陳 慶,趙金燕,張 雪,公丕軍,趙 艷,薛 翔

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:xgxue@263.net)

宮腔粘連(intrautine adhesion,IUA)也被稱為Asherman綜合征,1948年由Asherman首次報道,其臨床表現(xiàn)為周期性下腹痛、月經(jīng)量減少、閉經(jīng)、反復(fù)流產(chǎn)及不孕等癥狀[1]。IUA主要由子宮內(nèi)膜基底層損傷引起,導(dǎo)致宮腔粘連或瘢痕形成,宮腔或?qū)m頸管部分或完全閉塞[2]。近年來,隨著子宮手術(shù)操作的增多,宮腔粘連的發(fā)生率在我國呈上升趨勢[3],IUA已成為一個導(dǎo)致女性不孕的主要因素。

雖然人們對IUA的病因有所認識,但對于IUA的具體形成機制仍不清楚。雌激素和孕激素是由卵巢分泌的兩種類固醇激素,它們在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜細胞增殖及維持子宮內(nèi)膜正常結(jié)構(gòu)和功能方面具有重要作用[4,5]。研究發(fā)現(xiàn),雌、孕激素受體(ER/PR)與宮腔粘連的發(fā)生密切相關(guān)[6,7],并且雌激素、孕激素治療能增加子宮內(nèi)膜的厚度和體積,臨床上也已采用雌激素作為宮腔粘連分離術(shù)預(yù)防粘連復(fù)發(fā)的手段[8]。但雌、孕激素是否影響宮腔粘連的發(fā)生及其內(nèi)在機制,目前尚無報道。因此,本研究探討雌、孕激素在IUA形成中的作用及機制,對于宮腔粘連的防治具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

ER兔抗人多克隆抗體、PR兔抗人多克隆抗體均購自北京博奧森生物公司;TGF-β、β-actin購自美國Santa Cruz公司;羊抗兔SP試劑盒(武漢博士德公司)。苯甲酸雌二醇(上海通用藥業(yè)),黃體酮(廣州明興制藥廠)。

1.2 組織標(biāo)本

96例宮腔粘連組織標(biāo)本收集于西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科2011年1月至2013年1月因?qū)m腔粘連行宮腔鏡下粘連松解術(shù)的患者,年齡21-43歲,30例正常子宮內(nèi)膜組織收集于同期因不孕行宮腔鏡檢查的非IUA患者,年齡20-43歲,平均(28.5±1.6)歲,標(biāo)本均取自增殖期子宮內(nèi)膜組織。實驗前患者已簽署知情同意書,并取得西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)(2019-倫審-研第020號)。納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)宮腔鏡檢查確診的宮腔粘連患者;②年齡≥20歲;③知情同意并自愿參加研究者。排除標(biāo)準(zhǔn):①近3個月使用雌、孕激素或促性腺激素釋放激素類似物等激素類治療;②懷孕或授乳;③有功能性子宮出血、子宮腺肌癥、子宮內(nèi)膜息肉、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮平滑肌瘤。其中一部分標(biāo)本中性福爾馬林固定,石蠟包埋,以備免疫組化檢測ER、PR,另一部分標(biāo)本液氮保存,以備Western blot檢測ER、PR及TGF-β。

1.3 免疫組化檢測及結(jié)果判定

采用免疫組化SP法檢測,嚴(yán)格安照試劑盒說明書步驟操作。陰性對照以PBS代替一抗。免疫組化結(jié)果判定,依據(jù)陽性細胞數(shù)和染色強度綜合評分[9]。

在油鏡下,按陽性細胞百分比分為5個等級:<10%為0分,10%-25%為1分,25%-50%為2分,50%-75%為3分,≥75%為4分;按染色強度分為4個等級:無著色為0分,淺黃色為1分,黃色為2分,黃褐色為3分。最終評分按如下公式計算:免疫反應(yīng)評分(immunoreactivity score,IRS)=陽性細胞百分比評分×染色強度評分。最后總評分>3定義為陽性染色。

1.4 Western blot檢測ER、PR及TGF-β表達

提取組織或細胞蛋白,BCA法蛋白定量,用SDS-PAGE分離,濕式轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h,一抗(ER兔抗人多克隆抗體1 ∶200;PR兔抗人多克隆抗體1 ∶200;TGF-β兔抗人多克隆抗體1 ∶300)于4 ℃下孵育過夜,室溫下,TBST洗滌,10 min×3次,辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的IgG(1 ∶10 000)室溫下孵育1 h。增強化學(xué)發(fā)光(ECL),X膠片顯影、定影。采用Quantity One軟件進行灰度分析。

1.5 動物模型制備

選擇9-11周齡的健康普通級新西蘭雌兔24只,體質(zhì)量2 000-2 800 g。常規(guī)單籠飼養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境1周后,隨機分為4組:正常生理組、低雌低孕組、低雌高孕組和高雌低孕組,每組6只。低雌低孕組為切除雙側(cè)卵巢,正常生理組僅切除雙側(cè)卵巢周圍的脂肪等組織,低雌高孕組為切除雙側(cè)卵巢后立即開始給予1.0 mg黃體酮,高雌低孕組為切除雙側(cè)卵巢后立即開始給予1.0 mg苯甲酸雌二醇,肌內(nèi)注射,2次/周,持續(xù)4周。低雌低孕組和正常生理組,給予注射生理鹽水。

兩周后在3%戊巴比妥鈉麻醉下,縱行剖開雌兔雙側(cè)子宮宮體部,右側(cè)宮腔于子宮內(nèi)膜與肌層交界處用自制的刮勺盡量刮除內(nèi)膜組織,并于被搔刮宮體的遠端縫扎、切斷剩余的宮體,以避免術(shù)后遠端內(nèi)膜爬行;左側(cè)宮腔僅暴露內(nèi)膜,不行搔刮。術(shù)后縫合雙側(cè)宮腔至正常形態(tài)。繼續(xù)原方案用藥2周,并常規(guī)使用抗生素3 d預(yù)防感染。3%戊巴比妥鈉麻醉,空氣栓塞處死,采集子宮內(nèi)膜組織,4%甲醛固定,以備HE、Masson染色。

1.6 伊紅-蘇木素(H&E)及Masson染色

子宮內(nèi)膜組織用4%甲醛固定,石蠟包埋,之后采用蘇木精-伊紅和Masson常規(guī)染色。參照以下標(biāo)準(zhǔn)進行閱片。HE評分標(biāo)準(zhǔn)[10]:①以正常生理組高倍鏡視野下所含子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目,計為0分;②隨機選取右側(cè)子宮內(nèi)膜切片的4個視野,讀取每高倍鏡視野下子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目并求均值,如腺體數(shù)目相對于正常雌孕激素組減少1%-10%,計1分;減少11%-25%,計2分;減少26%-50%,計3分;減少51%-75%,計4分;減少76%-100%,計5分;(3)類比于以上標(biāo)準(zhǔn),如腺體數(shù)目增加則分別計為-1、-2、-3、-4、-5分。Masson評分標(biāo)準(zhǔn)[10]:①以正常生理組高倍鏡視野下子宮內(nèi)膜中所含膠原纖維成分比例為標(biāo)準(zhǔn),計為0分;②隨機選取各組兔右側(cè)(即搔刮側(cè))子宮內(nèi)膜切片4個視野,讀取每高倍鏡視野下子宮內(nèi)膜中膠原纖維所占比例,如膠原纖維所占比例相對于正常雌孕激素組增加1%-10%,計1分;增加11%-25%,計2分;增加26%-50%,計3分;增加51%-75%,計4分;增加76%-100%。計5分;③類比于以上標(biāo)準(zhǔn),如膠原纖維所占比例減少則分別計為-1、-2、-3、-4、-5分。

子宮內(nèi)膜纖維化包括腺體減少和膠原纖維增加兩個變量,將每只動物HE和Masson染色評分結(jié)果相加,即得出子宮內(nèi)膜纖維化的半定量評分,評分越高提示內(nèi)膜纖維化程度越重。

1.7 細胞培養(yǎng)

子宮內(nèi)膜癌細胞株RL95-2購自中科院上海細胞研究所,采用DMEM高糖培養(yǎng)基,置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細胞分為4組,即對照組(Con)、低雌低孕組(LE+LP)、低雌高孕組(LE+HP)和高雌低孕組(HE+LP)。其中,低雌低孕組給予雌、孕激素各2 nmol/L,低雌高孕組給予2 nmol/L雌激素和15 nmol/L孕激素,而高雌低孕組給予15 nmol/L雌激素和2 nmol/L孕激素。培養(yǎng)72 h后,收獲細胞,提取蛋白于-80 ℃保存。

1.8 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 ER、PR在宮腔粘連組織中的表達

免疫組化染色顯示,ER及PR主要表達在細胞核(見圖1),ER在正常子宮內(nèi)膜及宮腔粘連組織中的陽性率分別為40.0%(12/30)及18.8%(18/96);PR在正常子宮內(nèi)膜及宮腔粘連組織中的陽性率分別為20.0%(6/30)及34.4%(33/96),經(jīng)卡方檢驗,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。進一步Western blot檢測結(jié)果表明,ER在宮腔粘連組織中的表達明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織(0.28±0.04vs0.68±0.03),PR在宮腔粘連組織中的表達則明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織(1.47±0.06vs0.51±0.04),半定量分析后,經(jīng)t檢驗,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。

圖1 ER和PR在IUA組織中的表達 (免疫組化染色,×40)Figure 1 the expression of ER and PR in IUA tissues (HE,×40)

2.2 雌、孕激素對子宮內(nèi)膜纖維化的影響

各組雌兔體內(nèi)雌、孕激素水平有明顯差異,經(jīng)方差分析,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,見表1)。

表1 給藥兩周后兔血清中E2和P的水平

通過HE及Masson染色,兔子宮內(nèi)膜纖維化評分顯示,與正常生理組及低雌低孕組相比,低雌高孕組呈明顯升高,而高雌低孕組呈明顯降低,經(jīng)方差分析,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,見圖3)。

與正常子宮內(nèi)膜比較，*P<0.05圖2 Western blot檢測ER和PR在IUA組織中的表達Figure 2 Expression of ER and PR in IUA tissues measured by Western blot

2.3 TGF-β在宮腔粘連組織的表達

Western blot檢測顯示,與正常子宮內(nèi)膜相比,TGF-β在宮腔粘連組織中的表達明顯升高的,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,見圖4)。采用Pearson相關(guān)分析ER和PR與TGF-β表達的相關(guān)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在宮腔粘連組織中TGF-β與ER的表達呈負相關(guān)(r=-0.88,P<0.01),而與PR的表達呈正相關(guān)(r=0.81,P<0.05,見圖5)。

與正常正常生理組相比較,*P<0.05,**P<0.01圖3 雌、孕激素對兔子宮內(nèi)膜纖維化的影響 (×40)Figure 3 Effect of estrogen and progeston on the endometrial fibrosis of rabbits (×40)

與正常子宮內(nèi)膜組織相比,*P<0.05圖4 Western blot檢測TGF-β在正常子宮內(nèi)膜及IUA組織的表達Figure 4 Expression of TGF-β in normal endometrial and IUA tissues by Western blot

圖5 TGF-β與ER、PR在IUA組織表達的相關(guān)分析Figure 5 Correlation analysis between TGF-β and ER, PR in IUA tissues

2.4 雌、孕激素對TGF-β在子宮內(nèi)膜細胞表達的影響

通過對RL95-2細胞分別給予不同劑量的雌、孕激素刺激72 h后,Western blot檢測顯示,與對照組相比,低雌高孕組RL95-2細胞中TGF-β的表達出現(xiàn)了明顯升高,相反,高雌低孕組則出現(xiàn)了明顯降低,灰度分析后,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖6)。

與對照組相比,*P<0.05圖6 Western blot檢測雌孕激素對TGF-β在RL95-2細胞中表達的影響Figure 6 Effect of estrogen and progeston on the expression of TGF-β in RL95-2 cells by Western blot

3 討論

機械損傷或感染性損傷是IUA發(fā)生的主要危險因素,目前宮腔鏡下經(jīng)宮頸粘連松解術(shù)是臨床治療IUA的首選方案[11]。然而,術(shù)后粘連復(fù)發(fā)率仍較高,尤其是重癥IUA的復(fù)發(fā)率高達20%-62%[12]。因此,闡明IUA形成的分子機制具有重要意義。

ER、PR作為與女性生殖內(nèi)分泌調(diào)節(jié)有關(guān)的重要物質(zhì),與子宮內(nèi)膜的修復(fù)密切相關(guān),在子宮全層中均有表達[13]。本研究首先通過免疫組化及Western blot檢測發(fā)現(xiàn),ER在IUA組織中呈低表達,PR在IUA組織中呈高表達,這一結(jié)果提示ER及PR可能與IUA的形成有關(guān)。雌、孕激素通過特異性識別ER和PR,與ER、PR結(jié)合形成的二聚體將激素信號轉(zhuǎn)化成一系列的化學(xué)反應(yīng),最終調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成以及維持子宮的正常功能[14]。為探討雌、孕激素在IUA形成中的作用,本研究通過動物實驗發(fā)現(xiàn),低雌高孕組子宮內(nèi)膜纖維化評分與正常生理組及低雌低孕組相比明顯升高,而高雌低孕激素組則明顯降低,這表明低雌高孕激素能促進雌兔子宮內(nèi)膜纖維化,相反,高雌低孕激素則抑制雌兔子宮內(nèi)膜纖維化,這表明雌、孕激素在IUA形成中具有重要作用,但其作用可能相反。

TGF-β作為TGF家族中的一員,是目前已知最重要的促纖維形成細胞因子,可由多種細胞產(chǎn)生。TGF-β對細胞的生長、分化、遷移、凋亡及細胞外基質(zhì)的生成均具有調(diào)節(jié)作用,已經(jīng)成為細胞纖維化的重要標(biāo)志[15]。研究發(fā)現(xiàn),TGF-β在許多子宮內(nèi)膜相關(guān)性疾病的發(fā)生中起重要作用,如子宮內(nèi)膜異位癥[16]、子宮內(nèi)膜癌[17]等。本研究通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn),TGF-β在IUA組織中呈高表達,這與以往研究相一致[18,19]。Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),在宮腔粘連組織中TGF-β與PR的表達呈正相關(guān),與ER的表達呈負相關(guān)。這一結(jié)果提示TGF-β表達可能與雌、孕激素有關(guān)。為了進一步驗證雌、孕激素對TGF-β表達的影響,通過體外細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),與對照組相比,低雌高孕激素處理可引起RL95-2細胞中TGF-β表達升高,而高雌低孕激素處理則導(dǎo)致RL95-2細胞中TGF-β的表達降低,這表明雌孕激素影響TGF-β在子宮內(nèi)膜細胞的表達。

綜上所述,本研究表明雌、孕激素可能在IUA的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用,雌激素能抑制宮腔粘連的形成,而孕激素則促進宮腔粘連的形成,其機制與TGF-β的表達有關(guān)。這為宮腔粘連的臨床治療提供了一個潛在靶點,由于雌、孕激素在體內(nèi)的作用是復(fù)雜的。因此,其具體的分子機制尚需今后進一步研究。