋兩季均在雞咽喉-泄殖腔拭子樣品中檢出A 型AIV 核酸陽性，春季還在番鴨中檢出陽性，秋季在鵝中檢出陽性，兩次均未在野禽糞便拭子樣品中檢出陽性。在活禽批發(fā)市場和農(nóng)貿(mào)市場的環(huán)境拭子樣品中兩次均有陽性檢出。按樣品類型分組并進(jìn)行兩兩比較，經(jīng)卡方檢驗或Fisher's 確切檢驗發(fā)現(xiàn)，除秋季鵝與野禽兩組差異顯著外（P＜0.05），其他均差異不顯著（P＞0.05）；對春、秋季各組進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，除春季雞樣品陽性率較高且有統(tǒng)計學(xué)意義外（P＜0.05），其他各組均差異不顯著（P＞0.05）。與水禽和野禽相比，雞群和活禽市場環(huán)境中的A 型AIV 流行率比沒有統(tǒng)計學(xué)意義（PR 的95%CI 穿過1）。具體結(jié)果見表3。

表3 春秋兩季A 型AIV 監(jiān)測樣品來源群分布

2.4 分型檢測

對A 型AIV 核酸陽性樣品進(jìn)行H5、H7、H9亞型分型，結(jié)果H5、H7亞型均呈熒光RT-PCR陰性，H9 亞型春、秋季的HAp 分別為6.2%（12/195）、4.2%（8/191）。

3 討論

從流行病學(xué)意義上講，2019 年春秋季安徽省A 型AIV 群體流行率有95%的可能性在6.0%～22.0%之間。2018 年的監(jiān)測結(jié)果也在這個范圍之內(nèi)[5]。通過多年連續(xù)監(jiān)測，結(jié)合流行病學(xué)抽樣方法的運(yùn)用和優(yōu)化，大致掌握了安徽省A 型AIV流行率范圍。從2017 年H7N9 疫苗應(yīng)用后，H7 亞型AIV 監(jiān)測結(jié)果均呈陰性。同時，連續(xù)6 次的監(jiān)測也沒有檢出H5 亞型AIV 陽性。A 型AIV 核酸陽性樣品中，H9 亞型的比例約占1/3，另外的2/3屬于哪些亞型尚未進(jìn)行檢測，這可以在今后工作中作深入研究。此外，對于H9 亞型陽性樣品，可以與高級別實驗室開展合作，探索進(jìn)行基因測序和分子流行病學(xué)等方面研究。2021 年國內(nèi)出現(xiàn)了多起H5N8 亞型AI 疫情[6]，因此需要繼續(xù)開展相關(guān)監(jiān)測，查明安徽省是否有存在該亞型病毒。

2019 年春秋季，安徽省活禽交易環(huán)節(jié)的A 型AIV 流行率比養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的高，這與諸多研究[7-9]的結(jié)論一致，也與安徽省多年的監(jiān)測結(jié)果一致，但在地理位置、春秋季節(jié)、家禽種類、家禽用途等方面沒有顯著差異。因此，在活禽交易市場和農(nóng)貿(mào)市場較多的地方，要特別注重這些場所的防疫設(shè)施改造和生物安全管理，加強(qiáng)檢疫監(jiān)管和衛(wèi)生監(jiān)督，加強(qiáng)清洗消毒和休市制度的執(zhí)行，加強(qiáng)轉(zhuǎn)變消費(fèi)習(xí)俗的宣傳，推行“冰鮮上市”，防止病毒向養(yǎng)殖環(huán)節(jié)傳播和擴(kuò)散。

2019 年的監(jiān)測結(jié)果與往年類似，但2019 年每次監(jiān)測的場點數(shù)量減少了近一半，每個場點的抽取樣品數(shù)量也因抽樣策略的改變而減少。因此，從群體和個體水平都大大節(jié)省了人、財、物等監(jiān)測成本。在可操作性上，基層抽樣人員由于對流行率、可接受誤差等專業(yè)術(shù)語理解能力有限，對每個場點選擇的個體樣本數(shù)量也達(dá)不到一致，因而給數(shù)據(jù)分析帶來困難。本次探索性使用發(fā)現(xiàn)疫病的策略抽取個體，雖然結(jié)果不能用來估計個體水平的流行率，但由于統(tǒng)一了樣本數(shù)量，既方便了前端的采樣操作，又方便了后端的數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

春秋季兩次監(jiān)測的局限性在于監(jiān)測場點中自然村數(shù)量稍顯不足。這一方面由于養(yǎng)禽業(yè)向集約化、規(guī)?；l(fā)展，散養(yǎng)家禽數(shù)量減少；另一方面，基層隊伍待遇低、老齡化、人員少，已無法滿足監(jiān)測采樣等防疫需求。以安徽省畜牧業(yè)大縣望江縣為例，截至2020 年底，全縣村級防疫員數(shù)量由160 多人縮減至不足70 人。對于流行病學(xué)單元結(jié)構(gòu)層次較為復(fù)雜的全省范圍監(jiān)測，需要建立一支穩(wěn)定的、高水平的基層隊伍，充分挖掘基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，構(gòu)建科學(xué)抽樣框，分層開展專項監(jiān)測，以獲取科學(xué)精確的監(jiān)測結(jié)果，從而為動物疫病精準(zhǔn)防控奠定基礎(chǔ)。