朱光平，陳日萍，薛晨晨，白潔，范宏亮，吳南翔

杭州醫(yī)學(xué)院（浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），浙江 杭州 310013

由于抗生素的普適性和全球微生物的流動(dòng)性，環(huán)境中抗性菌（antibiotic resistant bacteria，ARB）/抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes，ARGs）大量產(chǎn)生且廣泛蓄積，促使“超級(jí)細(xì)菌”的產(chǎn)生，對(duì)生態(tài)穩(wěn)定和人類健康造成了巨大的潛在危害［1］。近年來(lái)，ARGs 的去除成為研究的熱點(diǎn)問(wèn)題［2］。ARB 作為ARGs的主要載體，菌體特有的細(xì)胞壁為ARGs 在各種不利環(huán)境中提供了“保護(hù)”，導(dǎo)致常規(guī)的水處理技術(shù)如紫外照射、氯化消毒、臭氧氧化等需消耗大部分劑量用以去除細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，極大地影響了其對(duì)ARGs的去除效果［3］。研究表明，超聲能通過(guò)機(jī)械沖擊、空化作用等破除細(xì)菌結(jié)構(gòu)［4-5］，而過(guò)氧化氫（又稱雙氧水，H2O2）是水處理工藝中常用的氧化劑，其產(chǎn)生的HO·可對(duì)細(xì)菌的ARGs片段造成破壞，通過(guò)文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)，多數(shù)研究中H2O2的使用劑量比較大［6-7］。對(duì)此，本研究擬引入超聲法以盡可能減少細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等的影響，聯(lián)合傳統(tǒng)的H2O2去除技術(shù)，以期在較低的H2O2濃度范圍內(nèi)探究超聲聯(lián)合H2O2對(duì)水中菌內(nèi)四環(huán)素抗性基因tetA、tetR的去除效果，為發(fā)展新的、更高效節(jié)能的ARGs去除工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

Hieff UNICON? qPCR SYBR Green Master Mix（抗體法，Low Rox）（上海翊圣科技有限公司，中國(guó)），KOD OneTMPCR Master Mix（東洋紡生物科技有限公司，日本），GeneRed Nucleic Acid Dye、高純度質(zhì)粒大提試劑盒、血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（TIANGEN，中 國(guó)），pMD-19T（Simple）、DNA Ligation Kit Ver.2.1（Takara，日本），30%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）H2O2（分析純）（生工生物工程股份有限公司，中國(guó)），牛肝過(guò)氧化氫酶（2 000～5 000 U·mg-1）（Sigma，美國(guó)），超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，中國(guó)），熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems，美國(guó)），掃描電子顯微鏡（JEOL，日本）。

1.2 方法

1.2.1 抗性菌株的構(gòu)建與培養(yǎng)通過(guò)PCR 技術(shù)從購(gòu)買的RP4 質(zhì)粒上擴(kuò)增出tetA、tetR完整片段，連接至pMD-19T 載體上，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌中，涂布于LB（Luria-Berteni）固體培養(yǎng)基（LB板）上，于細(xì)菌培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，挑選白色菌落接種于LB液體中，反復(fù)兩次，經(jīng)PCR 驗(yàn)證后于37℃，220 轉(zhuǎn)·min-1條件下在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)16 h，取800 μL菌液與200 μL滅菌甘油混勻，裝于1.5 mL 凍存管中在-80℃冰箱保存，在使用時(shí)重新復(fù)蘇。

1.2.2 去除體系的構(gòu)建（1）超聲處理：取在恒溫?fù)u床培養(yǎng)16 h的LB菌液10 mL于50 mL離心管中，1 789×g水平離心10 min，倒掉上清液，用無(wú)菌水震蕩清洗兩次，備用。本研究以50 mL 的離心管為基本單元，每個(gè)離心管的菌液體積為10 mL，菌液初始密度通過(guò)D600=1.0來(lái)保持恒定，約為1.0×109CFU·mL-1［8］，使用JY92-II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)對(duì)菌液進(jìn)行處理，處理?xiàng)l件為功率200 W，超聲3 s，停頓8 s計(jì)為1次，整個(gè)超聲過(guò)程在冰上進(jìn)行，以消除超聲產(chǎn)生的熱效應(yīng)。取超聲0 次（C0）、20 次（C20）、40 次（C40）、80 次（C80）的水樣1 mL 在電鏡下觀察，進(jìn)行PCR 檢測(cè)。（2）H2O2處理：將構(gòu)建的pMD-19T/tetA、pMD-19T/tetR質(zhì)粒溶于10 mL水溶液中，使其初始密度分別為0.53、0.85 ng·μL-1。取30%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的H2O2溶液89.1、178.2、534.6 μL 于溶液內(nèi)，使H2O2質(zhì)量濃度分別為10、20、60 mg·L-1［9］，混勻后開(kāi)始計(jì)時(shí)，于0 min（T0）、30 min（T30）、60 min（T60）、120 min（T120）、240 min（T240）、360 min（T360）時(shí)取20 μL 水樣，立即加入2 000～5 000 U·mg-1牛肝過(guò)氧化氫酶20 μL·mL-1以中和未消耗的H2O2，保存于-20℃。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)僅從每個(gè)體系取樣一次，以維持體系的穩(wěn)定性。水溶液中抗性大腸桿菌的去除與抗性質(zhì)粒的去除類似，每種處理?xiàng)l件下取樣1 mL，保存于-20℃條件下。（3）超聲/H2O2聯(lián)合處理：超聲處理過(guò)后，待體系恢復(fù)室溫后加入H2O2，于T0、T30、T60、T120、T240、T360 時(shí)取1 mL 水樣，立即加入牛肝過(guò)氧化氫酶終止H2O2的反應(yīng)，保存于-20℃。

1.2.3 DNA的提取與保存依據(jù)血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取水樣中的DNA，取1 mL未經(jīng)處理的水樣DNA 作為總tetA、tetR量的參照，取經(jīng)過(guò)超聲20 次、40 次、80 次的水樣作為超聲/H2O2處理組的另一對(duì)照。提取DNA后，將其保存在-20℃。

1.2.4 PCR分析用高純度質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，用Nano Drop 2000 分光光度計(jì)（V1.0）測(cè)定核酸濃度與純度，選擇D260/280為1.8～2.0 的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，系列稀釋為101～106，按照熒光定量試劑盒說(shuō)明書配置成20 μL qPCR 反應(yīng)（SYBR Green Master Mix 10 μL；正向引物0.4 μL；反向引物0.4 μL；模板DNA 2 μL；ddH2O 7.2 μL），得出標(biāo)準(zhǔn)曲線用以確定水樣中tetA、tetR的密度。引物由杭州擎科生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，各引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，57.4℃退火延伸30 s，72℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸7 min。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列Table 1 Primer sequences for real-time PCR

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

首先構(gòu)建含有tetA、tetR的大腸桿菌（E.coli），并將其接種在無(wú)菌水中（D600=1.0），將加入抗性E.coli的水溶液置于不同超聲頻率下處理，超聲頻數(shù)分別為C0、C20、C40、C80，處理完畢后取1 mL 菌液保存于-20℃。加入10、20、60 mg·L-1H2O2進(jìn)行處理，收集超聲處理前、后的菌液，收集時(shí)間為T30、T60、T120、T240、T360，各取1 mL 菌液保存于-20℃，取未經(jīng)任何處理的菌液1 mL，用于計(jì)算總tetA、tetR的量。將提取的質(zhì)粒稀釋于無(wú)菌水中，接受相同條件下H2O2的處理，驗(yàn)證超聲破壁后H2O2直接作用于水溶液中tetA、tetR片段的效果。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用Excel、SPSS 16.0、Graphpad prism 8.0.2（263）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)超聲處理的數(shù)據(jù)采用單因素t檢驗(yàn)；對(duì)有時(shí)間因素參與統(tǒng)計(jì)分析的數(shù)據(jù)用重復(fù)測(cè)量的多因素方差分析，用兩因素方差分析進(jìn)行多因素組內(nèi)、組間差異性分析，用Turkey 檢驗(yàn)對(duì)檢測(cè)水準(zhǔn)進(jìn)行校正，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05（雙側(cè)）。去除效果以處理前后抗性基因的減少量，即處理后的密度（ρ）與初始密度（ρ0）比值的常用對(duì)數(shù)值［lg（ρ/ρ0）］來(lái)體現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 抗性E.coli 的構(gòu)建與培養(yǎng)

圖1A 為tetA、tetR與pMD-19T 成功連接后的結(jié)果圖，通過(guò)藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)（圖1B）挑選成功轉(zhuǎn)化的抗性E.coli大量培養(yǎng)，進(jìn)行抗性質(zhì)粒的提取和后續(xù)抗性E.coli的去除實(shí)驗(yàn)。

圖1 pMD-19T與tetA、tetR 成功連接后瓊脂糖凝膠電泳圖和藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)Figure 1 Agarose gel electrophoregram and blue-white screening after successful connection of pMD-19T with tetA and tetR

2.2 超聲處理

圖2為超聲作用于四環(huán)素抗性E.coli的結(jié)果圖，可見(jiàn)隨著超聲次數(shù)的增加，tetA、tetR下降的數(shù)量越多但幅度不大（P＜0.05），超聲對(duì)tetA的去除效果優(yōu)于tetR。

圖2 超聲處理抗性E.coli 結(jié)果圖（n=3）Figure 2 Results of ultrasonic treatment of resistant E.coli (n=3)

圖3為經(jīng)過(guò)超聲處理后抗性菌液在電鏡下的視圖，可見(jiàn)超聲處理后，多數(shù)細(xì)菌表面產(chǎn)生球形凸起，部分細(xì)菌結(jié)構(gòu)破碎。

圖3 E.coli 超聲處理后在電鏡下的視圖Figure 3 E.coli under electron microscope after ultrasonic treatment

2.3 H2O2處理

2.3.1 H2O2 處理水溶液中的tetA、tetR圖4A 為H2O2單獨(dú)作用于抗性基因tetA、tetR的效果圖，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析可知H2O2劑量與處理時(shí)間之間存在交互作用（P＜0.001），tetA、tetR數(shù)量會(huì)隨著H2O2劑量的增大和時(shí)間的累積而減少（P＜0.05），但減少的趨勢(shì)逐漸減慢，最終趨于平緩。與tetR相比，tetA的去除效率更高，在10、20 mg·L-1H2O2作用0～120 min 時(shí)，tetR的數(shù)量有輕微的上升，但整體去除效果仍十分明顯。通過(guò)檢測(cè)數(shù)據(jù)可知，在60 mg·L-1H2O2作用360 min 時(shí)tetA、tetR的去除效果最好，分別減少了1.77 和1.99 個(gè)數(shù)量級(jí)。

2.3.2 H2O2處理E.coli 內(nèi)的tetA、tetR圖4B為H2O2作用于抗性E.coli的效果圖。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)H2O2劑量與處理時(shí)間之間具有交互作用（F=44.26，P＜0.05），不同H2O2劑量之間有差異（F=667.8，P＜0.05）。從圖中可見(jiàn)H2O2對(duì)抗性E.coli中的tetA、tetR呈現(xiàn)出低濃度去除效果要優(yōu)于高濃度的現(xiàn)象。整體上，H2O2對(duì)tetA的去除作用隨著時(shí)間的累積而增強(qiáng)，而其對(duì)tetR卻呈現(xiàn)出反向的增加作用，且這種現(xiàn)象并沒(méi)有隨著時(shí)間的累積而有所改變。

圖4 H2O2對(duì)水溶液（A）和E.coli（B）中tetA、tetR 的去除效果（n=3）Figure 4 Removal of tetA and tetR in sterile water (A) and E.coli (B)by H2O2 (n=3)

2.4 超聲/H2O2聯(lián)合處理E.coli 內(nèi)的tetA、tetR

圖5顯示超聲/H2O2聯(lián)合作用于抗性E.coli隨處理時(shí)間的變化關(guān)系，可發(fā)現(xiàn)在共同作用的前30 min 已決定了整個(gè)去除體系的發(fā)展趨勢(shì)，以30 min 為節(jié)點(diǎn)，在30 min 以后超聲/H2O2的聯(lián)合作用隨時(shí)間的累積變化并不明顯（P＞0.05），但不同劑量的H2O2對(duì)兩種抗性基因的去除效果呈現(xiàn)出差異（P＜0.001）。

圖5 超聲/H2O2 聯(lián)合作用于E.coli 的結(jié)果（n=3）Figure 5 Results of combined ultrasound/H2O2 treatment on E.coli (n=3)

通過(guò)與圖4B 相比，可發(fā)現(xiàn)超聲與H2O2共同作用時(shí)，并沒(méi)有改變H2O2低濃度去除效果優(yōu)于高濃度的現(xiàn)象，但超聲的介入有效抑制了tetR基因反向增加的趨勢(shì)。整體上可得出，超聲與H2O2的聯(lián)合作用（圖6）對(duì)tetA、tetR的去除效果要優(yōu)于單一方法（圖2，圖4B）。在本次實(shí)驗(yàn)中，超聲、H2O2及其聯(lián)合作用最多可使抗性E.coli中的tetA基因減少1.15個(gè)數(shù)量級(jí)（C80，10 mg·L-1H2O2，30 min），tetR基因減少0.56 個(gè)數(shù)量級(jí)（C40，10 mg·L-1H2O2，120 min）。

圖6為超聲/H2O2聯(lián)合作用于抗性E.coli360 min的結(jié)果圖。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，超聲處理與H2O2劑量之間具有交互作用（F=230.60，P＜0.001），H2O2的作用規(guī)律不明顯，體系整體呈現(xiàn)出超聲次數(shù)越多，去除效果越好的趨勢(shì)。相比于tetR基因，tetA的這種趨勢(shì)尤為明顯。

圖6 超聲/H2O2聯(lián)合作用于抗性E.coli 360 min的效果圖（n=3）Figure 6 Effects of combined ultrasound/H2O2 treatment on resistant E.coli for 360 min (n=3)

3 討論

本次研究發(fā)現(xiàn)超聲處理可對(duì)大腸桿菌結(jié)構(gòu)造成破壞和損傷，導(dǎo)致大腸桿菌破碎、內(nèi)容物流出。H2O2對(duì)水溶液中的四環(huán)素抗性基因tetA、tetR有明顯的去除作用，但對(duì)E.coli內(nèi)的tetA、tetR的去除作用不大。與單一方法相比，超聲聯(lián)合H2O2可實(shí)現(xiàn)低濃度H2O2對(duì)抗性E.coli內(nèi)tetA、tetR的有效去除。

近年來(lái)，水體中ARB 與ARGs 的去除一直是熱點(diǎn)問(wèn)題，不少研究報(bào)道了不同水處理工藝對(duì)ARB 的去除作用［10-11］，其中多數(shù)是通過(guò)常規(guī)的消毒過(guò)程如氯化、紫外照射、臭氧氧化等，僅有少數(shù)文獻(xiàn)論述了不同工藝在水/廢水處理過(guò)程中因?yàn)锳RGs 殘留而導(dǎo)致的其轉(zhuǎn)移潛力增強(qiáng)的問(wèn)題［10，12］。研究表明，傳統(tǒng)工藝常用的氧化劑在環(huán)境耐受的劑量范圍內(nèi)很難實(shí)現(xiàn)明顯的去除效果，其往往大量消耗在ARB 細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞上，直接導(dǎo)致遺傳物質(zhì)的釋放，特別是水中的ARGs，它們可能轉(zhuǎn)移到植物［13］或隨著廢水再利用回歸環(huán)境［14-15］。而高劑量氧化劑的單獨(dú)使用不僅極大地增加了成本，不能實(shí)現(xiàn)預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效益，殘留在水體中的氧化劑還可能對(duì)水中的動(dòng)植物造成傷害［13］。

在本研究中，超聲處理對(duì)tetA、tetR的去除效果并不明顯，但通過(guò)掃描電鏡觀察，可以證明超聲對(duì)ARB 細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有良好的破壞作用，這與Wang 等［16］的研究結(jié)果一致。本研究將H2O2直接作用于水中的抗性質(zhì)粒，去除效果十分顯著，但將H2O2作用于菌液時(shí)，效果卻大打折扣。通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，即使將氧化劑的劑量提高數(shù)倍，仍然可能得不到預(yù)期的效果。Cengi 等［6］在研究不同氧化劑對(duì)合成污染牛糞中ARGs的去除效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，盡管H2O2和Fe2+的濃度非常高（分別為1 700、280 mg·L-1），但經(jīng)過(guò)24 h 處理后的效果并不明顯。Ferro 等［7］的研究也發(fā)現(xiàn)高劑量的氧化劑不會(huì)導(dǎo)致ARB 的失活和ARGs 的去除。Koivunen 等［12］的研究表明：一般情況下，氧化劑首先會(huì)攻擊微生物的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜或運(yùn)輸系統(tǒng)，然后才會(huì)攻擊生物內(nèi)部，如RNA 和DNA。因此推測(cè)，抗性E.coli細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)極大地降低了H2O2的有效作用?；谏鲜銮闆r，本研究用超聲聯(lián)合H2O2對(duì)抗性E.coli內(nèi)的tetA、tetR進(jìn)行去除，結(jié)果證明，超聲消除了E.coli細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的影響，使較低濃度的H2O2就可實(shí)現(xiàn)抗性基因的去除。這賦予了超聲/H2O2聯(lián)合工藝在實(shí)際應(yīng)用中的意義，同時(shí)也可避免高濃度的氧化劑對(duì)水體中的動(dòng)植物造成傷害［13］。

當(dāng)然，在研究中還存在以下問(wèn)題：當(dāng)H2O2加入體系后，其會(huì)與菌內(nèi)過(guò)氧化氫酶生成氧氣［17］，這可能會(huì)影響H2O2對(duì)ARGs 的有效作用；本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)方法主要以qPCR 為主，引物可檢測(cè)的片段僅為目標(biāo)基因全長(zhǎng)的一部分，這也可能是檢測(cè)到的tetR基因（序列短）出現(xiàn)反向增加的部分原因，實(shí)際去除效果可能與檢測(cè)到的有些出入。

綜上所述，超聲/H2O2聯(lián)合作用較單一方法能夠?qū)崿F(xiàn)一定程度的增效，兩種方法在現(xiàn)實(shí)生活的水處理方法中都有應(yīng)用，這拉近了實(shí)驗(yàn)室研究到最終水廠應(yīng)用的距離，具有一定的推廣前景。本課題組將會(huì)在接下來(lái)的研究中更深入地探討相關(guān)問(wèn)題，以期為去除環(huán)境中ARGs的方法提供更多參考。