侯 力,孟 峻

(1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教研室,呼和浩特 010059;2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科;*通訊作者,E-mail:nmfrank@163.com)

細(xì)胞周期分為4個(gè)階段,即G1、S、G2、M四期,此周期由細(xì)胞調(diào)控系統(tǒng)控制,細(xì)胞周期蛋白依賴激酶是細(xì)胞調(diào)控系統(tǒng)的核心成分。此外蛋白磷酸化和脫磷酸化之間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控也是至關(guān)重要的。這些與細(xì)胞周期蛋白的合成和降解一起,決定了細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂的順序[1]。細(xì)胞分裂周期蛋白14A(Cdc14A)基因位于1p21染色體上,屬于雙特異性蛋白酪氨酸磷酸酶家族。它是一種重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)磷酸酶,在真核生物G2期阻滯中發(fā)揮重要作用[2-4]。磷酸酶的Cdc14家族是高度保守的,并且Cdc14同源基因已經(jīng)在一些生物體中被鑒定,不同物種中的Cdc14蛋白在定位和功能上有差異,在人類細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的Cdc14同源序列包括CDC14A和CDC14B(hCdc14A和hCdc14B)[5]。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建Cdc14A基因的熒光表達(dá)載體,為研究Cdc14A在小鼠一細(xì)胞期受精卵G2/M期轉(zhuǎn)換作用的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

目的基因通過本實(shí)驗(yàn)室合成。Stbl3感受態(tài)細(xì)胞和真核表達(dá)載體pcDNA3.1-MYC-C購(gòu)自廣州輝駿生物科技有限公司;HEK293細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、XhoⅠ購(gòu)自ThermoScientific;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自GIBOC公司;微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自上海生工B518131-0100;質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自上海生工B518191-0050;PrimeSTAR Max Premix(2X)購(gòu)自Takara R045A;TaKaRa Taq購(gòu)自Takara R001B;ClonExpress Mulit One StepCloning Kit連接酶購(gòu)自諾唯贊C113-2;DNA測(cè)序由生工生物工程上海股份有限公司完成。潔凈工作臺(tái)(AIRTECH,SW-OJ-2F);CO2培養(yǎng)箱CB115(德國(guó)WTB-binder);恒溫空氣振蕩器購(gòu)自上海艾測(cè)電子科技有限公司;電泳儀(君意,JY600E)。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增目的基因 用于目的基因擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)如下:Cdc14A-F:5′-GCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACC-3′,Cdc14A-R:5′-GTAATGAACGTATTCAGACTGAAGG-3′;mcherry-F:5′-CAGTCTGAATACGTTCATTACATGGTGAGCAAGGGC GAGGA-3′,mcherry-R:5′-GGTTTAAACGGGCCCTCTAGACTACTTGTACAGCTCGTCCAT-3′。

以實(shí)驗(yàn)室保存的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-MYC-Cdc14A中的目的基因作為模板,用PrimeSTAR高保真酶擴(kuò)增。反應(yīng)體系共20 μl:模板1 μl;前向引物1 μl;反向引物1 μl;Prime STAR Max(2X) 10 μl;加入無(wú)酶水補(bǔ)充體系至20 μl;95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性20 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,進(jìn)行PCR共30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸3 min的條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。存放于16 ℃。成功擴(kuò)增目標(biāo)片段后進(jìn)行凝膠電泳,與DNA marker比對(duì),目的是確定擴(kuò)增是否成功。紫外燈下,用手術(shù)刀將含有目的基因片段的凝膠條帶切取放至干凈的1.5 ml EP管中,將溶液GB加入離心管中(按100 mg凝膠加100 μl GB溶液的比例)。當(dāng)水浴溫度為60 ℃時(shí),將凝膠放置8-10 min,直到瓊脂糖凝膠完全溶解,且在水浴過程中振蕩3-5次。將其轉(zhuǎn)移到DNA純化柱中,后靜置2 min,然后12 000 r/min離心1 min,棄濾液。加600 μl漂洗液PW(Buffer PW),以12 000 r/min離心1 min,棄濾液。重復(fù)加600 μl PW漂洗液,以12 000 r/min離心1 min,棄濾液。室溫下,離心12 000 r/min 1 min。將柱子置于新的清潔1.5 ml EP管上,接著向柱中心加入35 μl 60 ℃已經(jīng)提前預(yù)熱的無(wú)酶水,離心12 000 r/min 1 min以洗脫出DNA。即得到PCR產(chǎn)物。

1.2.2 目的片段和載體雙酶切 PCR產(chǎn)物15 μl用KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切,pcDNA3.1-MYC-C載體5 μl用KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切。目的片段Cdc14A-mcherry酶切體系共50 μl:10×Buffer 5 μl;目的片段15 μl;KpnⅠ 1.5 μl;XbaⅠ 1.5 μl;補(bǔ)充無(wú)酶水至總體積50 μl,37 ℃條件下進(jìn)行酶切反應(yīng)30 min。pcDNA3.1-MYC-C載體酶切體系共50 μl:10×Buffer 5 μl;pcDNA3.1-MYC-C空載體5 μl;KpnⅠ 1.5 μl;XbaⅠ 1.5 μl;補(bǔ)充無(wú)酶水至總體積50 μl,37 ℃條件下進(jìn)行酶切反應(yīng)30 min。雙酶切后,1%瓊脂糖凝膠電泳30 min,在紫外燈下,用手術(shù)刀將含目的片段和載體的凝膠條帶切取,并放入無(wú)菌1.5 ml EP管中,將DNA目的片段根據(jù)DNA凝膠回收試劑盒的實(shí)驗(yàn)步驟回收,具體操作可參照試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.3 目段片段與載體連接 酶切回收的PCR產(chǎn)物和酶切回收的載體相連接,反應(yīng)體系共20 μl:酶切回收的載體pCDNA3.1-MYC-C 100 ng;酶切回收的目的片段100 ng;5×CEⅡ Buffer 4 μl;ClonExpress Mulit One Step Cloning Kit連接酶2 μl;補(bǔ)充無(wú)酶水至總體積20 μl,37 ℃條件下連接30 min,然后冰浴5 min。

1.2.4 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 取100 μl在冰浴中緩慢融化好的感受態(tài)細(xì)胞Stbl3于EP管中,加入連接產(chǎn)物10 μl,輕輕搖勻,冰浴30 min后于42 ℃水浴熱休克60 s,立即冰浴2 min后加入300 μl LB培養(yǎng)基,混合搖勻,在37 ℃、225 r/min振蕩培養(yǎng)1 h,將菌液在超干凈的工作臺(tái)中均勻地涂布在含有Amp抗生素(100 μg/ml)的LB板上,并在室溫下放置直至液體吸收。然后將倒置的平板在37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1.2.5 菌落PCR鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子 配制菌檢PCR體系共20 μl:挑取單個(gè)菌落;上游引物1 μl;下游引物1 μl;TaKaRa Taq Max 10 μl;加無(wú)酶水補(bǔ)充到總體積為20 μl。按這樣的體系配制混合液,分別加到無(wú)菌的八連管內(nèi),于超凈工作臺(tái)內(nèi),選取單獨(dú)的菌落8個(gè),做好標(biāo)記;用干凈的小槍頭,輕輕碰下平板內(nèi)菌落的一邊,把粘有菌的槍頭,轉(zhuǎn)移到有混合液的管子內(nèi),輕輕搖動(dòng)槍頭,使菌能分散到液體內(nèi),棄掉槍頭。進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件:94 ℃、5 min,94 ℃、30 s,60 ℃、30 s,72 ℃、1 min,共25個(gè)循環(huán),72 ℃、3 min。16 ℃保存。擴(kuò)增完成后,往PCR管中加入2 μl 10×loading Buffer,取10 μl樣品點(diǎn)樣到1%凝膠電泳,并加入5 μl Marker做參照。對(duì)照Marker大小,選取正確的菌落搖菌,測(cè)序。

1.2.6 用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒 通過測(cè)序驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆,安排質(zhì)粒小提。將5 ml培養(yǎng)過夜的菌液放入干凈的離心管中,并在室溫下以12 000 r/min離心2 min,盡可能多地倒出上清液。菌體沉淀中加入250 μl Buffer P1,將菌體沉淀利用渦旋振蕩器完全懸浮;后加入250 μl Buffer P2,將離心管顛倒輕輕混合5-10次,并在室溫下靜置2-4 min,直到溶液變得清亮粘稠;后加入350 μl Buffer P3,立刻輕輕顛倒混勻5-10次,見白色沉淀物產(chǎn)生,在室溫下靜置2 min后,12 000 r/min離心10 min,將所有上清液移到Spin Columns中,放置2 min,以使質(zhì)粒DNA完全結(jié)合到吸附柱的膜上。8 000 r/min離心0.5-1 min,棄去收集管中的液體。將500 μl WashSolution加到Spin Column中,10 000 r/min離心0.5-1 min,棄去收集管中的液體,重復(fù)將500 μl WashSolution加到Spin Column中,10 000 r/min離心0.5-1 min,再次棄去收集管內(nèi)的液體,后以12 000 r/min離心2 min。將離心吸附柱Spin Columns置于無(wú)菌無(wú)酶的1.5 ml離心管中,將50-100 μl的Elution buffer加入到吸附膜的中央,并在室溫下放置2 min。以10 000 r/min離心1 min,離心管底部即質(zhì)粒DNA。

1.2.7 質(zhì)粒酶切鑒定 質(zhì)粒雙酶切體系為20 μl:10×Buffer5 μl;pCDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry 2 μl;KpnⅠ 1 μl;XbaⅠ 1 μl;加無(wú)酶水補(bǔ)充體系至20 μl,37 ℃消化20 min。然后取6 μl 10 000 bp Marker和6 μl產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。1.5%瓊脂糖凝膠電泳后,選擇酶切片段大小與預(yù)期相符合的陽(yáng)性克隆保存并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,質(zhì)粒DNA序列測(cè)定證實(shí)pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry熒光表達(dá)載體構(gòu)建成功。

1.2.8 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 在DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清FBS,10 μg/ml鏈霉素,100 U/ml青霉素)中培養(yǎng)HEK293細(xì)胞。密度達(dá)到80%后,用fuGENG6轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。將HEK293細(xì)胞分散在100 mm培養(yǎng)皿中(2×106個(gè)細(xì)胞/皿,10 ml含有10%FBS培養(yǎng)液/皿)。將pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞。24 h后,細(xì)胞共轉(zhuǎn)染5 μg pCDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry。

1.2.9 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry的表達(dá) 熒光表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48 h后離心,收集目的細(xì)胞,提取總蛋白,檢測(cè)蛋白濃度用BCA試劑盒。配制SDS-PAGE(5%上層濃縮膠和10%下層分離膠);將蛋白樣品和適量上樣緩沖液混勻上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi),每孔上樣約50 μg蛋白質(zhì),電泳條件100 V,90-120 min;300-400 mA,30-60 min濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上;PVDF膜在洗滌液中漂洗3次,每次1-2 min;用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h,漂洗3次;一抗[兔來源的抗Cdc14A單克隆抗體(1 ∶200)]和β-actin抗體[兔來源的抗β-actin單克隆抗體(1 ∶1 000)]4 ℃孵育過夜,次日以TBST洗膜4遍(每遍8 min),然后辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔第二抗體(1 ∶5 000)室溫孵育2 h,TBST漂洗3次;使用ECL試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光,凝膠成像檢測(cè)分析。未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞組、用空載體pcDNA3.1-MYC-C轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞組參照轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry的HEK293細(xì)胞組操作步驟,以anti-β-actin作為內(nèi)參和anti-CDC14A抗體進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 熒光表達(dá)載體pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry的構(gòu)建及鑒定

目的片段Cdc14A-mcherry與pcDNA3.1-MYC-C載體相連接,通過測(cè)序驗(yàn)證目的基因插入正確,測(cè)序結(jié)果見圖1。通過限制性核酸內(nèi)切酶KpnⅠ和XbaⅠ鑒定成功構(gòu)建的熒光表達(dá)載體pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry(見圖2)。電泳結(jié)果顯示:目的基因條帶、載體條帶與預(yù)期片段大小相符,進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的身份是pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry質(zhì)粒。

2.2 熒光表達(dá)載體pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)

Western blotting法結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry熒光表達(dá)載體的HEK293細(xì)胞裂解液在相對(duì)分子質(zhì)量為97 kD附近出現(xiàn)清晰的條帶,未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞、用空載體轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞則未檢測(cè)出。Western blotting法檢測(cè)結(jié)果表明:Cdc14A-mcherry融合蛋白在HEK293細(xì)胞中成功表達(dá)(見圖3)。

MYC標(biāo)簽序列為GAGCAGAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG;ATG之后的基因序列為Cdc14A-mcherry圖1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry的測(cè)序結(jié)果Figure 1 Sequencing result of recombinant plasmid pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry

M.DNA marker DL10 kb;1.雙酶切(KpnⅠ和XbaⅠ)pCDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry質(zhì)粒DNA的產(chǎn)物圖2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry雙酶切結(jié)果Figure 2 Results of double restriction endonuclease digestion of recombinant plasmid pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry

1.未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞;2.空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞;3.轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry的細(xì)胞圖3 蛋白電泳檢測(cè)目的基因表達(dá)結(jié)果Figure 3 Expression of target gene by protein electrophoresis

3 討論

細(xì)胞周期進(jìn)程由不同的蛋白發(fā)揮不同的功能進(jìn)行調(diào)控,是一個(gè)有序的動(dòng)態(tài)的過程,從而保證了生命的延續(xù)。Cdc14作為一種重要的雙特異性蛋白激酶,和其他細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子組成一個(gè)高度相互聯(lián)系的調(diào)控系統(tǒng),在不同的生物體中發(fā)揮著重要作用。哺乳動(dòng)物中Cdc14有兩種亞型:Cdc14A和Cdc14B,它們具有各自特定的作用和功能,可以與磷酸化的絲氨酸或蘇氨酸殘基特異性結(jié)合,并參與了細(xì)胞內(nèi)的大多數(shù)關(guān)鍵生命活動(dòng),包括細(xì)胞周期調(diào)控、減數(shù)分裂、有絲分裂等。此外,Cdc14與DNA復(fù)制、DNA損傷和DNA修復(fù)的關(guān)系也很密切[6,7],人類Cdc14A(hCdc14A)過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期一系列的功能紊亂,比如多極紡錘體,中心粒提早分離、畸形等,hCdc14A下調(diào)的表達(dá)會(huì)引起有絲分裂多種缺陷,包括姐妹染色體不分離,胞質(zhì)不分裂等[8,9]。Schindler等[10]關(guān)于小鼠卵母細(xì)胞的研究表明:在生發(fā)泡(GV)期Cdc14A定位于細(xì)胞核,在生發(fā)泡破裂(GVBD)后Cdc14A聚集在凝集的染色體周圍,在第一次減數(shù)分裂的前期(MⅠ)和第二次減數(shù)分裂的中期(MⅡ)則定位于整個(gè)細(xì)胞質(zhì),同時(shí)并沒有觀察到Cdc14A與微管組織中心的γ-微管蛋白的共定位,在MⅠ到MⅡ之間Cdc14A定位于紡錘體,調(diào)節(jié)小鼠卵母細(xì)胞成熟,促進(jìn)卵母細(xì)胞MⅠ/MⅡ過渡。最近有研究[11-13]表明,哺乳動(dòng)物體內(nèi)的CDC14A磷酸酶活性對(duì)于聽力和雄性生育是至關(guān)重要的。另外,Cdc14A可調(diào)節(jié)初級(jí)纖毛長(zhǎng)度、調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移和黏附[14-16]。通過這些實(shí)驗(yàn)充分證實(shí)了研究Cdc14A是很有必要的。

關(guān)于小鼠Cdc14A熒光表達(dá)載體的構(gòu)建在國(guó)內(nèi)未見報(bào)道,在本實(shí)驗(yàn)中,首先合成帶有熒光標(biāo)記的目的片段Cdc14A-mcherry,然后對(duì)目的片段Cdc14A-mcherry和載體pcDNA3.1-MYC-C進(jìn)行雙酶切,最后將酶切后的目的片段和酶切后的載體相連接,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證熒光表達(dá)載體pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry構(gòu)建成功。利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將測(cè)序驗(yàn)證正確的熒光表達(dá)載體pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞內(nèi),然后進(jìn)行Western blotting,已知Cdc14A和mcherry蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分別為67 kD及30 kD,而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pc-DNA3.1-MYC-Cdc14A-mcherry的HEK293細(xì)胞組在相對(duì)分子質(zhì)量為97 kD附近出現(xiàn)清晰的蛋白電泳條帶,提示利用Cdc14A抗體檢測(cè)的特異性條帶為Cdc14A-mcherry融合蛋白。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞內(nèi)的目的片段成功表達(dá)。此實(shí)驗(yàn)為Cdc14A后續(xù)的相關(guān)研究奠定了良好基礎(chǔ)。