陸穎，徐騫，付強(qiáng)強(qiáng)，劉桐，蔡恩茂，王文靜，3b

1.上海市長(zhǎng)寧區(qū)疾病預(yù)防控制中心 a.理化檢驗(yàn)科 b.主任辦公室，上海 200051

2.上海市疾病預(yù)防控制中心 a.化學(xué)品毒性檢定所 b.慢性非傳染性疾病與傷害防治所，上海 200336

3.同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院 a.全科醫(yī)學(xué)科 b.臨床與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，上海 200090

陳皮是蕓香科植物橘及其栽培變種的干燥成熟果皮，作為中藥飲片和復(fù)方制劑的原料，藥用歷史悠久，在國(guó)內(nèi)外需求量很大。但在其原植物橘中，出現(xiàn)濫用農(nóng)藥導(dǎo)致的農(nóng)殘超標(biāo)問(wèn)題［1］，影響陳皮的質(zhì)量安全，危害人群健康。因此，建立高通量、快速靈敏的陳皮基質(zhì)中農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法，在保障陳皮安全使用方面具有重要意義。

農(nóng)藥多殘留快速檢測(cè)方法是開(kāi)展中藥材風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的主要篩查技術(shù)。目前，農(nóng)藥多殘留檢測(cè)方法主要有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（gas chromatographytandem mass spectrometry，GC-MS/MS）［2］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）［3］，其中結(jié)合QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）前處理技術(shù)的GC-MS/MS 檢測(cè)方法由于操作簡(jiǎn)單、有機(jī)溶劑用量少、分析效率高而應(yīng)用最廣。

陳皮中含大量的揮發(fā)油、色素和生物堿等物質(zhì)，其中揮發(fā)油占總質(zhì)量的2%～4%左右［4］，使得前處理存在凈化效率低、基質(zhì)效應(yīng)大等困難。有研究報(bào)道采用固相萃取小柱-LC-MS/MS和QuEChERS-GC-MS/MS分別測(cè)定陳皮中農(nóng)藥殘留［5］，此研究無(wú)法通過(guò)一種檢測(cè)手段完成對(duì)多農(nóng)殘的分析，實(shí)驗(yàn)步驟多、耗時(shí)長(zhǎng)。此外，所涉及農(nóng)藥的數(shù)量最多幾十種，限制了方法的實(shí)用性。增強(qiáng)型脂質(zhì)吸附材料（enhanced matrix removal，EMR）可以去除基質(zhì)中脂類干擾且不造成分析物損失［6］，常用于肉類樣品前處理方法中，還沒(méi)有在中藥材中使用的報(bào)道。本研究首次將新型凈化材料EMR 用于QuEChERS前處理方法中，針對(duì)性除去中藥材基質(zhì)中油脂成分，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)和內(nèi)標(biāo)法降低基質(zhì)干擾，建立GC-MS/MS 快速測(cè)定陳皮中多種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

7890A-7000 氣相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent），5810R 高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf），AG204電子天平（瑞士Mettler），Buchi Syncore 平行濃縮儀（瑞士Buchi）。

內(nèi)標(biāo)環(huán)氧七氯（純度≥95%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer），153種農(nóng)藥混標(biāo)套裝（4組，每組質(zhì)量濃度均為50 mg·L-1，北京振翔BePure），乙酸乙酯（色譜純，德國(guó)Merck），乙腈（色譜純，德國(guó)Merck），EMR 凈化管（美國(guó)Agilent），十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18，中國(guó)安譜CNW），N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA，美國(guó)Supelco），石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB，美國(guó)Supelco）。

1.2 方法

1.2.1 凈化條件優(yōu)化在空白陳皮基質(zhì)中添加0.1 mg·kg-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察1 mL上述溶液中加入不同質(zhì)量的PSA（25、50、75、100 mg）和GCB（5、10、20、50、100 mg）的農(nóng)藥回收率，以驗(yàn)證其凈化效果。在GC-MS/MS 儀器SCAN 模式下，分別比較經(jīng)EMR 除脂、C18 除脂以及不除脂處理后的空白基質(zhì)溶液。在空白陳皮基質(zhì)中添加0.1 mg·kg-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，除不添加PSA 和GCB 外均按照“1.2.2”處理，考察EMR 對(duì)待測(cè)農(nóng)藥的回收率的影響。

1.2.2 前處理方法的建立將陳皮樣品粉碎后過(guò)50目篩，稱取2 g 于50 mL 離心管中，加入10 mL 超純水浸泡30 min，再加入15 mL 1%乙酸-乙腈、6 g 無(wú)水硫酸鎂、1.5 g 醋酸鈉及1 顆陶瓷均質(zhì)子，4 500 r·min-1離心3 min（離心半徑為12.3 cm）。每毫升上述提取液中加入150 mg無(wú)水硫酸鎂、50 mg PSA及10 mg GCB于15 mL離心管中渦旋振蕩，4 500 r·min-1離心3 min（離心半徑為12 cm）。移取5 mL 乙腈層至經(jīng)過(guò)5 mL 水活化的EMR萃取管中漩渦混合，4 500 r·min-1離心3 min（離心半徑為12 cm）。取2 mL 上清液氮吹至近干，分別加入20 μL 內(nèi)標(biāo)溶液和980 μL乙酸乙酯稀釋待測(cè)。

1.2.3 色譜條件色譜柱：VF-1701MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。升溫程序：初始溫度40℃，保持1 min；40 ℃·min-1升至120 ℃，保持0 min；5 ℃·min-1升至300℃，保持3 min。進(jìn)樣口溫度：280℃；載氣：氦氣（純度≥99.999%）；柱流量：1.0 mL·min-1，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積1.0 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件取153 種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)GC-MS/MS SCAN Q3 模式運(yùn)行，輔以美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）數(shù)據(jù)庫(kù)確定目標(biāo)化合物及其保留時(shí)間，選擇質(zhì)量數(shù)相對(duì)更大、豐度更高的特異性離子為母離子，進(jìn)行子離子掃描，選擇最佳定性、定量離子對(duì)和最優(yōu)碰撞能量。

電離方式：電子轟擊電離源；離子源溫度：300℃；傳輸線溫度：280℃；離子化能量70 eV；溶劑延遲：3 min；碰撞氣為氮?dú)?，載氣為氦氣；數(shù)據(jù)采集方式：動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（dynamic multiple reaction monitoring，dMRM）模式。

1.2.5 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液制備及性能指標(biāo)檢測(cè)將4組農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品用乙酸乙酯稀釋成質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1的153 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。將環(huán)氧七氯內(nèi)標(biāo)用乙酸乙酯溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為5.0 mg·L-1的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。選取不含目標(biāo)農(nóng)藥殘留的陳皮樣品（空白陳皮），按照“1.2.2”步驟處理得空白基質(zhì)溶液。吸取適量的上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，配制質(zhì)量濃度系列為5.0、10.0、50.0、100.0、500 μg·L-1的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

取2 g 空白陳皮基質(zhì)添加農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后按“1.2.2”方法前處理，以各定量離子信噪比的3 倍計(jì)算檢出限（limits of detection，LOD），信噪比的10 倍計(jì)算定量限（limits of quantification，LOQ）。分別在0.05、0.20、0.80 mg·kg-1三組添加水平下進(jìn)行6 次平行檢測(cè)，計(jì)算平均回收率和精密度。通過(guò)待測(cè)物在基質(zhì)與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)點(diǎn)比值來(lái)考察基質(zhì)效應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

1.3 方法應(yīng)用

為驗(yàn)證方法的實(shí)用性，利用所建立的方法對(duì)市售12 批次陳皮樣品進(jìn)行農(nóng)藥殘留分析。

2 結(jié)果

2.1 前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 PSA和GCB用量對(duì)農(nóng)藥回收率的影響添加25 mg PSA 時(shí)，153 種農(nóng)藥回收率為71.6%～138.5%；添加量為50～100 mg 時(shí)，回收率在73.4%～128.7%之間。添加5 mg GCB 時(shí)，凈化液顏色較深，色素去除率低；添加量為10 mg GCB 時(shí)，農(nóng)藥的回收率為70.1%～81.6%；當(dāng)添加量增加到20 mg GCB 時(shí)，農(nóng)藥的回收率為54.6%～64.8%。圖1為不同用量GCB 下的六氯苯、嘧霉胺、五氯苯胺、毒壤磷經(jīng)兩次平行測(cè)定的回收率結(jié)果。因此確定每毫升樣品中PSA 和GCB 的添加量為50 mg和10 mg。

圖1 不同量的石墨化碳黑對(duì)平面結(jié)構(gòu)農(nóng)藥吸附后的回收率Figure 1 Recovery rates of planar pesticides adsorbed by different amounts of graphitized carbon black

2.1.2 EMR 對(duì)凈化效果的影響與未經(jīng)凈化直接進(jìn)樣的空白基質(zhì)溶液（圖2A）和經(jīng)過(guò)C18 除脂后的空白基質(zhì)溶液（圖2B）相比，經(jīng)過(guò)EMR 除脂后的空白基質(zhì)溶液（圖2C）在10～23 min 之間基質(zhì)信號(hào)有明顯降低，而且雜質(zhì)峰更少。

圖2 采用不同除脂方法得到的空白基質(zhì)全掃描色譜圖Figure 2 Full scan chromatogram of blank matrix by different degreasing methods

2.1.3 EMR 對(duì)待測(cè)農(nóng)藥的回收率的影響153 種農(nóng)藥的回收率為70.7%～129.3%。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

兩種色譜柱均有較高響應(yīng)者，其中VF-1701MS 色譜柱對(duì)六六六、滴滴涕、菊酯類同分異構(gòu)化合物分離效果好，而這些物質(zhì)在HP-5MS 色譜柱上分離度不理想。因此選擇VF-1701MS 色譜柱作為本實(shí)驗(yàn)的色譜分離柱，優(yōu)化后的色譜條件同“1.2.3”。

2.3 dMRM方法的建立

根據(jù)獲得的參數(shù)信息建立dMRM 檢測(cè)方法，優(yōu)化后的GC-MS/MS 質(zhì)譜條件見(jiàn)補(bǔ)充材料http://www.jeom.org/article/cn/10.13213/j.cnki.jeom.2021.21035。陳皮中153種農(nóng)藥在GC-MS/MS上的總離子流圖見(jiàn)圖3。

圖3 153種農(nóng)藥在GC-MS/MS上的總離子流圖Figure 3 Total ion currents of 153 pesticides on GC-MS/MS

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性范圍和相關(guān)系數(shù)采用內(nèi)標(biāo)法定量，結(jié)果顯示，153 種農(nóng)藥在0.005～0.50 mg·L-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r＞0.997）。

2.4.2 檢出限和定量限當(dāng)取樣量為2.0 g 時(shí)，153 種農(nóng)藥的LOD 為0.000 1～0.014 8 mg·kg-1，LOQ 為0.000 3～0.048 9 mg·kg-1。

2.4.3 準(zhǔn)確度和精密度153 種農(nóng)藥平均回收率在71.3%～126.9%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為1.1%～13.0%（n=6）（見(jiàn)補(bǔ)充材料http://www.jeom.org/article/cn/10.13213/j.cnki.jeom.2021.21035）。本實(shí)驗(yàn)方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，滿足陳皮中多農(nóng)殘分析的要求。

2.4.4 基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）在0.1 mg·kg-1添加水平下，153 種農(nóng)藥中有122 種農(nóng)藥其ME＞50%，具有強(qiáng)烈的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；12種農(nóng)藥的ME 在20%～50%之間，具有較弱的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；17 種農(nóng)藥的ME在-20%～20%之間，屬于無(wú)基質(zhì)效應(yīng)；乙烯菌核利的ME 在-50%～-20%，有較弱的基質(zhì)抑制效應(yīng)；氯苯胺靈的ME＜-50%，有強(qiáng)烈的基質(zhì)抑制效應(yīng)。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

總批次檢出率為50%，6 批次陽(yáng)性樣品中共檢出12種農(nóng)藥殘留，大部分為殺菌劑；其中抑霉唑的檢出率和殘留量最高。見(jiàn)表1。

表1 陳皮中農(nóng)藥的檢出結(jié)果Table 1 Detection of pesticide residues in Pericarpium Citri Reticulatae

3 討論

由于中藥陳皮基質(zhì)成分復(fù)雜，在進(jìn)行多農(nóng)藥殘留檢測(cè)時(shí)，經(jīng)凈化氮吹濃縮后，待測(cè)液有明顯橘黃色黏稠液滴仍無(wú)法吹干，影響結(jié)果測(cè)定的準(zhǔn)確性。為解決這一問(wèn)題，本研究首次將EMR 加入QuEChERS 前處理方法中并加以優(yōu)化。通過(guò)觀察EMR 凈化后樣品的外觀顏色，發(fā)現(xiàn)提取液油脂和色素含量少于C18 凈化和未經(jīng)凈化的，且色譜雜質(zhì)峰數(shù)量比后兩者有所減少。PSA、GCB 都是經(jīng)典的QuEChERS 吸附劑。PSA 主要作用是去除基質(zhì)中極性的有機(jī)酸。從結(jié)果看出，PSA 的添加降低了回收率大于130%的農(nóng)藥數(shù)量，說(shuō)明其對(duì)基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)有降低作用；但隨著PSA 添加量的增加，回收率沒(méi)有明顯變化。GCB 對(duì)色素吸附能力很強(qiáng)，但亦容易吸附具有平面結(jié)構(gòu)的化合物，本實(shí)驗(yàn)中六氯苯、嘧霉胺、五氯苯胺、毒壤磷這4 種平面性較強(qiáng)的農(nóng)藥隨著GCB 用量增大回收率降低?；趦艋Ч娃r(nóng)藥的回收率兩方面考慮，采用QuEChERS EMR-Lipid凈化技術(shù)是陳皮樣品農(nóng)藥殘留檢測(cè)前處理步驟中較優(yōu)的凈化方式。

153 種農(nóng)藥中絕大多數(shù)在GC-MS/MS 上呈現(xiàn)出基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，這類農(nóng)藥具有極性強(qiáng)、熱穩(wěn)定差等特點(diǎn)，如抑霉唑、溴氰菊酯、甲胺磷等。因此采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正，經(jīng)校正后可有效消除基質(zhì)效應(yīng)帶來(lái)的影響。此外，定量檢測(cè)采用在基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液中同時(shí)加入內(nèi)標(biāo)物環(huán)氧七氯，通過(guò)內(nèi)標(biāo)法校正待測(cè)目標(biāo)農(nóng)藥，進(jìn)一步提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。

在陳皮樣品中檢測(cè)出較高濃度的殺菌劑，其原因是在柑橘貯藏前會(huì)對(duì)其進(jìn)行防腐保鮮，即將采摘后的柑橘浸入防腐保鮮藥液中，常用的防腐保鮮藥為抑霉唑、苯醚甲環(huán)唑、異菌脲等，與此次測(cè)定的結(jié)果相符。參考GB 2763—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中柑橘的限量要求，本次市售陳皮中檢出的丙溴磷、氯氟氰菊酯、苯醚甲環(huán)唑的殘留量高于限值，推測(cè)其原因是陳皮干制后水分流失導(dǎo)致其濃度變高。

本研究通過(guò)優(yōu)化凈化方法和色譜質(zhì)譜參數(shù)，建立dMRM 模式下GC-MS/MS 檢測(cè)陳皮中153 種常用農(nóng)藥殘留檢測(cè)的方法，具有復(fù)雜基質(zhì)一次性提取、快速凈化、準(zhǔn)確定量、高效測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)，可為農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法的完善提供參考依據(jù)，同時(shí)也可為基質(zhì)類似中藥的農(nóng)藥殘留方法提供借鑒。