孫楠 曲守方 陳樣宜 高飛 張文新 于婷★ 黃杰★

隨著檢測(cè)技術(shù)發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)在臨床被廣泛應(yīng)用于遺傳和腫瘤檢測(cè)領(lǐng)域，如無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)（NIPT）、胚胎植入前遺傳學(xué)篩查與診斷（PGS/PGD）、遺傳病篩查與診斷、腫瘤診斷與治療等［1-4］。目前商業(yè)上常用的二代測(cè)序平臺(tái)根據(jù)測(cè)序原理可分為光學(xué)技術(shù)（Illumina 公司和華大基因公司為代表）和半導(dǎo)體技術(shù)（Thermo 公司為代表）［5-6］。每個(gè)測(cè)序平臺(tái)都有各自的特異性參數(shù)，包括儀器大小、通量、讀長、運(yùn)行時(shí)間及測(cè)序成本等，應(yīng)結(jié)合具體的臨床應(yīng)用需求選擇合適的測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行評(píng)估［7］。不同測(cè)序平臺(tái)之間存在顯著的系統(tǒng)性差異，對(duì)測(cè)序平臺(tái)性能進(jìn)行綜合評(píng)估能夠有效規(guī)范臨床應(yīng)用平臺(tái)的使用和應(yīng)用開發(fā)。為實(shí)現(xiàn)對(duì)第二代測(cè)序儀器性能評(píng)估，中國食品藥品檢定研究院研制了測(cè)序儀性能評(píng)價(jià)用脫氧核糖核酸國家參考品，也制定了高通量基因測(cè)序儀行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。本研究按照制定的高通量基因測(cè)序儀行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的性能指標(biāo)的要求，使用測(cè)序通量＜20 Gb/run 且≥2 Gb/run 高通量基因測(cè)序儀進(jìn)行驗(yàn)證，評(píng)價(jià)該標(biāo)準(zhǔn)的可行性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

測(cè)序儀性能評(píng)價(jià)用脫氧核糖核酸國家參考品，包括四種基因組DNA 樣本，分別是人基因組DNA 樣本（Human_1～3）、大腸桿菌基因組DNA 樣本（Ecoli_1～3）、高GC 含量細(xì)菌基因組DNA 樣本（Olsenella_1～3）、人乳頭瘤病毒11 型基因組DNA樣本（HPV11_1～3），中國食品藥品檢定研究院（簡稱中檢院）提供。

文庫構(gòu)建試劑盒、測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒（半導(dǎo)體法）和BioelectronSeq 4000 基因測(cè)序儀，東莞博奧木華基因科技有限公司提供。

1.2 文庫構(gòu)建

采用文庫構(gòu)建試劑盒（半導(dǎo)體測(cè)序法）對(duì)樣本進(jìn)行文庫制備。先將國家參考品DNA 酶切，接頭連接，進(jìn)行目標(biāo)DNA 片段的PCR 擴(kuò)增，獲得待測(cè)序分析的文庫。使用熒光定量PCR 儀測(cè)定各個(gè)文庫的濃度，按照等物質(zhì)的量混合文庫。

1.3 測(cè)序

采用測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒（半導(dǎo)體法）（S10010）并按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。將一定量的混合文庫，加到測(cè)序芯片上，用Bioelectron-Seq 4000 基因測(cè)序儀，將帶有測(cè)序接頭的DNA 文庫加入乳液擴(kuò)增反應(yīng)體系，使每個(gè)DNA 模板在獨(dú)立的微擴(kuò)增環(huán)境中擴(kuò)增放大，然后將其作為測(cè)序模板載入測(cè)序芯片。將四種脫氧核苷酸分別標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，每一個(gè)循環(huán)添加一種核苷酸，該核苷酸如果被合成到DNA 中會(huì)釋放氫離子，引起溶液pH 值變化從而得到核苷酸序列信息。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序完成后通過生物信息軟件，對(duì)獲得的fastq 數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，使用BWA 軟件，將每個(gè)read與參考序列進(jìn)行比對(duì)，使用軟件GATK Haplotype Caller 對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行變異分析。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序覆蓋率和測(cè)序平均深度

對(duì)于“測(cè)序覆蓋率和測(cè)序平均深度”，標(biāo)準(zhǔn)要求制造商應(yīng)規(guī)定檢測(cè)國家參考品或標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)序覆蓋率和測(cè)序平均深度。制造商規(guī)定的要求為：測(cè)序覆蓋率要求＞95%，測(cè)序平均深度應(yīng)＞100×。結(jié)果表明，測(cè)序覆蓋率為99.99%，測(cè)序平均深度為166×，符合制造商的規(guī)定。

2.2 測(cè)序準(zhǔn)確率

對(duì)于“測(cè)序準(zhǔn)確率”，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定在制造商規(guī)定的測(cè)序覆蓋率和測(cè)序平均深度下，符合以下要求：①檢測(cè)人基因組DNA 參考品或標(biāo)準(zhǔn)品中指定的全外顯子區(qū)域，比對(duì)率應(yīng)符合制造商的要求，與指定全外顯子區(qū)域單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）和插入缺失（Insertion-deletion，Indel）參考數(shù)據(jù)集比較，SNP、Indel 的準(zhǔn)確率和靈敏度應(yīng)符合制造商的要求；②檢測(cè)人基因組DNA 參考品或標(biāo)準(zhǔn)品中指定的全外顯子區(qū)域，比對(duì)率應(yīng)符合制造商的要求，與人基因組DNA 參考序列中指定的全外顯子區(qū)域比對(duì)，測(cè)序一致序列準(zhǔn)確率應(yīng)不低于99.0%；③檢測(cè)細(xì)菌和病毒DNA 參考品，與對(duì)應(yīng)參考序列比對(duì)，測(cè)序一致序列準(zhǔn)確率應(yīng)不低于99.0%。結(jié)果表明，對(duì)國家參考品中人基因組DNA樣本（Human）的比對(duì)率為86.14%，堿基測(cè)序準(zhǔn)確率為98.97%；SNP、Indel 準(zhǔn)確率為95.40%；SNP、Indel靈敏度為85.75%，均符合制造商的要求：比對(duì)率應(yīng)＞80%，堿基測(cè)序準(zhǔn)確率應(yīng)＞95%，SNP、Indel 準(zhǔn)確率應(yīng)＞90%，靈敏度應(yīng)＞80%。對(duì)國家參考品中人基因組DNA 樣本的一致序列準(zhǔn)確率為99.94%，符合制造商的一致序列準(zhǔn)確率＞99.0%要求。對(duì)國家參考品中人乳頭瘤病毒11 型基因組DNA 樣本（HPV11）、大腸桿菌基因組DNA 樣本（E.coli）、高GC 含量細(xì)菌基因組DNA 樣本（Olsenella），HPV11的測(cè)序一致序列準(zhǔn)確率為100%；E.coli 的準(zhǔn)確率為99.95%；Olsenella 的準(zhǔn)確率為99.88%，均符合制造商的一致序列準(zhǔn)確率＞99.0%要求。

將下機(jī)數(shù)據(jù)分別與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)比對(duì)率和錯(cuò)配率，進(jìn)而計(jì)算出堿基準(zhǔn)確率（1-錯(cuò)配率），將人基因組樣本的數(shù)據(jù)與人類參考基因組hs37d5 使用BWA 比對(duì)，然后使用GATK Haplotype Caller 對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行變異分析獲得檢測(cè)的變異數(shù)據(jù)集，最后分析該數(shù)據(jù)集在27 Mb 外顯子區(qū)域的結(jié)果與高置信變異集的比對(duì)一致性情況，將大腸桿菌E.coli，高GC 菌Olsenella 和HPV-11 下機(jī)數(shù)據(jù)與各自基因組的一致性序列比對(duì)。見圖1。

圖1 國家參考品比對(duì)結(jié)果Figure 1 Mapped results of national reference materials

人基因組樣本數(shù)據(jù)與人類參考基因組hs37d5進(jìn)行比對(duì)和變異檢測(cè)，與高置信變異標(biāo)準(zhǔn)集進(jìn)行比較，變異評(píng)估結(jié)果見表1和圖2。

圖2 外顯子27M 區(qū)域人基因組樣本的變異評(píng)估結(jié)果Figure 2 Variation assessment results of human genome samples from exon 27M region

2.3 重復(fù)性

對(duì)于“重復(fù)性”，取國家參考品進(jìn)行三次重復(fù)測(cè)序，每次結(jié)果均符合“測(cè)序覆蓋率和測(cè)序平均深度”和“測(cè)序準(zhǔn)確率”要求，結(jié)果見圖1、表1。

表1 外顯子27M 區(qū)域人基因組樣本的變異評(píng)估結(jié)果Table 1 Variation assessment results of human genome samples from exon 27M region

3 討論

傳統(tǒng)的化學(xué)降解法、雙脫氧鏈終止法以及在它們的基礎(chǔ)上發(fā)展來的測(cè)序技術(shù)統(tǒng)稱為第一代測(cè)序。它在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮了重要的作用，如人類基因組計(jì)劃。第二代測(cè)序主要包括羅氏454 公司的454 測(cè)序技術(shù)、Illumina 公司的Solexa 測(cè)序技術(shù)和Life Technologies 公司的Ion Torrent 測(cè)序技術(shù)［8-10］。與傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)相比，二代測(cè)序技術(shù)的核心思想是邊合成邊測(cè)序，具有高通量、低成本等優(yōu)點(diǎn)。

許多公司進(jìn)行了高通量測(cè)序儀的開發(fā)和應(yīng)用。但是目前尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)高通量測(cè)序儀的性能及使用進(jìn)行規(guī)范，對(duì)其臨床上的風(fēng)險(xiǎn)不易把控，所以亟需研制相應(yīng)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其性能進(jìn)行評(píng)估。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的制定將有助于提高并統(tǒng)一產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)［11-12］。中國食品藥品檢定研究院制定了高通量基因測(cè)序儀行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)過對(duì)各測(cè)序指標(biāo)的篩選、比較與分析，最后確定了符合高通量基因測(cè)序儀的評(píng)價(jià)指標(biāo)，包含測(cè)序讀長和通量、堿基識(shí)別質(zhì)量百分比、測(cè)序覆蓋率和測(cè)序平均深度、測(cè)序準(zhǔn)確率、重復(fù)性、軟件功能、安全要求、環(huán)境試驗(yàn)要求和電磁兼容性要求等。鑒于不同測(cè)序平臺(tái)因?yàn)槠錅y(cè)序原理和技術(shù)手段不同，具有不同的測(cè)序平均讀長。測(cè)序平均讀長過短會(huì)影響后續(xù)拼接、組裝和比對(duì)等，從而影響測(cè)序效果。因此需要對(duì)測(cè)序讀長這一指標(biāo)加以規(guī)范。測(cè)序通量也是代表性的指標(biāo)之一，因?yàn)楦咄繙y(cè)序區(qū)別于一代Sanger 測(cè)序的明顯差別之一就在于其測(cè)序通量。而測(cè)序準(zhǔn)確率這一指標(biāo)，可以最直觀的表現(xiàn)每次測(cè)序結(jié)果的精確程度，其對(duì)高通量基因測(cè)序結(jié)果評(píng)價(jià)具有重要意義。

二代基因測(cè)序技術(shù)檢出數(shù)據(jù)量非常龐大，要借助生物信息學(xué)分析，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行初步分析。研究表明在進(jìn)行Indel 分析時(shí)，由于Indel 存在導(dǎo)致Indel 周邊堿基的測(cè)序質(zhì)量會(huì)有所降低，從而對(duì)Indel 的檢出以及可靠性評(píng)估都會(huì)造成較大影響［13］。在測(cè)序一致序列準(zhǔn)確率均不低于99.0%的情況下，在SNP、Indel 的準(zhǔn)確率和靈敏度存在較大的差別，主要是平臺(tái)本身的技術(shù)原理和技術(shù)性能決定的。本研究的一致序列準(zhǔn)確率是計(jì)算平臺(tái)在所有覆蓋區(qū)域上的主要堿基與參考序列一致的占比，次要堿基不列入統(tǒng)計(jì)，次要堿基可能為測(cè)序錯(cuò)誤，也可能為真實(shí)存在的變異。本研究的平臺(tái)采用GATK Haplotype Caller 軟件獲得SNP 和Indel，該軟件對(duì)某位置上存在兩種以上的堿基時(shí)，會(huì)用隱馬爾科夫模型在給定的read 數(shù)據(jù)下，計(jì)算各單倍型的進(jìn)行最大似然值，給出可信變異的列表。因此在平均深度為100×的測(cè)序中，測(cè)序有效覆蓋區(qū)域的一致序列準(zhǔn)確率可以達(dá)到99.0%甚至99.9%的水平。半導(dǎo)體測(cè)序法的特點(diǎn)是快速實(shí)時(shí)讀取堿基，堿基準(zhǔn)確率相比基于熒光信號(hào)識(shí)別堿基的高通量測(cè)序平臺(tái)稍差，特別是連續(xù)相同堿基（homopolymer）的區(qū)域測(cè)序獲得的錯(cuò)配堿基部分為可重復(fù)的情況，在未進(jìn)行系統(tǒng)性校正的情況下容易超過軟件統(tǒng)計(jì)模型設(shè)定的閾值，從而導(dǎo)致準(zhǔn)確性和靈敏度下降。Ion Proton 平臺(tái)一般采用擴(kuò)增子法進(jìn)行文庫構(gòu)建。SNP 僅是單個(gè)堿基的變化，因此對(duì)于PCR 擴(kuò)增的影響極小，但I(xiàn)ndel 一般是多個(gè)堿基的插入或者缺失，若發(fā)生Indel 的位置與PCR 引物的位置有交叉時(shí)，則極有可能導(dǎo)致擴(kuò)增失敗，Indel 的擴(kuò)增失敗率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于SNP，導(dǎo)致其準(zhǔn)確性和靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于SNP。比對(duì)基因組主要是觀察測(cè)序序列與參考序列的相似程度，擴(kuò)增子長度在200 bp 左右，SNP 的單個(gè)堿基變化導(dǎo)致測(cè)序序列與參考序列的差別是非常小的。但是Indel的十幾個(gè)堿基的插入與缺失，使測(cè)序序列與參考序列的差別大幅增加，增加了基因組比對(duì)的困難，導(dǎo)致Indel 的reads 被丟棄。因此在生信分析比對(duì)基因組過程中也會(huì)導(dǎo)致Indel 的準(zhǔn)確性和靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于SNP。實(shí)際臨床應(yīng)用中，可采用基于半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)測(cè)序偏好的相關(guān)分析方法如TMAP 和TVC 配套軟件，準(zhǔn)確性可提高至97%；或者開發(fā)基于特定基因位點(diǎn)變異模式的貝葉斯分析方法，降低測(cè)序錯(cuò)誤的影響，提高檢測(cè)性能。國家參考品中增加了SNP、Indel 的準(zhǔn)確率和靈敏度的要求，但并未對(duì)平臺(tái)進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)定，要求制造商給出各自平臺(tái)的具體要求。這一評(píng)價(jià)方式和國際上評(píng)價(jià)測(cè)序儀的方式一致。

本研究采用BioelectronSeq 4000 基因測(cè)序儀按照高通量基因測(cè)序儀行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)國家參考品進(jìn)行檢驗(yàn)，測(cè)序通量＜20 Gb/run 且≥2 Gb/run。驗(yàn)證結(jié)果顯示符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)序覆蓋率和測(cè)序平均深度、測(cè)序準(zhǔn)確率和重復(fù)性的要求，表明該行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)具有很好的適用性，可以用于高通量測(cè)序儀的性能評(píng)價(jià)和上市后的監(jiān)督管理工作。