勾文君,方芳*

1(江南大學 未來食品科學中心,江蘇 無錫,214122)2(江南大學 生物工程學院,工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)

高級醇是白酒中重要的芳香組分之一,對白酒的風味和飲用舒適度有重要影響[1-2]。適量的高級醇可提高酒的濃厚感并增加酒的協(xié)調(diào)性[3],但含量過高會引起頭痛、頭暈等不良反應[4]。高級醇含量是酒類產(chǎn)品衛(wèi)生標準中的一個限制性指標,白酒中總高級醇的含量應控制在0.2 g/100 mL以內(nèi)[5]。濃香型白酒中的高級醇主要包括異戊醇、正丙醇、異丁醇和正丁醇[6]。異戊醇、正丙醇、異丁醇的合成主要與酵母菌的氨基酸合成和分解代謝相關(guān),正丁醇的合成則與梭菌的物質(zhì)代謝有關(guān)[6-7]。正丁醇是白酒中高級醇的主要成分之一[1],味苦微澀,濃香型白酒中正丁醇含量大多在70～350 mg/L[8-10],含量過高時會影響飲用口感。

固態(tài)混菌發(fā)酵狀態(tài)下的濃香型白酒發(fā)酵過程復雜,目前,窖內(nèi)發(fā)酵過程中與正丁醇合成相關(guān)的微生物、積累機制以及影響其合成能力的因素尚不完全清楚,這限制了白酒發(fā)酵中正丁醇減控技術(shù)的發(fā)展和應用。濃香型白酒中的正丁醇主要是窖泥中的梭菌通過乙酰輔酶A依賴途徑合成[11-14]。目前,調(diào)控發(fā)酵酒精飲料中高級醇的含量主要通過優(yōu)化發(fā)酵工藝與改造微生物2種手段[15-16]。由于濃香型白酒發(fā)酵原料和工藝的特殊性,通過調(diào)控白酒發(fā)酵工藝(加曲量、加糠量等)和發(fā)酵溫度等[5,17],可使高級醇總量降低1.42%～14.81%[18]。但這種調(diào)控方式于白酒發(fā)酵有一定的影響,且不能單獨調(diào)控某個高級醇的合成。對酵母菌的基因改造雖然能減少由酵母產(chǎn)生的高級醇,但對白酒發(fā)酵體系內(nèi)酵母代謝的影響較小,對體系中正丁醇這類非酵母主要代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控無效[19]。此外,基因工程菌用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)的安全性尚不可預計,尚未見到通過菌株基因改造降低白酒中丁醇含量的報道。利用發(fā)酵食品體系中獲得性狀優(yōu)良的菌株[16],通過微生物擾動的方式控制微生物代謝產(chǎn)物則是一種安全有效的方法[20]。

本研究擬分離濃香型白酒發(fā)酵體系中的梭菌,通過分析它們合成丁醇能力的差異,找到合成丁醇能力較弱的菌株,將其強化到白酒窖內(nèi)發(fā)酵體系中,用于擾動其他梭菌合成丁醇的代謝,以期達到減少濃香型白酒中正丁醇含量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

窖泥、入窖酒醅和大曲等樣品均由江蘇洋河酒廠股份有限公司提供。窖泥和入窖酒醅置于-80 ℃凍存,大曲室溫保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

胰蛋白胨生理鹽水溶液(tryptone saline solution,TPS,g/L)：胰化蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10。

強化梭菌培養(yǎng)基(enhancedClostridiummedium,RCM,g/L)：蛋白胨10,牛肉浸粉10,酵母浸粉3,葡萄糖5,可溶性淀粉1,NaCl 5,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5。

乙酸鈉培養(yǎng)基(g/L)：乙酸鈉5,(NH4)2SO40.5,MgSO40.2,K2HPO40.4,酵母膏1,CaCO310,使用前加入體積分數(shù)為2%的乙醇。

P2培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60,酵母粉3,KH2PO41,CaCO33,MgSO4·7H2O 0.02,FeSO4·7H2O 0.01,NaCl 0.01,對氨基甲苯0.001,維生素B10.001,生物素0.000 01。

丁醇培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60,乙酸銨4,酵母粉3,KH2PO41,K2HPO41,CaCO33,MgSO4·7H2O 0.2,FeSO4·7H2O 0.02,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5,對氨基苯甲酸0.003,硫胺0.002。

五糧固體培養(yǎng)基[21]：根據(jù)實際生產(chǎn)工藝,將粉碎后的五糧(高粱、大米、玉米、小麥、糯米)按比例混合均勻,按料液比1∶4(g∶mL)添加水,加50 U/kg高溫淀粉酶蒸煮糊化1 h,冷卻至60 ℃后加入120 U/kg糖化酶處理1 h,121 ℃、滅菌20 min。

1.2 試劑及儀器

正丁醇、叔戊醇、2-辛醇,均為色譜純,Sigma-Aldrich公司；細菌基因組DNA提取試劑盒,天根生化科技有限公司；其他試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

厭氧培養(yǎng)罐及產(chǎn)氣袋,日本三菱公司；GC-2010AF氣相色譜儀,日本島津公司；Agilent-1260高效液相色譜儀,安捷倫公司；Pegasus BT氣相-高通量飛行時間質(zhì)譜儀,美國力可公司；PCR儀,Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)正丁醇菌株的分離

稱取10 g窖泥與100 mL TPS緩沖液混合,80 ℃處理10 min以殺死非芽孢狀態(tài)的菌體及其他營養(yǎng)細胞[22],于室溫放置20 min富集菌體,再置于80 ℃熱處理10 min,待冷卻至30～40 ℃時,以10%的接種量轉(zhuǎn)移至乙酸鈉液體培養(yǎng)基,37 ℃厭氧富集培養(yǎng)7 d。取1 mL菌液稀釋涂布RCM固體培養(yǎng)基,37 ℃厭氧培養(yǎng)2～5 d。觀察培養(yǎng)皿中微生物生長情況,挑取不同形態(tài)的菌落劃線分離3次及以上,得到各菌株的純培養(yǎng)物。

采用P2培養(yǎng)基篩選具有合成正丁醇能力的菌株。挑取單菌落接入RCM液體培養(yǎng)基,37 ℃靜置厭氧培養(yǎng)24～28 h至OD600為0.9～1.1,以10%接種量接種至P2培養(yǎng)基,于37 ℃厭氧發(fā)酵3 d,測定正丁醇含量。

1.3.2 菌株屬種鑒定

使用DNA提取試劑盒提取分離到的合成正丁醇細菌的基因組DNA,對獲得的總基因組DNA進行16S rDNA的PCR擴增。采用細菌的通用引物：27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′),1492R(5′-GG-TTACCTTGTTACGACTT-3′)[23]。

PCR擴增體系(25 μL)：2×ExTaq酶12.5 μL,ddH2O 11 μL,上下游引物各0.5 μL,模板DNA 0.5 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,34個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。擴增結(jié)束后,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物,產(chǎn)物純化后送至無錫天霖測序公司測序。將測序所得16S rDNA序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對,進行細菌的種屬鑒定。

1.3.3 減少正丁醇生成菌株的篩選

在P2培養(yǎng)基內(nèi)通過共培養(yǎng)發(fā)酵,尋找可降低正丁醇合成量的微生物。將經(jīng)種屬鑒定菌株的純培養(yǎng)物分別接入RCM液體培養(yǎng)基,37 ℃厭氧培養(yǎng)24～28 h至OD600為0.9～1.1,將各菌株與正丁醇合成能力最強的微生物(Clostridiumbeijerinckii6Y-1)以體積比10∶1的接種比例混合后,以10%接種量接種至P2培養(yǎng)基,37 ℃厭氧發(fā)酵3 d。

1.3.4 不同添加比例對丁醇合成的影響

將OD600為1.1的丁醇高產(chǎn)菌C.beijerinckii6Y-1與減控菌株ClostridiumtyrobutyricumZY-4分別以體積比10∶1、5∶1、1∶1、1∶5、1∶10的接種比例混合均勻,按10%的接種量接入200 g五糧培養(yǎng)基內(nèi),混合均勻后置于37 ℃厭氧培養(yǎng)3 d。

1.3.5 梭菌合成各代謝產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)

在丁醇培養(yǎng)基體系,按10%的接種量分別接入OD600為1.1的C.beijerinckii6Y-1、C.tyrobutyricumZY-4以及兩者體積比為1∶10的混合物,37 ℃厭氧培養(yǎng)3 d。

1.3.6 模擬白酒窖內(nèi)發(fā)酵

以窖泥+酒醅+大曲+強化菌為考查體系,模擬濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程,實驗流程及裝置如圖1所示。為排除酒醅中其他微生物對實驗結(jié)果的干擾,取200 g酒醅在121 ℃下滅菌20 min,向酒醅添加質(zhì)量分數(shù)6.25%的大曲混勻后置于30 ℃發(fā)酵48 h。而后將窖泥均勻涂抹在發(fā)酵裝置內(nèi)側(cè)作為空白對照,分別向窖泥中添加1.0×105CFU/g丁醇高產(chǎn)菌C.beijerinckii6Y-1、1.0×106CFU/g減控菌株C.tyrobutyricumZY-4以及兩者混合物,置于37 ℃厭氧發(fā)酵48 h,定時取樣。

圖1 模擬白酒發(fā)酵的發(fā)酵流程(a)及裝置(b)

1.4 分析檢測

固態(tài)樣品處理方法：準確稱取10 g發(fā)酵酒醅,加入20 mL超純水,冰浴超聲混勻,4 ℃下10 000 r/min離心5 min,取上清液用于檢測分析[21]。

1.4.1 正丁醇含量測定

待測樣品中加入終濃度為10 mg/L的叔戊醇,采用頂空-氣相色譜-氫離子火焰檢測器檢測正丁醇含量[24]。色譜柱為DB-Wax(30.0 m×0.32 mm×0.25 μm),平衡溫度70 ℃,平衡時間35 min。進樣口溫度200 ℃,檢測器溫度260 ℃,分流比3∶1。升溫程序：初始溫度40 ℃,保持5 min,然后以10 ℃/min的速度升至180 ℃保持5 min。使用氮氣作為載氣,流速9 mL/min。

1.4.2 有機酸含量測定

乙酸和丁酸含量采用高效液相色譜法測定[25]。色譜條件：色譜柱為有機酸柱,柱溫40 ℃；紫外檢測器：檢測波長210 nm；流動相為5 mmol/L稀硫酸,洗脫速度0.5 mL/min；進樣體積10 μL；分離時間30 min。

1.4.3 丙酮及乙醇含量測定

樣品中丙酮和乙醇的含量采用配備有火焰離子化檢測器的氣相色譜儀測定[26]。色譜條件：色譜柱HP-INNOWAX(30.0 m×0.32 mm×0.25 μm);進樣口和檢測器的溫度保持在250 ℃,升溫程序：初始溫度50 ℃,保持2 min,然后以10 ℃/min的速度升至130 ℃并保持1 min;使用氮氣作為載氣,流速為30 mL/min。

1.4.4 揮發(fā)性物質(zhì)含量測定

酒醅中揮發(fā)性風味物質(zhì)采用固相微萃取聯(lián)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進行測定[27]。測定后將樣品質(zhì)譜圖與NIST 2.0標準譜庫進行比對鑒定,依據(jù)保留指數(shù)對揮發(fā)性物質(zhì)進行定性,根據(jù)內(nèi)標2-辛醇(終濃度為0.1 mg/L)與揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積之比對含量進行半定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥中梭菌的分離與產(chǎn)丁醇能力分析

濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程與正丁醇合成相關(guān)的細菌主要是窖泥中的梭菌。本研究采用RCM和乙酸鈉2種培養(yǎng)基從窖泥中共分離得到19株梭菌,經(jīng)16S rDNA基因序列鑒定分別屬于C.beijerinckii、C.cocleatum、C.pabulibutyricum、C.intestinale、C.tertium、C.butyricum、C.sphenoides、C.tyrobutyricum(表1)。其中C.intestinale和C.tertium是首次從窖泥中分離得到的梭菌種。對所分離得到的梭菌合成正丁醇能力的分析表明,C.tyrobutyricum是所分離到梭菌中產(chǎn)丁醇能力最弱的梭菌種,而C.beijerinckii產(chǎn)丁醇能力最強。在P2培養(yǎng)基中C.beijerinckii合成丁醇能力為8.06 g/L,是其他梭菌正丁醇合成量的1 013～8 956倍(圖2)。C.beijerinckii是丁醇工業(yè)發(fā)酵的主要生產(chǎn)菌種[28]。由此推測,C.beijerinckii可能與濃香型白酒發(fā)酵過程丁醇的生成有關(guān)。

表1 濃香型白酒窖泥中梭菌的分離與鑒定

圖2 窖泥梭菌正丁醇合成能力比較

2.2 抑制拜氏梭菌合成丁醇菌株的篩選

為了評估產(chǎn)丁醇能力弱的梭菌是否能抑制C.beijerinckii6Y-1合成丁醇,考察了分離自濃香型白酒窖泥的梭菌與C.beijerinckii6Y-1共培養(yǎng)時對其合成正丁醇的影響。由圖3可知,C.tyrobutyricum4-5、C.sphenoides4-7和C.butyricum7-2能夠促進C.beijerinckii6Y-1合成正丁醇,分別可提高18.48%、11.51%和5.63%,這可能與該梭菌具有高產(chǎn)甲酸、氫氣的代謝特性相關(guān)[28]。當C.tyrobutyricum5-15、C.butyricum6-42、C.cocleatum4-38、C.intestinale3-5、C.tertium3-11與C.beijerinckii6Y-1共培養(yǎng),不能抑制其合成正丁醇。C.pabulibutyricum3-1、C.tertium3-21、C.tyrobutyricumZ-1和C.tyrobutyricumZY-4具有減少C.beijerinckii6Y-1合成正丁醇的能力,其中C.tyrobutyricumZY-4的抑制效果最顯著,達到68.91%。C.tyrobutyricum的4個菌株對C.beijerinckii6Y-1合成正丁醇能力的減控作用存在差異,這可能是由不同菌株代謝特性的多樣性導致[2]。

圖3 抑制C.beijerinckii合成丁醇菌株的篩選

為了確定抑制C.beijerinckii6Y-1合成丁醇的最適條件,分析了初始接種比例對C.beijerinckii6Y-1合成丁醇的影響。通過考察五糧固體培養(yǎng)基中正丁醇的生成量,為將P2培養(yǎng)基體系中減控丁醇能力最顯著的C.tyrobutyricumZY-4應用于實際白酒釀造過程提供基礎(chǔ)。由圖4可知,C.beijerinckii6Y-1在五糧固體培養(yǎng)基中產(chǎn)正丁醇的量隨C.tyrobutyricumZY-4添加量的增加而減少,這表明通過調(diào)整C.tyrobutyricumZY-4的添加比例,可以將正丁醇的含量控制在一定范圍內(nèi)。當C.beijerinckii6Y-1與C.tyrobutyricumZY-4以1∶10的接種比例混勻后添加至五糧培養(yǎng)基中,對正丁醇含量的降低效果最好。與只接種C.beijerinckii6Y-1的對照相比,添加C.tyrobutyricumZY-4最多可使五糧固體培養(yǎng)基中正丁醇的含量減少81.61%。

圖4 C.tyrobutyricum ZY-4添加比例對C.beijerinckii 6Y-1合成丁醇的影響

2.3 酪丁酸梭菌ZY-4減控丁醇合成機制的初步分析

梭菌合成正丁醇的代謝途徑如圖5所示[13,29]。首先葡萄糖通過糖酵解途徑代謝為丙酮酸,然后經(jīng)由乙酰輔酶A合成丁酰輔酶A,最后生成丁醇。其中乙酰輔酶A和丁酰輔酶A可通過分支途徑分別合成乙酸和丁酸。

圖5 梭菌合成丁醇的代謝途徑

為解析濃香型白酒發(fā)酵窖泥中分離得到的C.tyrobutyricumZY-4減控C.beijerinckii6Y-1合成丁醇的機制,分析并比較了2種菌單獨培養(yǎng)及丁醇培養(yǎng)基體系共培養(yǎng)時發(fā)酵液中的正丁醇和其他代謝產(chǎn)物的含量。由表2可知,除維持生長外,C.beijerinckii6Y-1通過乙酰輔酶A生成的代謝產(chǎn)物主要為丁醇,而C.tyrobutyricumZY-4的主要代謝產(chǎn)物為丁酸和乙酸。在共培養(yǎng)體系中,乙酰輔酶A生成的代謝產(chǎn)物為乙酸、丁酸和丁醇。添加ZY-4可使共培養(yǎng)體系內(nèi)正丁醇的生成量減少(103.08±9.55)mmol/L,與生成的其他代謝產(chǎn)物(乙酸、丁酸、乙醇和丙酮)增加量之和(103.01±10.55)mmol/L相同。這說明ZY-4與6Y-1共培養(yǎng)時,可使乙酰輔酶A生成乙酸、丁酸和丙酮等副產(chǎn)物的代謝量增加,從而減少6Y-1生成正丁醇。

表2 窖泥梭菌代謝產(chǎn)物分析 單位：mmol/L

2.4 模擬白酒窖內(nèi)發(fā)酵減控丁醇

為驗證C.tyrobutyricumZY-4是否能在模擬白酒發(fā)酵體系中減控C.beijerinckii6Y-1合成正丁醇,分別考察了模擬白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程丁醇的含量變化。由圖6可知,與對照相比,在窖泥中強化C.beijerinckii6Y-1使發(fā)酵過程酒醅中丁醇含量顯著增加,最高可使丁醇含量增加34.85%；而強化C.tyrobutyricumZY-4則使酒醅中丁醇的生成量顯著減少,最多可減少30.05%。如果窖泥中含有丁醇合成能力高的C.beijerinckii6Y-1,通過強化C.tyrobutyricumZY-4仍可使正丁醇的生成量減少14.43%～41.62%。以上結(jié)果說明,不論窖內(nèi)發(fā)酵過程中丁醇含量處于較高還是高水平(含有產(chǎn)丁醇能力強的C.beijerinckii),均可通過在窖泥中用C.tyrobutyricumZY-4擾動的方式顯著減少白酒發(fā)酵過程中丁醇的生成。

圖6 C.tyrobutyricum ZY-4擾動對模擬發(fā)酵過程酒醅中正丁醇含量的影響

為評估本研究所用丁醇減控策略是否會影響白酒的風味,比較了窖泥梭菌擾動對酒醅中揮發(fā)性風味物質(zhì)種類和含量的影響。由圖7可知,向窖泥單獨添加2種梭菌或其混合物,除己酸乙酯、辛酸乙酯等風味物質(zhì)的含量顯著增加外,酒醅中其余主要風味物質(zhì)的含量基本與對照相同。其中強化C.tyrobutyricumZY-4,不僅可在發(fā)酵過程降低正丁醇的生成,還使?jié)庀阈桶拙频墓羌茱L味物質(zhì)己酸乙酯和辛酸乙酯的含量分別增加25.77%和22.22%。窖泥中的梭菌來源于窖泥中人工強化的產(chǎn)丁酸和己酸菌株以及從環(huán)境中獲得的微生物。有研究證實,梭菌的代謝產(chǎn)物有白酒中的呈香物質(zhì)或前體,主要是對白酒中己酸、辛酸及其相應乙酯的含量有貢獻[30]。這也是強化梭菌對其他主要風味物質(zhì)含量無顯著影響的原因之一。

圖7 窖泥梭菌擾動對酒醅中揮發(fā)性風味物質(zhì)的影響

3 結(jié)論與展望

為降低濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程中產(chǎn)生的正丁醇含量,利用微生物之間相互作用,通過強化具有擾動作用抑制高產(chǎn)正丁醇的菌株來降低其合成能力?？紤]到添加外源菌株可能會對白酒發(fā)酵體系產(chǎn)生干擾,進而對酒體品質(zhì)引起較大的風險,因此優(yōu)先從窖泥的重要功能微生物中篩選減控丁醇合成的菌株。從窖泥中共分離得到分屬于8個種的19株梭菌,包括首次從窖泥中分離得到C.intestinale和C.tertium,這在一定程度上豐富了窖泥中梭菌物種的多樣性。對梭菌產(chǎn)正丁醇能力的研究表明,不同種屬梭菌的正丁醇合成能力存在差異,C.beijerinckii6Y-1可使酒醅中正丁醇生成量顯著增加,而C.tyrobutyricum、C.sphenoides和C.butyricum等梭菌屬的菌種生成丁醇能力較弱。

本研究篩選到1株適用于調(diào)控酒窖內(nèi)發(fā)酵體系中正丁醇生成的酪丁酸梭菌C.tyrobutyricumZY-4。該菌株能較好地減少濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程酒醅中丁醇的生成,并且能顯著減少酒醅中由較強丁醇合成能力菌株C.beijerinckii生成的丁醇。通過窖泥梭菌擾動的方式,建立了濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程丁醇減控的方法,顯著提高了酒醅中己酸乙酯、辛酸乙酯的含量,并對絕大部分主要揮發(fā)性風味物質(zhì)的生成無顯著影響。