羅任杰,林勤保*,顏建偉,2*,馬俊杰,李忠

1(暨南大學(xué) 包裝工程研究所,廣東 珠海,519070)2(華東交通大學(xué) 土木建筑學(xué)院,江西 南昌,330052)3(拱北海關(guān)技術(shù)中心,廣東 珠海,519020)

初級芳香胺(primary aromatic amines,PAAs)是一類典型的有毒有害物質(zhì)[1],食品接觸材料中PAAs主要由復(fù)合軟包裝中使用的聚氨酯膠黏劑和印刷油墨引起的,可能會進(jìn)入食品中,通過呼吸道、胃腸道和皮膚進(jìn)入人體,致病甚至致癌[2]。目前對PAAs的檢測主要參照歐盟標(biāo)準(zhǔn),新推行的(EU)2020/1245[3]法規(guī)規(guī)定：PAAs不得檢出,對于列入(EC)1907/2006/REACH附錄,但未在(EU)No 10/2011[4]有遷移限量要求的PAAs,設(shè)定每一項的限值為2 μg/kg,其他種類PAAs的遷移總量限值為10 μg/kg。我國與美國食品及藥品管理局尚未推出關(guān)于油墨及黏合劑中PAAs的檢測標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)法規(guī)。國內(nèi)對PAAs的研究集中在環(huán)境[5]和紡織品[6]中,而與食品包裝安全相關(guān)的問題則是在近年成為研究熱點。

PAAs多采用液相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行測定,該方法操作簡便,無需復(fù)雜的前處理過程；對檢測環(huán)境沒有要求,檢測對象廣泛,且對色譜上的分離狀態(tài)沒有要求,即使沒有分離的PAAs通過特征離子色譜圖也能得到準(zhǔn)確分析[7]。國內(nèi)外已將該方法應(yīng)用于油墨[8-9]、紙包裝[10]、塑料餐具[11-12]以及塑料包裝[13-16]的檢測。這些研究工作一方面利用高分辨質(zhì)譜進(jìn)行了定性篩查,探究了可能出現(xiàn)的PAAs的種類；另一方面建立準(zhǔn)確、快捷、可靠的方法,實現(xiàn)了μg/kg級別精度的檢測。雖然這些工作取得了卓越的成果,但整體上對塑料包裝中的PAAs可能存在的種類,在不同條件及工況下的遷移行為及遷移規(guī)律,毒理學(xué)評估及安全限量等問題都還不明確,仍需更多的研究去補充和完善。

食品接觸材料中所有可能遷移到食品中的物質(zhì)均需要評估[17]。面對名目繁多、廣泛使用的各類添加物,建立高通量的檢測手段并對其進(jìn)行研究分析,顯得尤為重要[18]。食品接觸用塑料復(fù)合膜中的有益添加物,包括抗氧化劑、爽滑劑、紫外吸收劑等,也可能會進(jìn)入食品中產(chǎn)生安全問題。例如,爽滑劑芥酸酰胺(erucamide,EAD)在高溫下水解生成的芥酸容易引起皮膚損傷[19]?？寡鮿?246作為一種阻酚類抗氧劑,對小鼠的半致死量為6 500 mg/kg,在食品接觸材料中過量添加將會對人體造成危害[20]。EAD[21-22]和抗氧劑2246[23-24]的液相研究方法已經(jīng)分別建立。

本文首先對PET/PE復(fù)合膜和PET/AL/PE復(fù)合膜的提取液進(jìn)行篩查,對可能存在的PAAs以及其他風(fēng)險物進(jìn)行定性分析,然后建立了一種使用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)直接進(jìn)樣的方法,快速測定2種復(fù)合膜中25種PAAs、2類塑料添加劑EAD和抗氧劑2246,同時對它們在不同遷移條件下和不同模擬物中的遷移行為及遷移規(guī)律進(jìn)行探究,旨在為塑料食品接觸材料中PAAs的研究和測定提供補充和參考。

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器

乙醇、甲醇,均為色譜純,上海麥克林生化科技有限公司；甲酸,分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；C18固相萃取柱Agilent EC-C18色譜柱(4.6 mm×100 mm,2.7 μm),安捷倫科技(中國)有限公司(Agilent)；26種初級芳香胺混標(biāo),上海安譜實驗科技股份有限公司；芥酸酰胺(112-84-5,純度85%)、抗氧劑2246(119-47-1,純度>98%),北京百靈威科技有限公司；聚對苯二甲酸乙二醇酯/聚乙烯復(fù)合膜(PET/PE70)、聚對苯二甲酸乙二醇酯/鋁/聚乙烯復(fù)合膜(PET/AL/PE70),均由同一家制造公司提供,采用相同的復(fù)合和熟化工藝,所用薄膜均為非印刷膜,目的是為了排除油墨中可能產(chǎn)生的芳香胺的影響。

Agilent InfinityLab LC/MSD 單四極桿HPLC-MS,安捷倫科技(中國)有限公司；Thermo TSQ Quantum Ultra三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司；DHG-9145A電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FA1604 N電子天平(準(zhǔn)確度等級I),上海菁海儀器有限公司；KQ5200DE超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；TPTC超純水器,湖南力辰儀器科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 添加物的篩查

取2種樣品薄膜各0.1 g,經(jīng)5 mL最佳提取溶劑乙酸乙酯[25]超聲萃取并過濾后,用賽默飛Thermo TSQ Quantum Ultra三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行全掃描分析。篩查結(jié)果出現(xiàn)3種高響應(yīng)峰239.01、338.21(ESI+)以及340.10(ESI-)。測試物質(zhì)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品二級離子、保留時間驗證比對認(rèn)為分別是4,4′-二氨基二苯硫醚、EAD以及抗氧劑2246。

4,4′-二氨基二苯硫醚是歐盟法規(guī)所列出的聚氨酯膠粘劑中可能產(chǎn)生的10種芳香胺[26]外的一種PAA,常用作聚氨酯橡膠的硫化劑。它的出現(xiàn)表明膠水和塑料的生產(chǎn)過程中也可能存在著芳香胺的產(chǎn)生。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SNT 2893—2011[27]基本能涵蓋了聚氨酯膠粘劑生產(chǎn)中可能產(chǎn)生的芳香胺的種類,因此采用其規(guī)定的26種偶氮標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)品儲備液：準(zhǔn)確稱取0.117 6 g EAD標(biāo)準(zhǔn)品及0.1 g抗氧劑2246標(biāo)準(zhǔn)品,分別用甲醇配制質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液母液,用甲醇稀釋至300 mg/L后與300 mg/L的26種PAAs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行混合得到100 mg/L的26種PAAs及2種添加物混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,置于-17 ℃儲存?zhèn)溆?。另將上述儲備液稀釋? mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液用于質(zhì)譜條件優(yōu)化。

混合標(biāo)準(zhǔn)品中間液：準(zhǔn)確移取26種PAAs及2種添加物混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液0.1 mL于10 mL容量瓶,用甲醇定容得到1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,于-17 ℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液：分別準(zhǔn)確移取26種PAAs及2種添加物混合標(biāo)準(zhǔn)品中間液于容量瓶,用甲醇配制成0.01～1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,-17 ℃保存,儲存期為5 d。

1.2.3 樣品處理條件

為了避免實驗器皿及耗材帶來的EAD污染,實驗過程避免使用塑料滴管、針式過濾器和注射器等塑料制品,對于移液所需的耗材則通過儀器測量進(jìn)行甄選,選用污染在信噪比為5以下實驗耗材。實驗過程中所使用玻璃器皿(量器除外)經(jīng)反復(fù)洗凈并測量污染值在檢出限之下后使用。

根據(jù)歐盟法規(guī)NO 10/2011[4]和3種復(fù)合包裝材料的實際應(yīng)用條件,選擇了(70±2)℃、2 h和(40±1)℃、10 d 2種遷移實驗條件,食品模擬物分別選用體積分?jǐn)?shù)為10%乙醇溶液、體積分?jǐn)?shù)為4%乙酸溶液、體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶液,采用制袋單面遷移的方法,6 dm2食品接觸材料及制品接觸1 kg的食品或食品模擬物。對每個試驗進(jìn)行3次重復(fù)分析。樣品采用HPLC-MS分析。

1.2.4 LC-MS條件

液相條件：C18固相萃取柱Agilent EC-C18色譜柱,柱溫36 ℃；進(jìn)樣量6 μL；流速：0.6 mL/min；H-ESI+流動相：A為甲醇溶液,B為0.1%甲酸溶液；梯度洗脫程序：0～1.5 min,5% A 95% B；1.5～2.5 min,5%～20% A；2.5～11.0 min,20%～60% A；11.0～12.0 min,60%～80% A；12.0～13.5 min,80% A；13.5～18.0 min,80%～65% A；18.0～20.5 min,65%～5% A；20.5～22.0 min,95% A 5% B。

H-ESI-流動相：A為甲醇溶液,100% A等度洗脫6.0 min；質(zhì)譜條件：掃描模式SIM；離子源類型H-ESI+,正電噴霧電壓4 500 V,離子傳輸管溫度320 ℃,霧化氣8 L/h,干燥氣溫度300 ℃,干燥氣流速35 L/h。離子源類型H-ESI-,負(fù)電噴霧電壓3 000 V,離子傳輸管溫度320 ℃,霧化氣8 L/h,干燥氣溫度300 ℃,干燥氣流速35 L/h。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的優(yōu)化

以Agilent EC-C18為色譜柱,考察不同流動相對26種PAAs及EAD和抗氧劑2246混合標(biāo)準(zhǔn)品的影響。有研究表明,PAAs在甲醇中的信號響應(yīng)優(yōu)于乙腈[12]。因此選用甲醇作為實驗的的流動相,在此基礎(chǔ)上分別比較了甲醇、0.1%甲酸溶液、水和它們不同比例的混合物的響應(yīng)。結(jié)果表明,甲醇-甲酸體系對PAAs的離子化效果、色譜峰分離、信號響應(yīng)都優(yōu)于甲醇-水體系。以A為甲醇溶液,B為0.1%甲酸溶液,進(jìn)一步優(yōu)化梯度洗脫程序。在洗脫過程中,一方面要調(diào)整流動相的極性以及pH值來保證PAAs色譜峰的最優(yōu)分離效果,另一方面還要兼顧添加劑EAD的出峰效果。在優(yōu)化的過程中發(fā)現(xiàn)與聯(lián)苯胺質(zhì)荷比相同的背景峰離子185會對其他芳香胺的出峰產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾。為了排除干擾,將聯(lián)苯胺去除,最終確定25種PAAs及EAD作為目標(biāo)檢測物。26種正離子的標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1,質(zhì)譜條件見表1。

圖1 26 種正離子目標(biāo)物的總離子流圖

表1 27種目標(biāo)化學(xué)物的質(zhì)譜條件及質(zhì)譜定量離子

2.2 檢出限、線性范圍和線性方程

在最優(yōu)化的實驗條件下,對27種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行檢測,以質(zhì)量濃度(μg/L)為橫坐標(biāo),以對應(yīng)峰面積響應(yīng)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明,在對應(yīng)濃度范圍內(nèi),27目標(biāo)物線性關(guān)系良好,線性相關(guān)系數(shù)為0.997 3～0.999 9。由表2可知,除了鄰氨基偶氮甲苯、2-氨基-4硝基甲苯、苯胺、對苯二胺外,其余21種芳香胺的檢出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ)分別為0.2～5 μg/kg和1～10 μg/kg,低于歐盟規(guī)定的10 μg/kg遷移量檢出限值。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對試驗方法的可靠性進(jìn)行驗證,以3種食品接觸材料模擬物(4%乙酸溶液,10%乙醇溶液,95%乙醇溶液)為空白樣品,分別添加濃度水平為10、50和200 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,按照實驗方法進(jìn)行回收實驗,對每個濃度水平平行測定3次,27種目標(biāo)物的加標(biāo)回收率均在76.9%～108.2%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4%～12.5%。

表2 27種目標(biāo)化學(xué)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、LOD及LOQ(n=3)

2.3 目標(biāo)物遷移結(jié)果

在40 ℃的條件下,PET/PE實驗組中檢測到了4種PAAs(圖2),分別是2,4-二氨基苯甲醚、3,3′-二甲氧基聯(lián)苯胺、4,4′-二氨基二苯硫醚和鄰甲苯胺。在70 ℃/2 h的實驗中,如圖3所示,3,3′-二甲氧基聯(lián)苯胺和鄰甲苯胺未檢出,取而代之的是一種新的芳香胺——3,3′-二甲基-4,4′-二氨基二苯甲烷。對這些檢出的芳香胺進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),除了酸性模擬物中4,4′-二氨基二苯硫醚(圖2-c圖3-c)在70 ℃條件下比40 ℃的條件下的遷移量略高之外,其余的PAAs在40 ℃條件下比70 ℃具有更多的遷出種類以及更高的遷移量。上述差別可能與遷移時間有關(guān)。芳香胺的遷移是一個持續(xù)的過程,在70 ℃/2 h的條件下,雖然溫度升高可能導(dǎo)致遷移速率增加,但由于遷移時間較短,因此最終的遷移量要比40 ℃/10 d要低。另外,新的芳香胺的出現(xiàn)意味著在高溫條件下存在更多芳香胺遷出的可能性。

圖2 40 ℃/10 d條件下2種材料中初級芳香胺在3種模擬物中的遷移量

圖3 70 ℃/2 h條件下2種材料中初級芳香胺在3種模擬物中的遷移量

2種添加劑也有不同程度的遷出,見圖4和圖5。EAD在油性模擬物中最易遷出,在酸性模擬物中遷出量非常小,在中性模擬物中不遷出。實驗材料和實驗條件對其遷移的影響不大。另一種添加劑抗氧劑2246僅在油性模擬物中有檢出。其鍍鋁復(fù)合膜與未鍍鋁復(fù)合膜的結(jié)果基本相同,因此材料帶來的影響非常小。而遷移條件的影響十分顯著：抗氧劑2246在40 ℃的條件下遷移非常的微弱,而在70 ℃/2 h的條件下大大增強。

圖4 不同條件下2種材料中芥酸酰胺在3種模擬物中的遷移量

圖5 不同條件下2種材料中抗氧劑2246在3種模擬物中的遷移量

不同的實驗材料產(chǎn)生的遷移結(jié)果也存在著差異。在實際的復(fù)合膜生產(chǎn)過程中,PET/PE的上膠量相對PET/AL/PE小,一般認(rèn)為PET/AL/PE中PAAs的含量會更高。而從圖2-a、b、c中可以看到PET/AL/PE材料中3種芳香胺的遷出量明顯低于PET/PE材料,甚至存在未檢出的情況,據(jù)此測鍍鋁層對芳香胺的遷出有一定的阻礙效果。不過該現(xiàn)象并沒有在70 ℃的實驗中以及添加劑的遷移中重現(xiàn),這說明鍍鋁層可能只在較低溫度的條件下(40 ℃)產(chǎn)生阻隔效果,在高溫條件下會失效。

圖2和圖3還體現(xiàn)出PAAs在3種食品模擬物中遷移行為的差異。PAAs主要集中在中性模擬物及油性模擬物中,而酸性模擬物中僅有2,4′-二氨基二苯硫醚(圖2-c、圖3-c)和3,3′-二甲氧基聯(lián)苯胺(圖3-a)被檢出。導(dǎo)致PAAs遷移行為的差異的原因可能有2個：一是由于PAAs的極性不同,導(dǎo)致在不同模擬物對不同芳香胺的溶解能力不同,從而產(chǎn)生了差異;另一個原因是pH值對PAAs的遷出產(chǎn)生了影響。這個現(xiàn)象不是特例,在其他風(fēng)險物的遷移研究中已有體現(xiàn)：pH 4.0～7.0,pH值越低,鄰苯二甲酸酯的遷移量越高[28]。PAAs含有氨基呈堿性,在酸性模擬物會與乙酸發(fā)生反應(yīng),這就導(dǎo)致其在酸性模擬物中的加標(biāo)回收率普遍比另2種食品模擬物低。除此之外,在遷移的過程中PAAs的氨基官能團可能與酸性模擬物中的氫離子產(chǎn)生了分子間的作用力,阻礙了PAAs的遷移。這個結(jié)果對現(xiàn)實中各類食品接觸材料中PAAs的檢測有著一定的指示作用,即對酸性食品的風(fēng)險較小,而中性食品和油性食品的風(fēng)險較大,需要進(jìn)行重點關(guān)注。

2.4 安全評估

對實驗結(jié)果進(jìn)行安全評估。由于目前我國現(xiàn)行法規(guī)僅有GB 9683—1988規(guī)定了甲苯二胺的限量,因此對于本研究中的PAAs均參照歐盟標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行安全評估。(EU)2020/1245法規(guī)中規(guī)定到：PAAs不得檢出,對于列入(EU)1907/2006/REACH附錄XVII第43條附錄8,但未在(EU)No 10/2011有遷移限量要求的PAAs,設(shè)定每一項的限值為2 μg/kg,其他種類的PAAs的遷移總量限值為10 μg/kg。表3、表4給出了2種復(fù)合膜在不同實驗條件及不同模擬物中的遷移量,可以看到4,4′-二氨基二苯硫醚和鄰甲苯胺的特定遷移量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn),而其他的PAAs的總遷移量也嚴(yán)重超標(biāo),存在極大的安全風(fēng)險。

表3 PET/PE復(fù)合包裝中27種化學(xué)物在不同條件下的遷移量 單位：μg/L

表4 PET/AL/PE復(fù)合包裝中目標(biāo)物在不同條件下的遷移量 單位：μg/L

2種塑料添加劑中抗氧劑2246在國標(biāo)GB 9685—2016和歐盟標(biāo)準(zhǔn)(EU)No 10/2011中均規(guī)定了“抗氧劑2246與抗氧劑245的總限量為1 500 μg/L”。由于本實驗中未發(fā)現(xiàn)抗氧劑245,因此直接對表3和表4中抗氧劑2246的遷移量進(jìn)行評估,結(jié)果為抗氧劑2246的遷移量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于限量,安全風(fēng)險較低。

由于歐盟標(biāo)準(zhǔn)(EU)No 10/2011與國標(biāo)GB 9685—2016中并未規(guī)定具體遷移限量,因此采用毒理學(xué)關(guān)注閾值法(TTC)計算出EAD及抗氧劑2246理論允許遷移量(μg/kg),按公式(1)計算。

EDI=migration×food intake×fc

(1)

式中：EDI為估計每日攝入量[mg/(人·d)],Cramer結(jié)構(gòu)類I化合物對應(yīng)EDI值為1 800 μg/(人·d),0.09/(人·日)；food intake,每人每天食物攝入量,3 kg；fc,消費因子,0.12。

由此得到,Cramer結(jié)構(gòu)類I化合物對應(yīng)理論允許最大遷移量為5 000 μg/kg,表3及表4所示的EAD的遷移量在TTC所計算限量要求之內(nèi),從理論上認(rèn)為是安全的。

3 結(jié)論

本研究建立了同時測定PET/PE復(fù)合包裝中25種PAAs及2種添加物EAD和抗氧劑2246的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法,準(zhǔn)確、快速地測定PET/PE復(fù)合膜和PET/AL/PE復(fù)合膜在40 ℃/10 d和70 ℃/2 h 2種遷移條件下及體積分?jǐn)?shù)為4%乙酸溶液、體積分?jǐn)?shù)為10%乙醇溶液、體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液3種模擬物中的遷移量,并進(jìn)行探究討論。遷移結(jié)果表明：40 ℃/10 d條件下遷移出的PAAs種類及遷移量均高出70 ℃/2 h下的遷移。對于EAD,它的遷移幾乎不會因溫度的改變而發(fā)生變化。對2種復(fù)合膜的遷移進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),在較低使用溫度(40 ℃)下,復(fù)合膜鍍鋁可以有效地減少芳香胺及添加物的遷出。檢出的芳香胺在3種模擬物的遷移行為存在著差別。PAAs的極性差異使得它們在不同模擬物的溶解性不同。pH值也會對PAAs的遷移產(chǎn)生影響：PAAs是堿性有機物,酸性條件對其遷移會產(chǎn)生阻礙。因此PAAs主要在中性模擬物和油性模擬物中遷出,在酸性模擬物中的遷出種類少,遷移量也大幅降低。最后,對遷移結(jié)果進(jìn)行安全評估：對國標(biāo)和歐標(biāo)中沒有明確規(guī)定限量的EAD用TTC法進(jìn)行評估發(fā)現(xiàn)EAD的遷移量低于TTC估算的安全閾值,因此理論上認(rèn)為是安全的。抗氧劑2246遷移量也遠(yuǎn)小于歐盟規(guī)定的限量,安全風(fēng)險較小,而檢出的芳香胺濃度均不能夠滿足歐盟標(biāo)準(zhǔn)的要求,存在安全風(fēng)險。