陶愛群，姜小文

（湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421005）

湖南地處亞熱帶南部，氣候溫暖濕潤(rùn)，適于柑橘的生長(zhǎng)，是中國(guó)柑橘重要產(chǎn)地之一。柚（Citrus maxima）是蕓香科柑橘屬植物，其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，富含維生素C，耐儲(chǔ)藏，有“天然罐頭”的美譽(yù)。但湖南1 月驟然的降溫、極端低溫或周期性大凍害的襲擊，常導(dǎo)致柚園發(fā)生凍害，影響柚樹生長(zhǎng)，繼而影響柚果產(chǎn)量和品質(zhì)。已有的柚類低溫脅迫研究[1-3]結(jié)果表明，柚類越冬期耐寒性存在差異且受外源PP333 調(diào)控。為了解柚的抗寒性差異，筆者選取湖南廣泛栽培的沙田柚、琯溪蜜柚與新品系泉口冰雪柚為試材，研究低溫脅迫后相關(guān)生理指標(biāo)的變化，以期為柚類抗寒育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料選衡陽(yáng)縣泉口村常規(guī)管理水平的柚園5年生沙田柚、琯溪蜜柚和泉口冰雪柚3 個(gè)品種，砧木均為酸柚。

1.2 試驗(yàn)方法

2018 年12 月下旬—2019 年2 月下旬，每月1 次從正常結(jié)果、樹冠外圍無(wú)病蟲害的樹體采取健康生長(zhǎng)、長(zhǎng)勢(shì)基本一致的春梢上第三或第四片葉。將葉片帶至實(shí)驗(yàn)室后，用直徑為1 cm 的打孔器打出葉圓片，分別置于1、-1、-3、-5、-7、-9 和-11℃可調(diào)溫冰箱中（溫度波動(dòng)±0.5℃）處理12 h 后取出備用,以不經(jīng)低溫處理的材料作對(duì)照。

用DDS-312 型精密電導(dǎo)儀測(cè)定電導(dǎo)率，參照章文才[4]的方法計(jì)算出相對(duì)電導(dǎo)率；MDA 含量、SOD活性的測(cè)定用氮藍(lán)四唑（NBT）法；CAT、POD 活性測(cè)定參照李玲等[5]的方法。每個(gè)指標(biāo)測(cè)定5 次，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。

1.3.1 細(xì)胞傷害率計(jì)算細(xì)胞傷害率按相對(duì)電導(dǎo)率計(jì)算即：細(xì)胞傷害率（%）=（R-CK）/（R0-CK）×100%，其中R為低溫處理材料的電導(dǎo)率，R0為低溫處理材料經(jīng)煮沸后的電導(dǎo)率，CK 為對(duì)照的電導(dǎo)率。

1.3.2 半致死溫度計(jì)算先轉(zhuǎn)化細(xì)胞傷害率yi=ln[（k-y）/y]，將Logistic 方程y=（1+ae-et）轉(zhuǎn)化為ln[（k-y）/y]=lna-bt，將細(xì)胞傷害率（yi）轉(zhuǎn)變成與處理溫度（t）的直線方程，通過(guò)一元回歸方法求出方程參數(shù)a、b 值及相關(guān)系數(shù)R。半致死溫度 LT50 即拐點(diǎn)溫度t=lna/b。其中y為實(shí)測(cè)細(xì)胞傷害率，t 為冷凍處理溫度，k 為細(xì)胞傷害率的飽和量（本研究中k=100）[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫處理對(duì)電導(dǎo)率的影響

2.1.1 低溫處理對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率的影響3 個(gè)柚品種的相對(duì)電導(dǎo)率均隨著處理溫度的下降而上升，變化曲線呈S 形，但上升幅度因品種而異（見表1）。當(dāng)處理溫度由1℃降至-3℃時(shí)，3 個(gè)品種的相對(duì)電導(dǎo)率均低于10%，尤其是泉口冰雪柚僅為5.2%，在此低溫范圍內(nèi)，細(xì)胞膜雖因低溫處理產(chǎn)生了一定的傷害，但影響不大；當(dāng)處理溫度由-3℃下降到-5℃時(shí)，3 個(gè)品種相對(duì)電導(dǎo)率的上升幅度開始增大，琯溪蜜柚的電導(dǎo)率由7.8%上升至19.4%，沙田柚由9.0%上升至25.5%，泉口冰雪柚由5.2%上升至11.2%；當(dāng)處理溫度由-5℃下降至-9℃時(shí)，3 個(gè)品種的相對(duì)電導(dǎo)率上升幅度進(jìn)一步增大，琯溪蜜柚由19.4%上升至65.2%，沙田柚由25.5%上升至70.6%，泉口冰雪柚由11.2%上升至46.8%；而當(dāng)處理溫度由-9℃下降到-11℃時(shí)，琯溪蜜柚和沙田柚的相對(duì)電導(dǎo)率均呈下降趁勢(shì)，分別由65.2%下降至60.3%和由70.6%下降至65.8%，而泉口冰雪柚的相對(duì)電導(dǎo)率仍繼續(xù)上升，由46.8%上升至57.3%，但上升幅度有所減緩。

表1 不同低溫處理對(duì)3 個(gè)柚品種相對(duì)電導(dǎo)率的影響 （%）

2.1.2 不同柚品種的半致死溫度由于3 個(gè)柚品種的相對(duì)電導(dǎo)率變化趨勢(shì)呈S 曲線，可以利用Logistic曲線方程進(jìn)行擬合，3 個(gè)柚品種的擬合值系數(shù)均大于0.978 8，呈極顯著水平?，g溪蜜柚、沙田柚和泉口冰雪柚的半致死溫度分別為-8.70、-8.04 和-9.66℃（見表2）。植物半致死溫度的高低能反映植物對(duì)低溫的耐受能力。因此3 個(gè)柚品種的抗寒能力由弱到強(qiáng)依次為沙田柚、琯溪蜜柚和泉口冰雪柚。

表2 Logistic 方程擬合方程參數(shù)及半致死溫度

2.2 低溫處理對(duì)MDA 含量的影響

MDA 是植物遭受低溫脅迫后細(xì)胞膜膜脂過(guò)氧化形成的產(chǎn)物，其含量的高低代表細(xì)胞膜過(guò)氧化程度的大小。不同低溫處理后3 個(gè)柚品種的MDA 含量均呈上升趨勢(shì)，但增長(zhǎng)幅度因品種而異（見表3），說(shuō)明3 個(gè)柚品種經(jīng)低溫處理后細(xì)胞膜均會(huì)發(fā)生過(guò)氧化作用，但過(guò)氧化程度因品種而不同。在同一低溫處理下，以泉口冰雪柚的MDA 含量最低，即在同一低溫處理下泉口冰雪柚的膜脂過(guò)氧化程度低于琯溪蜜柚和沙田柚。

表3 不同低溫處理后3 個(gè)柚品種的MDA 含量 （μmol/g）

2.3 低溫處理對(duì)CAT、SOD、POD 含量的影響

植物在遭受凍害時(shí)體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，導(dǎo)致自由基過(guò)氧化反應(yīng)與自由基清除反應(yīng)失去動(dòng)態(tài)平衡而使植物產(chǎn)生凍害。植物的氧化系統(tǒng)如抗氧化保護(hù)酶主要包括氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）可抵御因低溫脅迫產(chǎn)生的過(guò)氧化反應(yīng)，因此測(cè)定抗氧化保護(hù)酶的活性可用來(lái)確定植物抗寒能力的大小[6]。

SOD 是植物細(xì)胞中清除自由基的酶之一，它能催化生物體內(nèi)分子氧活化的中間產(chǎn)物超氧陰離子自由基（·）發(fā)生歧化反應(yīng)，生成O2和H2O2，從而減輕（·）對(duì)植物體的毒害作用[7]，其活性高低是植物抗寒性的重要指標(biāo)之一。由表4 可知，琯溪蜜柚和沙田柚的SOD 活性在-9～1℃的范圍內(nèi)均隨著溫度的下降而上升，當(dāng)溫度由-9℃下降到-11℃時(shí)則SOD活性下降，說(shuō)明這2 個(gè)品種在-9～1℃的溫度范圍內(nèi)，清除自由基的能力均呈上升趨勢(shì)，但隨著溫度的繼續(xù)下降，則酶活性降低，植物的細(xì)胞活性也下降。泉口冰雪柚的SOD 活性則隨著溫度的下降一直呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明泉口冰雪柚的自由基清除能力隨著溫度的下降一直呈上升趨勢(shì)。在溫度為-3～1℃時(shí)，SOD 活性是琯溪蜜柚高于泉口冰雪柚，泉口冰雪柚高于沙田柚；而溫度為-11～-3℃時(shí)，SOD 活性則是泉口冰雪柚高于琯溪蜜柚，琯溪蜜柚高于沙田柚。

表4 不同低溫處理后3 個(gè)柚品種的SOD 活性 [μ/(mg·min)]

CAT 是植物體內(nèi)清除H2O2的酶之一，也是植物應(yīng)對(duì)低溫的防御系統(tǒng)之一，是細(xì)胞徹底清除活性氧的關(guān)鍵酶，其活性大小與植物的抗寒性有一定關(guān)系。琯溪蜜柚和沙田柚的CAT 活性在-7～1℃范圍內(nèi)均隨著溫度的降低呈上升趨勢(shì)，而當(dāng)溫度為-11～-7℃時(shí)則隨著溫度的降低而呈下降趨勢(shì)；泉口冰雪柚的CAT 活性在溫度為-9～1℃時(shí)隨著溫度的降低而上升，在-11～-9℃時(shí)隨著溫度的降低而下降；在同一低溫下，CAT 活性是琯溪蜜柚高于泉口冰雪柚，泉口冰雪柚高于沙田柚（見表5）。

表5 不同低溫處理后3 個(gè)柚品種的CAT 活性[μ/(mg·min)]

POD 是植物體內(nèi)普遍存在的活性較高的一種酶，也是植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶之一，與CAT 一起分解由SOD 作用產(chǎn)生的H2O2，生成無(wú)害的水，其活性高低與植物的抗逆境能力密切相關(guān)。從表6 可知，琯溪蜜柚與沙田柚POD 活性在-7～1℃范圍內(nèi)均隨著溫度的降低而上升，而后隨著溫度的繼續(xù)降低而呈下降趨勢(shì)；泉口冰雪柚則是在-9～-1℃范圍內(nèi)隨溫度降低呈上升趨勢(shì)，從-9 降至-11℃略有下降；在同一低溫下，POD 活性表現(xiàn)為泉口冰雪柚高于琯溪蜜柚，琯溪蜜柚高于沙田柚。

表6 不同低溫處理后3 個(gè)柚品種的POD 活性 [μ/(mg·min)]

3 小 結(jié)

柚的抗寒性高低可通過(guò)測(cè)定膜透性大小、游離脯胺酸含量、可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖含量[8]等指標(biāo)衡量，也可用半致死溫度和田間表現(xiàn)等指標(biāo)衡量[9]。該研究通過(guò)測(cè)定細(xì)胞膜的相對(duì)電導(dǎo)率和Logistic 方程擬合得出沙田柚、琯溪蜜柚和泉口冰雪柚的半致死溫度分別為-8.04、-8.70 和-9.66℃，這種半致死溫度的排序與3 個(gè)品種的田間表現(xiàn)一致。

該研究結(jié)果還表明：在同一低溫處理下泉口冰雪柚的MDA 含量最低；溫度為-11～-3℃時(shí)，SOD 活性是泉口冰雪柚高于琯溪蜜柚，琯溪蜜柚高于沙田柚；CAT 活性是琯溪蜜柚和沙田柚在溫度為-11～-7℃時(shí)隨著溫度的降低呈下降趨勢(shì)，而泉口冰雪柚則是當(dāng)溫度為-11～-9℃時(shí)才隨著溫度的降低而下降；琯溪蜜柚與沙田柚的POD 活性在-7～1℃范圍內(nèi)隨著溫度的降低而上升，而后隨著溫度的繼續(xù)降低而呈下降趨勢(shì)，泉口冰雪柚則是在-9～-1℃范圍內(nèi)隨溫度降低呈上升趨勢(shì)，從-11～-9℃才略有下降，且在同一低溫下，POD 活性表現(xiàn)為泉口冰雪柚高于琯溪蜜柚，琯溪蜜柚高于沙田柚；沙田柚的3 種酶活性在各低溫處理下均低于琯溪蜜柚和沙田柚。因此，MDA 含量和SOD、CAT、POD 酶活性經(jīng)低溫處理后的變化也證明了泉口冰雪柚最抗寒，琯溪蜜柚居中，沙田柚最不抗寒。