馮 秀,陳 穎,王以浪

(1南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科,南通 226001;2南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:1764119488@qq.com)

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)由包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、前體細(xì)胞、癌細(xì)胞在內(nèi)的異質(zhì)細(xì)胞以及細(xì)胞外環(huán)境組成，這些細(xì)胞類型及環(huán)境的變化可影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[1-3]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化潛能，是TME的重要構(gòu)成部分，對腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移具有重要影響[2]。腫瘤相關(guān)性成纖維細(xì)胞(carcinoma-associated fibroblasts，CAFs)在促進(jìn)和維持癌癥方面具有重要作用，其來源的主要前體細(xì)胞是骨髓和脂肪成纖維細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞[4,5]。Aurora-A在多數(shù)細(xì)胞類型中均有表達(dá)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期從G2期到胞質(zhì)分裂過程中具有極其重要的作用，在已有的研究中發(fā)現(xiàn)，Aurora-A作為癌基因在肝癌等多種腫瘤中發(fā)揮促癌作用[6]。目前關(guān)于Aurora-A在腫瘤中的作用機(jī)制研究甚多，但關(guān)于其對肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響是否可能與其參與調(diào)控MSCs向hCAF轉(zhuǎn)化有關(guān)還未可知，因此，本研究通過對其研究，以期為Aurora-A在HepG2中的功能機(jī)制研究提供進(jìn)一步的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

hAD-MSCs細(xì)胞(貨號：ZQ0309)、DMEM培養(yǎng)基(貨號：ZQ-100)購自上海中喬新舟生物科技有限公司；HepG2細(xì)胞系(貨號：CL-0103)購自武漢普諾賽生命科技有限公司；細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒(Cell counting Kit-8，CCK-8，貨號：BB-4202)購自上海貝博生物科技有限公司；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(貨號：11668027)、NC和shRNA慢病毒質(zhì)粒購自賽默飛世爾科技；兔抗人Aurora-A抗體(貨號：abs110826-50ul)購自愛必信(上海)生物科技有限公司；兔抗人α-SMA、Desmin、FSP、GAPDH、山羊抗兔IgG二抗抗體(貨號：K10018-WXC、K14063-KHR、K28020、K16389-KDP、WE0381-QAN)均購自北京百奧萊博科技有限公司；兔抗人FAP、Tsp-1抗體(貨號：orb579794、orb124902)購自武漢博歐特生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒(貨號：SD-001/SN-002)英文特生物技術(shù)(北京)有限公司；BCA蛋白檢測試劑盒(貨號：23250)購自上海嶸崴達(dá)實業(yè)有限公司。

蛋白凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司；RT2100C全自動酶標(biāo)儀購自德國IFP公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將hAD-MSCs細(xì)胞和HepG2細(xì)胞系復(fù)蘇，在DMEM培養(yǎng)基(含胎牛血清10%、100 U/ml青霉素-100 mg/ml鏈霉素)中置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每兩天更換一次培養(yǎng)基，通過胰酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將所得細(xì)胞以1 000 r/min，離心5 min，棄上清，PBS洗滌去酶液備用。

1.3 實驗方法

1.3.1 hAD-MSCs細(xì)胞和HepG2細(xì)胞共培養(yǎng) 將已復(fù)蘇的hAD-MSCs細(xì)胞和HepG2細(xì)胞分別接種到Transwell 6孔板上層和下層，37 ℃、5%CO2共培養(yǎng)3 d。

1.3.2 shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染 將HepG2及hAD-MSCs細(xì)胞分為HepG2組(單獨HepG2培養(yǎng))、hAD-MSCs組(單獨hAD-MSCs培養(yǎng))、hAD-MSCs+HepG2組(hAD-MSCs+HepG2共培養(yǎng))、NC組(用無關(guān)序列NC轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞系后與hAD-MSCs細(xì)胞共培養(yǎng))和Aurora-A-shRNA組(用shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞系后與hAD-MSCs細(xì)胞共培養(yǎng))。在96孔板中使用NC和shRNA慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，更換無病毒DMEM培養(yǎng)基(無雙抗)培養(yǎng)過夜后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，2 d后添加1 μl/ml嘌呤霉素進(jìn)行陽性克隆篩選，直至篩選出陽性克隆進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，然后將NC組和Aurora-A-shRNA組HepG2細(xì)胞分別與hAD-MSCs細(xì)胞共培養(yǎng)3 d。

1.3.3 Western blot檢測hAD-MSCs細(xì)胞、HepG2蛋白表達(dá)情況 采用BCA蛋白試劑盒對hAD-MSCs、HepG2總蛋白含量進(jìn)行測定(n=6)。采用SDS-PAGE電泳后低溫轉(zhuǎn)膜，用脫脂奶粉封閉1 h，添加兔抗人Aurora-A、α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、肌間線蛋白(Desmin)、成纖維細(xì)胞激活蛋白(fibroblast activation protein，F(xiàn)AP)、血小板反應(yīng)蛋白/凝血酶敏感蛋白1(Tsp-1)、成纖維細(xì)胞特異性蛋白(FSP)、GAPDH一抗，4 ℃孵育過夜，添加山羊抗兔IgG抗體二抗孵育2 h。在蛋白凝膠成像儀下對Aurora-A、α-SMA、Desmin、FAP、Tsp-1、FSP蛋白進(jìn)行定量分析。

1.3.4 CCK-8法檢測HepG2細(xì)胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度稀釋為1×105個/ml接種于96孔板中培養(yǎng)。根據(jù)試劑盒說明書使用CCK-8法檢測HepG2組、共培養(yǎng)組、NC組和Aurora-A-shRNA組HepG2細(xì)胞增殖抑制率(n=6)，在570 nm處測定吸光度OD值，計算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞抑制率(%)=[(對照組OD值-實驗組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.3.5 Transwell法檢測HepG2細(xì)胞侵襲和遷移能力 侵襲實驗：分離出HepG2細(xì)胞，Transwell小室上室用Matrigel膠所包被，將HepG2細(xì)胞濃度調(diào)整為2.5×105個/ml，取200 μl懸液接種于上室，下室加入DMEM培養(yǎng)基500 μl后培養(yǎng)24 h，PBS清洗；用棉簽擦去上室未穿膜細(xì)胞；甲醇進(jìn)行30 min固定、0.1%結(jié)晶紫溶液進(jìn)行30 min染色，隨機(jī)選取6個視野內(nèi)所觀察到的穿膜細(xì)胞并計數(shù)。

遷移實驗：Transwell小室上室未被Matrigel膠所包被，其余處理與侵襲實驗相同。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 hAD-MSCs細(xì)胞中CAF相關(guān)蛋白表達(dá)情況

與hAD-MSCs組相比，hAD-MSCs+HepG2組和NC組hAD-MSCs細(xì)胞中CAF相關(guān)蛋白α-SMA、Desmin、FAP、Tsp-1、FSP表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。與hAD-MSCs+HepG2組相比，NC組細(xì)胞內(nèi)CAF相關(guān)蛋白表達(dá)水平無顯著變化(P>0.05)，而在Aurora-A-shRNA組則顯著降低(P<0.05，見圖1)。

與hAD-MSCs組相比，aP<0.05；與hAD-MSCs+HepG2組相比，bP<0.05圖1 不同處理后hAD-MSCs細(xì)胞中CAF相關(guān)蛋白表達(dá)情況Figure 1 Expression of CAF-related proteins in hAD-MSCs after different treatment

2.2 Aurora-A轉(zhuǎn)染效果檢測

與hAD-MSCs+HepG2組相比，NC組Aurora-A表達(dá)水平無顯著變化(P>0.05)，Aurora-A-shRNA組Aurora-A表達(dá)水平顯著降低(P<0.05，見圖2)。

2.3 HepG2細(xì)胞增殖情況

與HepG2組相比，hAD-MSCs+HepG2組和NC組HepG2細(xì)胞增殖抑制率顯著降低(P<0.05)；與hAD-MSCs+HepG2組相比，NC組細(xì)胞增殖抑制率無顯著變化(P>0.05)，而在Aurora-A-shRNA組則顯著增加(P<0.05，見圖3)。

2.4 檢測HepG2細(xì)胞的侵襲和遷移能力

與HepG2相比，hAD-MSCs+HepG2組與NC組HepG2細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)；與hAD-MSCs+HepG2組相比，NC組細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)無顯著變化(P>0.05)，而Aurora-A-shRNA組則顯著降低(P<0.05，見圖4)。

與HepG2組相比，aP<0.05；與hAD-MSCs+HepG2組相比，bP<0.05圖3 不同處理后HepG2細(xì)胞增殖Figure 3 Proliferation of HepG2 cells after different treatment

與HepG2組相比，aP<0.05；與hAD-MSCs+HepG2組相比，bP<0.05圖4 不同處理后HepG2細(xì)胞的侵襲和遷移能力 (結(jié)晶紫染色×100)Figure 4 Invasion and migration of HepG2 cells after different treatment (crystal violet staining,×100)

3 討論

肝癌是全球范圍內(nèi)第三大死亡相關(guān)腫瘤疾病,而肝臟微環(huán)境是肝癌發(fā)生發(fā)展的特殊場所[7,8]。TME是指存在腫瘤或腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞環(huán)境,除含有惡性細(xì)胞外還含有脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞,而腫瘤可經(jīng)過淋巴系統(tǒng)或循環(huán)系統(tǒng)與其存在的微環(huán)境相互作用[9,10]。有研究表明,腫瘤通過募集或調(diào)節(jié)細(xì)胞表型及功能影響TME[10]。MSCs是一種具有多向分化潛能的細(xì)胞,能夠募集到炎癥或腫瘤部位,還可通過分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)腫瘤的增殖和遷移[11,12]。CAFs作為TME中的基質(zhì)細(xì)胞,不僅可以由MSCs等細(xì)胞通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化形成,還可通過IL-6、FGF等分泌因子的作用由正常成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來,而腫瘤細(xì)胞可通過激活CAFs促進(jìn)癌癥的發(fā)展[10,12-14]。目前關(guān)于MSCs向CAFs轉(zhuǎn)化的研究越來越多,有研究表明miR-210參與調(diào)控MSCs向CAFs的轉(zhuǎn)化,促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展,而慢病毒轉(zhuǎn)染后可抑制其轉(zhuǎn)化[15]。有研究發(fā)現(xiàn),在有乳腺癌細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中,在腫瘤細(xì)胞因子的作用下脂肪和骨髓來源的MSCs可轉(zhuǎn)化為CAFs[13]。還有研究發(fā)現(xiàn)肝癌HepG2所分泌的Exosome可促進(jìn)MSCs細(xì)胞內(nèi)CAFs特異性標(biāo)志物α-SMA、波形蛋白(Vimentin)等表達(dá)水平的增加,誘導(dǎo)MSCs向CAFs的轉(zhuǎn)化[16]。

Aurora-A屬于Aurora激酶家族成員之一,在細(xì)胞有絲分裂和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,有研究表明其在包括肝細(xì)胞癌(HCC)在內(nèi)的多種惡性腫瘤中過表達(dá),而抑制其表達(dá)則能有效地逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的惡性表型[17-19]。有研究發(fā)現(xiàn)Aurora-A過表達(dá)可異常激活NF-κB信號通路從而誘導(dǎo)HCC化學(xué)耐藥性的產(chǎn)生[17]。Aurora-A可通過增加甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中CFL-1的非磷酸化活性形式,促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[20]。還有研究發(fā)現(xiàn),Aurora-A不僅可通過激活A(yù)KT/mTOR信號通路來促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖還能增強(qiáng)細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性[21]。有報道稱,慢病毒轉(zhuǎn)染抑制Aurora A表達(dá)后胃癌SGC-7901細(xì)胞的侵襲遷移能力顯著降低[22]。但目前關(guān)于Aurora-A的研究多為其在癌癥中的作用機(jī)制或與其化學(xué)耐藥性相關(guān),而關(guān)于其對肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響是否可能與其參與調(diào)控MSCs向hCAF轉(zhuǎn)化有關(guān)還未可知。CAFs可特定表達(dá)α-SMA、FAP、Vimentin、FSP等生物標(biāo)志物,并且在不同細(xì)胞中這些生物標(biāo)志物的表達(dá)水平有所不同,研究表明,α-SMA、Desmin、FAP、Tsp-1、FSP作為識別CAFs的特異性標(biāo)志物在CAFs單獨培養(yǎng)后仍舊存在[5,23]。有研究表明在hAD-MSCs向CAFs的轉(zhuǎn)化過程中CAFs細(xì)胞內(nèi)α-SMA、FAPA和Vimentin表達(dá)水平顯著增加[15]。本研究發(fā)現(xiàn),hAD-MSCs與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)后hAD-MSCs細(xì)胞中CAF相關(guān)蛋白α-SMA、Desmin、FAP、Tsp-1、FSP表達(dá)水平顯著增加,呈現(xiàn)CAFs表型;而shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染后,hAD-MSCs細(xì)胞中α-SMA、Desmin、FAP、Tsp-1、FSP表達(dá)水平均顯著降低,這表明Aurora-A表達(dá)下調(diào)可抑制hAD-MSCs向CAFs的轉(zhuǎn)化。

此外,研究發(fā)現(xiàn)hAD-MSCs細(xì)胞影響HepG2細(xì)胞惡性化能力,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞高侵襲、遷移能力[24]。本研究發(fā)現(xiàn)與HepG2組相比,hAD-MSCs+HepG2組與NC組HepG2細(xì)胞增殖抑制率顯著降低,而侵襲和遷移能力升高;與hAD-MSCs+HepG2組相比,Aurora-A-shRNA組細(xì)胞增殖抑制率顯著增加,而侵襲和遷移能力下降。這表明hAD-MSCs細(xì)胞可能通過向hCAF轉(zhuǎn)變,改變腫瘤微環(huán)境,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖、轉(zhuǎn)移,而Aurora-A可能在其中發(fā)揮重要作用,即抑制肝癌細(xì)胞中Aurora-A表達(dá)可能通過抑制hAD-MSCs向hCAF轉(zhuǎn)化來抑制肝癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。

綜上所述,Aurora-A低表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用與其抑制hAD-MSCs向CAFs轉(zhuǎn)化有關(guān)。本研究不僅填補(bǔ)了Aurora-A在hAD-MSCs向CAFs轉(zhuǎn)化過程中作用研究的一大空白,而且對Aurora-A在肝癌功能機(jī)制中的進(jìn)一步研究具有重要參考價值,但在hAD-MSCs向CAFs轉(zhuǎn)化過程中Aurora-A是否參與某些信號通路的調(diào)控還需進(jìn)一步研究。