王亞茹, 田寶玉, 張碧堯, 范競(jìng)文, 戈 峰, 王國(guó)紅,*

1 福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,細(xì)胞逆境響應(yīng)與代謝調(diào)控福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州 350108 2中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所,農(nóng)業(yè)蟲(chóng)害鼠害綜合治理研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100101

昆蟲(chóng)腸道中定殖著大量的微生物,在昆蟲(chóng)食物消化和營(yíng)養(yǎng)代謝中發(fā)揮著重要的功能,是調(diào)控宿主生物學(xué)性狀和生態(tài)適應(yīng)性的重要因素[1- 2]。大量的研究結(jié)果表明,昆蟲(chóng)腸道微生物數(shù)量和組成與宿主的食物密切相關(guān)。一方面,腸道微生物是宿主食物分解和消化的主要參與者,為宿主提供碳水化合物、維生素、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)和能量；另一方面,食物的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成又影響腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能[2]。采用桑葉飼養(yǎng)的家蠶(Bombyxmori),其腸道微生物種群比較一致,而采用不同人工飼料飼養(yǎng)的家蠶的腸道優(yōu)勢(shì)菌群有差異；相比于人工飼料,桑葉飼養(yǎng)的家蠶腸道微生物菌群更為豐富[3]。取食人工飼料和不同植物的小菜蛾(Plutellaxylostella)腸道細(xì)菌群落存在顯著差異,小菜蛾腸道菌群在群落結(jié)構(gòu)和代謝功能兩方面均能協(xié)助宿主昆蟲(chóng)適應(yīng)不同的食物[4]。因此,食物是決定昆蟲(chóng)腸道微生物種類(lèi)和組成的重要因素之一[4- 6]。

蟑螂是雜食性昆蟲(chóng),不同種類(lèi)的蟑螂食性有一定的差異,食物的成分和含量對(duì)蟑螂的引誘、腸道菌群、營(yíng)養(yǎng)和代謝產(chǎn)生影響[2,5,7- 8]。在發(fā)展蟑螂餌劑的研究中發(fā)現(xiàn)：餌料的營(yíng)養(yǎng)組分是影響蟑螂取食量的重要因素, 蟑螂優(yōu)先選擇蛋白含量較高的餌劑[9]。本文前期研究也表明：餌料的蛋白含量影響德國(guó)小蠊雄成蟲(chóng)氮素營(yíng)養(yǎng)利用效率。取食含25%—45%蛋白的餌料時(shí),有利于雄成蟲(chóng)氮素營(yíng)養(yǎng)利用；而高蛋白含量(65%)餌料增加德國(guó)小蠊代謝負(fù)擔(dān),不利于對(duì)食物的利用[7]。餌料蛋白水平過(guò)高也導(dǎo)致德國(guó)小蠊腸道菌群多樣性、交配成功率和繁殖能力的下降[6, 8]。Yun 等發(fā)現(xiàn)野生德國(guó)小蠊與實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)的德國(guó)小蠊相比,其腸道細(xì)菌具有更豐富的多樣性,原因可能在于野生蟑螂食物高度多樣化,多樣化的食物能夠提供蟑螂腸道細(xì)菌代謝所需的不同底物[10]。眾所周知,蛋白質(zhì)和氨基酸是昆蟲(chóng)食物的主要氮素營(yíng)養(yǎng),是影響宿主腸道微生物的主要因素[11- 12]。利用人工飼料飼養(yǎng)美洲大蠊(Periplanetaamericana)有利于擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)細(xì)菌的生長(zhǎng)；不同飼料組成可以調(diào)節(jié)腸道細(xì)菌的群落組成和物種多樣性；美洲大蠊取食高纖維食料時(shí),厚壁菌門(mén)細(xì)菌數(shù)量顯著增加；而取食高蛋白食料時(shí),則促進(jìn)其他細(xì)菌種群數(shù)量的增加[13-14]。利用不同蛋白含量的餌料喂養(yǎng)德國(guó)小蠊(Blattellagermanica)的雌蟲(chóng),Pérez-Cobas 等發(fā)現(xiàn)菌群組成與特定的食物有關(guān),腸道菌群在蟑螂氮源營(yíng)養(yǎng)代謝中發(fā)揮重要的作用[6]。已有研究發(fā)現(xiàn)：昆蟲(chóng)不同蟲(chóng)態(tài)和性別間腸道菌群有差異[15-16]。如?；页嵋苟?Spodopteralittoralis)雌性成蟲(chóng)腸道以腸球菌屬(Enterococcus)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)和泛菌屬(Pantoea)為主；雄性成蟲(chóng)則不同,其腸道菌群幾乎全部由克雷伯氏桿菌屬構(gòu)成[15]。但是,蟑螂食性復(fù)雜,導(dǎo)致其腸道菌群的可塑性強(qiáng),食物對(duì)蟑螂腸道菌群的調(diào)控能力和機(jī)制還不清楚[17]。不同蛋白水平餌料的影響在德國(guó)小蠊雄、雌蟲(chóng)之間是否有差異,以及影響的主要菌群及其代謝功能,目前并不清楚。

昆蟲(chóng)的腸道環(huán)境特殊,微生物種群復(fù)雜,其中含有大量的目前難以培養(yǎng)的微生物。因此,傳統(tǒng)的體外純培養(yǎng)技術(shù)嚴(yán)重低估了腸道微生物的多樣性[18]?；诖?目前有關(guān)昆蟲(chóng)腸道微生物的研究,大都采用基于高通量測(cè)序的技術(shù)手段,可以更詳盡深入地分析腸道微生物的種類(lèi)、群落組成及變化[1- 2]。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)分析德國(guó)小蠊腸道細(xì)菌16S rRNA基因的V4區(qū),鑒定德國(guó)小蠊雄成蟲(chóng)腸道菌群的多樣性,評(píng)估不同蛋白質(zhì)水平餌料對(duì)德國(guó)小蠊雄成蟲(chóng)腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能的影響,進(jìn)一步探討德國(guó)小蠊雄成蟲(chóng)腸道菌群功能,為蟑螂的誘捕和生物防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試蟲(chóng)飼養(yǎng)

德國(guó)小蠊由廣東省疾病預(yù)防控制中心贈(zèng)送。蟑螂的飼養(yǎng)參照張碧堯等[7]和Wang等[19]的方法進(jìn)行。

1.2 餌料配置

蟑螂餌料的配制在Hamilton等[20]和張碧堯等[7]方法的基礎(chǔ)上加以修改?？上奶妓衔餅楹?將除含蛋白質(zhì)成分外的所有干燥成分與 200 mL蒸餾水混合加熱直至沸騰。待冷卻至 50℃后加入酪蛋白和酵母(防止蛋白質(zhì)變性),同時(shí)連續(xù)攪拌以防止凝結(jié)。將餌料倒入培養(yǎng)皿中,室溫冷卻數(shù)小時(shí),在50℃下將餌料干燥一周,儲(chǔ)存在干燥器中。最終制成蛋白質(zhì)含量分別為5%和65%的人工餌料。蟑螂種群繁殖餌料為鼠糧(粗蛋白含量為25%),購(gòu)自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司。

1.3 德國(guó)小蠊雄成蟲(chóng)飼養(yǎng)

將剛羽化的德國(guó)小蠊雄成蟲(chóng)單獨(dú)飼養(yǎng)試驗(yàn)盒中(直徑50 mm,高250 mm)使用鼠糧25%蛋白(CD1)、5%蛋白(LP2)、65%蛋白(HP3)等不同的餌料連續(xù)飼喂 21 d后,饑餓 24 h以去除非常駐細(xì)菌[11, 21]。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4 德國(guó)小蠊腸道基因組DNA的提取及檢測(cè)

取饑餓雄蟲(chóng)用75%的酒精對(duì)蟲(chóng)體表面消毒3次,每個(gè)重復(fù)3次,每次3 min,再用無(wú)菌生理鹽水清洗5遍。在無(wú)菌生理鹽水中解剖蟲(chóng)體,仔細(xì)分離出腸道,置于一個(gè)已滅菌的1.5 ml的離心管中,保存于-80℃冰箱中待用。采用 CTAB方法提取樣本的基因組 DNA,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的大小和完整度,并保存于-80℃冰箱中用于下一步高通量測(cè)序[6]。

1.5 德國(guó)小蠊腸道細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)的高通量測(cè)序

以提取的德國(guó)小蠊腸道基因組總DNA為模板,選擇融合測(cè)序引物和barcode序列的細(xì)菌通用引物(515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA- 3′；806R: 5′-GGACTACHVGGGTWTC TAAT- 3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V4可變區(qū)。利用New England Biolabs 公司的 Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進(jìn)行PCR,確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。PCR反應(yīng)體系(30 μL)：Phusion Master Mix(2 x) 15 μL,正向引物1.5 μL,反向引物1.5 μL,基因組DNA(1 ng/μL)10 μL,H2O 2 μL。反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性1 min；30個(gè)循環(huán)包括(98℃,10 sec；50℃,30 sec；72℃,30 sec)；72℃,5 min。根據(jù)濃度將不同樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行等摩爾濃度混樣,充分混勻后使用1xTAE濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR產(chǎn)物,選擇主帶大小在400—450 bp之間的序列,割膠回收目標(biāo)條帶。使用Thermofisher公司的lon Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit 定量和文庫(kù)檢測(cè)合格后,使用Thermofisher的lon S5TMXL進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.6 生物信息學(xué)分析

1.6.1測(cè)序數(shù)據(jù)分析

使用Cutadapt(V1.9.1)[22]先對(duì)reads進(jìn)行低質(zhì)量部分剪切,再根據(jù)Barcode從得到的reads中拆分出各樣品數(shù)據(jù),截去Barcode和引物序列,初步質(zhì)控得到原始數(shù)據(jù)(Raw reads) 經(jīng)過(guò)以上處理后得到的Reads需要進(jìn)行去除嵌合體序列的處理,Reads序列通過(guò)vsearch(https://github.com/torognes/vsearch/)與物種注釋數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)嵌合體序列,并最終去除其中的嵌合體序列,得到最終的有效數(shù)據(jù)(Clean Reads)。

1.6.2OTU聚類(lèi)和物種注釋

利用Uparse軟件(v7.0.1001)[23]對(duì)所有樣品的全部 Clean Reads 進(jìn)行聚類(lèi),默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類(lèi)成為OTUs(Operational Taxonomic Units),同時(shí)選取OTUs的代表性序列,依據(jù)其算法原則,篩選OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。 對(duì)OTUs序列進(jìn)行物種注釋,用Mothur方法[24]與SILVA132的SSU rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)[25]進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8—1),獲得分類(lèi)學(xué)信息并分別在各個(gè)分類(lèi)水平：kingdom(界),phylum(門(mén)),class(綱),order(目),family(科),genus(屬),species(種)統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。使用MUSCLE(Version 3.8.31)軟件[23]進(jìn)行快速多序列比對(duì),得到所有OTUs序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。最后對(duì)各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理,以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理,后續(xù)的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。

1.6.3德國(guó)小蠊腸道細(xì)菌多樣性分析

基于得到的OTU表,使用VennDiagram包繪制Venn圖揭示樣品間共有的OTUs。使用Qiime軟件包(Version 1.9.1)計(jì)算各個(gè)樣品的Alpha多樣性并繪制OTU稀釋曲線。Alpha多樣性用來(lái)衡量樣品內(nèi)的物種多樣性和豐度差異,主要通過(guò)Observed-OTUs,Chao1,Shannon,Simpson,ACE,Goods-coverage,PD-whole-tree等指標(biāo)來(lái)表達(dá)。使用R軟件(Version 2.15.3)進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析。采用QIIME進(jìn)行基于unifrac距離矩陣的β-多樣性并繪制NMDS圖來(lái)評(píng)估樣本間的相似度及不同樣本群落組成相似性和差異。LEfSe分析使用LEfSe軟件,默認(rèn)設(shè)置LDA Score的篩選值為4。

1.6.4功能注釋

基于微生物群落組成的功能預(yù)測(cè)參照Kakumanu等[26]和王天召等[27]的方法。測(cè)序樣品以SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)序列為參考序列聚類(lèi)出OTU,進(jìn)而獲取功能注釋信息。利用BLASTN算法將其比對(duì)到SILVA SSU Ref NR 數(shù)據(jù)庫(kù)(BLAST bitscore >1500)建立相關(guān)矩陣,將通過(guò)UProC和PAUDA兩種方法注釋的KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)原核生物全基因組功能信息對(duì)應(yīng)到SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)中,實(shí)現(xiàn)SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋。

2 結(jié)果

2.1 德國(guó)小蠊腸道細(xì)菌16S rDNA測(cè)序結(jié)果處理和統(tǒng)計(jì)

OTU是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)的研究中,給某一個(gè)分類(lèi)單元(屬、種和分組等)設(shè)置的一個(gè)標(biāo)志,通常相似度為97%以上可以分為一個(gè) OTU。對(duì)不同蛋白水平處理組德國(guó)小蠊腸道細(xì)菌有效測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),總測(cè)序標(biāo)簽為724954條,平均標(biāo)簽數(shù)80550.4條,測(cè)序數(shù)目較大,可以充分保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。其中CD1.2的總標(biāo)簽最多,為84195條(表1)。采用對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣,以抽到的序列數(shù)與它們所代表的OTU數(shù)目構(gòu)建德國(guó)小蠊腸道細(xì)菌高通量測(cè)序結(jié)果的稀釋性曲線(圖1)。從圖1可以看出物種稀釋曲線趨向于平行,表明目前獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)量合理,能夠反映德國(guó)小蠊腸道細(xì)菌的多樣性。

表1 德國(guó)小蠊腸道細(xì)菌16S rDNA測(cè)序有效數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

圖1 德國(guó)小蠊腸道細(xì)菌物種稀釋曲線 Fig.1 Observed species rarefaction curves of the intestinal bacteria in B. germanicaCD1: 鼠糧飼喂德國(guó)小蠊組; LP2: 5%蛋白餌料飼養(yǎng)組; HP3: 65%蛋白餌料飼養(yǎng)組

2.2 德國(guó)小蠊腸道細(xì)菌的群落組成和豐度

基于OTUs注釋結(jié)果,所測(cè)樣本在門(mén)水平分布最多的優(yōu)勢(shì)菌為擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、梭桿菌門(mén)(Fusobacteria)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)。CD1組的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén),相對(duì)豐度依次為46.61%、38.33%和8.43%。LP2組的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén),相對(duì)豐度依次為71.39%、10.17%和13%。HP3組優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、梭桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén),相對(duì)豐度依次為50.56%、18.4%、15.6%和9.75%。其中CD1組脫鐵桿菌門(mén)(Deferribacteres)豐度顯著低于LP2(df1,2=1,4,F=16.394,P<0.05),HP3組梭桿菌門(mén)豐度顯著高于其他兩組(df1,2=2,6,F=29.238,P<0.05)(圖2)。

在科的水平上,德國(guó)小蠊腸道菌群共檢測(cè)到可鑒定的細(xì)菌10個(gè)科。這些類(lèi)群的細(xì)菌在3個(gè)處理的樣本中均有出現(xiàn)。CD1組相對(duì)豐度大于5%的優(yōu)勢(shì)菌科分別是黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)、(unidentified Bacteroidales)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)、脫硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)和(Tannerellaceae),相對(duì)豐度依次為27.94%、16.02%、7.04%、6.97%和6.71%。LP2組相對(duì)豐度大于5%的優(yōu)勢(shì)菌科是擬桿菌科、理研菌科(Rikenellaceae)和(Tannerellaceae),相對(duì)豐度依次為47.44%、5.87%和5.84%。HP3組相對(duì)豐度大于5%的優(yōu)勢(shì)菌科是擬桿菌科、黃單胞菌科、梭桿菌科(Fusobacteriaceae)和(unidentified Bacteroidales),相對(duì)豐度依次為23.97%、15.55%、6.44%和6.19%。其中CD1組擬桿菌科豐度顯著低于HP3組(df1,2=1,4,F=32.996,P<0.05),HP3組梭桿菌科豐度顯著高于其他兩組(df1,2=2,6,F=31.618,P<0.05)(圖3)。

圖 2 德國(guó)小蠊腸道細(xì)菌門(mén)水平上的物種相對(duì)豐度Fig.2 Histogram of relative abundance of the intestinal bacteria in B. germanica at the phylum level

圖3 德國(guó)小蠊腸道細(xì)菌科水平上的物種相對(duì)豐度Fig.3 Histogram of relative abundance of the intestinal bacteria in B. germanica at the family level

在屬的水平上,德國(guó)小蠊腸道菌群主要由擬桿菌屬(Bacteroides) 、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、營(yíng)發(fā)酵單胞菌屬(Dysgonomonas)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、另枝菌屬(Alistipes)、蟑螂桿狀體屬(Blattabacterium)等組成。CD1組相對(duì)豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)菌屬為寡養(yǎng)單胞菌屬、營(yíng)發(fā)酵單胞菌屬、擬桿菌屬、脫硫弧菌屬、另枝菌屬和塞巴魯?shù)率暇鷮?Sebaldella),相對(duì)豐度依次為27.94%、11.15%、7.04%、6.85%、2.97%和1.21%。其他未鑒定的細(xì)菌占比38.97%。在LP2組中,擬桿菌屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),其相對(duì)豐度為47.44%。相對(duì)豐度大于1%的還有另枝菌屬、脫硫弧菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、營(yíng)發(fā)酵單胞菌屬、(CandidatusSoleaferrea)、(Erysipelatoclostridium)和梭桿菌屬,相對(duì)豐度分別為4.75%、3.74%、3.39%、3.33%、1.93%。1.91%和1.76%；未鑒定的細(xì)菌占比為29.19%。HP3組相對(duì)豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)菌屬為擬桿菌屬、梭桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、脫硫弧菌屬、另枝菌屬、營(yíng)發(fā)酵單胞菌屬、蟑螂桿狀體屬、(unidentifiedBurkholderiaceae),其相對(duì)豐度依次為23.97%、15.54%、6.43%、4.37%、3.12%、2.91%、2.17%和1.47%。其他未鑒定的細(xì)菌占比為32.98%。CD1組與LP2組相比,營(yíng)發(fā)酵單胞菌屬豐度顯著高于后者(df1,2=1,4,F=10.137,P<0.05)；CD1組擬桿菌屬豐度顯著低于HP3組(df1,2=1,4,F=32.996,P<0.05)；HP3組梭桿菌屬豐度極顯著高于其他兩組(df1,2=2,6,F=31.6,P<0.01)(圖4)。

圖4 德國(guó)小蠊腸道細(xì)菌屬水平上的物種相對(duì)豐度Fig.4 Histogram of relative abundance of the intestinal bacteria in B. germanica at the genus level

OTUs分析表明CD1組有814個(gè) OTUs,LP2組有785個(gè)OTUs, HP3組有881 OTUs。維恩圖分析發(fā)現(xiàn)CD1組和LP2組共有657個(gè)的 OTUs,CD1組和 HP3組共有665個(gè)OTUs,LP2組和 HP3組共有655個(gè)OTUs,3組樣本共有的 OTUs數(shù)目為585個(gè),三個(gè)處理組的菌群具有很高的相似性,表明盡管不同的蛋白質(zhì)餌料飼育對(duì)腸道菌群有明顯影響,但主要菌群保持較高的穩(wěn)定性(圖5)。

圖5 德國(guó)小蠊腸道細(xì)菌venn圖Fig.5 Venn diagram of the intestinal bacteria in B. germanica圖中數(shù)字表示德國(guó)小蠊腸道細(xì)菌的數(shù)目

2.3 德國(guó)小蠊腸道細(xì)菌多樣性特征

Alpha 多樣性統(tǒng)計(jì)如表2,ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)反映樣品中群落的豐富度,數(shù)值越大,群落豐富度越高; Shannon指數(shù)越高和Simpson指數(shù)越低反映群落的多樣性越高。該結(jié)果表明這三種餌料喂養(yǎng)德國(guó)小蠊腸道菌群具有高的物種多樣性和豐富度,但三組餌料之間沒(méi)有顯著差異。

表2 德國(guó)小蠊腸道細(xì)菌α多樣性指數(shù)

基于Bray-Curtis相似性系數(shù)的NMDS分析發(fā)現(xiàn),3組處理的三個(gè)平行樣本分布較為離散,說(shuō)明3組樣品組間物種群落相似性系數(shù)較低,但HP3組與另外兩組的距離更遠(yuǎn),表明高蛋白處理樣本與低蛋白處理(小于25%)樣本的腸道菌群組成具有較大的差異(圖6)。

圖6 德國(guó)小蠊腸道細(xì)菌的NMDS圖Fig.6 NMDS diagram of the intestinal bacteria in B. germanicaNMDS: 非度量多維尺度分析Non-metric multidimensional scaling

2.4 德國(guó)小蠊腸道細(xì)菌組間物種差異

LDA值分布柱狀圖展示了德國(guó)小蠊雄成蟲(chóng)腸道細(xì)菌3組樣本中在豐度上具有明顯差異的物種。分析表明,在CD1組中豐度上有明顯差異的物種為變形菌門(mén)(Proteobacteria)和包西氏菌屬(Bosea)。LP2組在豐度上有明顯差異的物種為(Lamiaceae)、(unidentified Acidimicrobiia)和(Lamia)。HP3組豐度上有明顯差異的物種為梭桿菌科(Fusobacteriaceae)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、變異梭桿菌(Fusobacteriumvarium)；伯克霍爾德科(Burkholderiaceae)以及(unidentified Gammaproteobacteria)(圖7)。

圖7 LEfSe分析德國(guó)小蠊腸道細(xì)菌分類(lèi)差異Fig.7 LEFSe analysis of the intestinal bacteria in B. germanica

2.5 德國(guó)小蠊腸道細(xì)菌的功能預(yù)測(cè)

運(yùn)用Tax4Fun技術(shù),在德國(guó)小蠊雄成蟲(chóng)腸道樣品中共發(fā)現(xiàn)了44個(gè)基因簇。腸道細(xì)菌菌群功能基因和代謝途徑分析表明,KEGG代謝通路中德國(guó)小蠊腸道細(xì)菌編碼的大多數(shù)基因與其代謝功能有關(guān)。在發(fā)現(xiàn)的基因簇中,優(yōu)勢(shì)基因簇包括代謝(Metabolism)、遺傳信息處理(Genetic Information processing)和環(huán)境信息處理(Environmental information processing)(圖8)。選取豐度排名前35的功能及它們?cè)诿總€(gè)樣品中的豐度信息繪制熱圖,并從功能差異層面進(jìn)行聚類(lèi)(圖9),HP3組腸道菌群能量代謝基因的相對(duì)豐度極顯著高于CD1組(df1,2=1,4,F=102.86,P<0.01),外源性物質(zhì)代謝與降解基因的相對(duì)豐度極顯著高于LP2組(df1,2=1,4,F=19.973,P<0.01),其他氨基酸代謝基因的相對(duì)豐度顯著高于LP2 組(df1,2=1,4,F=16.564,P<0.05)。

圖8 KEGG通路Fig.8 KEGG pathway

圖9 Tax4Fun功能注釋聚類(lèi)熱圖Fig.9 Tax4Fun functional annotation clustering heat map

3 討論

德國(guó)小蠊雄成蟲(chóng)腸道菌群門(mén)水平上優(yōu)勢(shì)菌為擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、梭桿菌門(mén)(Fusobacteria)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)；科水平上優(yōu)勢(shì)菌主要屬于擬桿菌科、黃單胞菌科、梭桿菌科和脫硫弧菌科等。這與Pérez-Cobas等[6]、Kakumanu等[26]、Carrasco等[28]、Rosas等[29]和Chao等[30]對(duì)德國(guó)小蠊腸道菌群的研究結(jié)果相似,說(shuō)明這些類(lèi)群的細(xì)菌是德國(guó)小蠊腸道內(nèi)的核心微生物(core microbes)。比較分析發(fā)現(xiàn),德國(guó)小蠊雄成蟲(chóng)腸道優(yōu)勢(shì)菌群與褐飛虱(Nilaparvatalugens)[27]、濱海油葫蘆(Teleogryllusoceanicus)[31]和印度谷蛾(Plodiainterpunctella)[32]腸道優(yōu)勢(shì)菌群相類(lèi)似,一些昆蟲(chóng)的腸道微生物在高級(jí)分類(lèi)單元上可能存在一定的相關(guān)性。

相對(duì)于低蛋白(5%)餌料,高蛋白餌料(65%)飼養(yǎng)的德國(guó)小蠊雄蟲(chóng)腸道細(xì)菌物種多樣性沒(méi)有顯著差異,這一結(jié)果支持Pérez-Cobas等[6]對(duì)德國(guó)小蠊雌蟲(chóng)的研究結(jié)論。在德國(guó)小蠊研究中發(fā)現(xiàn)：與野生的蟑螂種群相比,實(shí)驗(yàn)室種群的腸道細(xì)菌多樣性下降[6, 28]；飼養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)有利于細(xì)菌物種多樣性的增加[28]。野生蟑螂的腸道中含有數(shù)量眾多的低豐度細(xì)菌種群,這些低豐度種群在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)過(guò)程中消失了[14, 33]。實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)蟑螂腸道細(xì)菌多樣性下降,可能與人工餌料成分比較固定、成分相對(duì)簡(jiǎn)單有關(guān)。餌料蛋白含量對(duì)昆蟲(chóng)腸道菌群的作用,在果蠅(Drosophilaspp)[34]、大頭金蠅(Chrysomyamegacephala)[35]和印度谷蛾[32]等昆蟲(chóng)中也做過(guò)探討；高蛋白餌料飼養(yǎng)降低果蠅、大頭金蠅和印度谷蛾腸道菌群的物種多樣性。由于不同研究所使用的餌料(包括蛋白質(zhì)來(lái)源、種類(lèi)和質(zhì)量)不同,昆蟲(chóng)的飼養(yǎng)時(shí)間也不同,要作真正意義上有價(jià)值的比較,目前還存在困難。

不同蛋白質(zhì)含量餌料飼養(yǎng)德國(guó)小蠊雄蟲(chóng)后,腸道細(xì)菌中不同種群的相對(duì)豐度發(fā)生顯著的改變；高蛋白餌料飼養(yǎng)促進(jìn)黃單胞菌科和梭桿菌科細(xì)菌富集,低蛋白飼料飼養(yǎng)則有利于擬桿菌科、理研菌科和(Tannerellaceae)細(xì)菌的生長(zhǎng)。在美洲大蠊的研究中,Tinker和Ottesen沒(méi)有作昆蟲(chóng)性別的區(qū)分,但發(fā)現(xiàn)不同餌料(包括高脂肪、高碳水化合物和高蛋白)對(duì)美洲大蠊腸道菌群的豐度沒(méi)有顯著的影響[14]。在德國(guó)小蠊雌蟲(chóng)腸道菌群中,相對(duì)豐度變化最大的是紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)和梭桿菌科(Fusobacteriaceae)；無(wú)蛋白餌料飼養(yǎng)促進(jìn)紫單胞菌科細(xì)菌的生長(zhǎng),其相對(duì)豐度為37%,高于正常蛋白和高蛋白飼料組(分別為29%和26%)；無(wú)蛋白餌料飼養(yǎng)不利于梭桿菌科細(xì)菌生長(zhǎng),其相對(duì)豐度為7%；顯著低于正常蛋白和高蛋白飼料組(分別為32%和23%)[6]。此外,德國(guó)小蠊雌蟲(chóng)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)黃單胞菌科的細(xì)菌[6],而在本研究中卻發(fā)現(xiàn)黃單胞菌科細(xì)菌是德國(guó)小蠊雄成蟲(chóng)腸道的優(yōu)勢(shì)菌群。這種雌、雄蟲(chóng)之間細(xì)菌種群分布的差異是否與其性別分化有關(guān),值得后續(xù)深入研究。

由不同蛋白水平餌料飼養(yǎng)而導(dǎo)致的德國(guó)小蠊雄蟲(chóng)腸道細(xì)菌種群相對(duì)豐度發(fā)生改變,可能與餌料成分對(duì)不同類(lèi)群細(xì)菌的選擇性相關(guān)。食物改變導(dǎo)致腸道細(xì)菌種群發(fā)生波動(dòng)在德國(guó)小蠊和其他昆蟲(chóng)均有發(fā)現(xiàn)[6,8, 13- 15, 35],但食物結(jié)構(gòu)和組分影響昆蟲(chóng)腸道菌群的具體機(jī)制目前不太清楚。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中,不同的微生物類(lèi)群適應(yīng)各自的生長(zhǎng)環(huán)境,進(jìn)化出對(duì)不同有機(jī)質(zhì)利用能力的差異[1, 5, 36]。野生蟑螂腸道微生物群落更為豐富,可能與野生蟑螂的食料更為多元化有關(guān)。野生蟑螂腸道中定殖著大量的低豐度細(xì)菌種群[33, 37],其中的變形菌門(mén)細(xì)菌大多數(shù)與生物固氮有關(guān),在無(wú)氮或貧氮環(huán)境條件下,就需要這些菌群幫助宿主進(jìn)行氮素的固定和循環(huán)[5, 11]。蛋白組分析結(jié)果顯示：大多數(shù)擬桿菌科細(xì)菌含有較多的分解多糖的酶蛋白,主要功能可能是幫助宿主降解復(fù)雜的碳水化合物,產(chǎn)生簡(jiǎn)單而易于利用的糖類(lèi)。因此,餌料中高比例的復(fù)雜碳水化合物有利于擬桿菌的生長(zhǎng)[13, 28]。在人體腸道中,擬桿菌科細(xì)菌同樣適應(yīng)于高蛋白食物；擬桿菌分解復(fù)雜多糖和蛋白質(zhì)后產(chǎn)生的單糖和氨基酸,則促進(jìn)腸道中梭桿菌的積累[38]。因此推測(cè),在本研究設(shè)計(jì)的餌料中,低蛋白餌料中高水平的糊精(85%)有利于擬桿菌的生長(zhǎng),因而在低蛋白餌料飼養(yǎng)蟑螂腸道中擬桿菌科細(xì)菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(47.44%)；而在高蛋白餌料中,較高水平的糊精(13%)和高水平的蛋白(65%),則促進(jìn)擬桿菌和梭菌的協(xié)同生長(zhǎng)。菌群功能注釋顯示高蛋白組德國(guó)小蠊腸道里能量代謝、氨基酸代謝和物質(zhì)分解相關(guān)的基因表達(dá)顯著提高(圖10),和梭桿菌屬細(xì)菌豐度升高同步,推測(cè)梭桿菌屬細(xì)菌可能與餌料中蛋白質(zhì)降解和能量利用相關(guān),緩解餌料中過(guò)多的蛋白質(zhì)對(duì)德國(guó)小蠊的代謝負(fù)擔(dān)。但高蛋白餌料對(duì)德國(guó)小蠊雄蟲(chóng)腸道細(xì)菌種群的調(diào)節(jié)作用由何種因素主導(dǎo),以及梭桿菌屬細(xì)菌的富集在高蛋白水平條件下的作用有待于深入的研究。

不同蛋白質(zhì)水平餌料飼養(yǎng)的德國(guó)小蠊其腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著的變化,這些變化可能與德國(guó)小蠊對(duì)食物的適應(yīng)有關(guān),提示腸道細(xì)菌在德國(guó)小蠊對(duì)環(huán)境和食物的生存適應(yīng)上可能發(fā)揮著重要的作用。本文的研究結(jié)果有利于進(jìn)一步將昆蟲(chóng)腸道菌群與昆蟲(chóng)的取食、代謝和發(fā)育聯(lián)系起來(lái),揭示相關(guān)的作用機(jī)制,從而為利用腸道菌發(fā)展餌料,實(shí)現(xiàn)對(duì)包括德國(guó)小蠊在內(nèi)的衛(wèi)生害蟲(chóng)治理奠定基礎(chǔ)。

致謝：感謝福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院夏曉峰副教授對(duì)文章寫(xiě)作的幫助。