楊文君，段杉，崔春

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣州 510642；2.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640)

隨著人們生活水平的提高以及食品工業(yè)的迅速發(fā)展，人們對(duì)調(diào)味品的要求越來(lái)越高，傳統(tǒng)單一的調(diào)味品已經(jīng)不能滿足人們的要求，因此開(kāi)發(fā)具有多種風(fēng)味的復(fù)合調(diào)味品逐漸成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)，并且呈味基料在復(fù)合調(diào)味品中發(fā)揮著極其重要的作用[1]。呈味基料具有濃郁的鮮味，能提供圓潤(rùn)、飽滿的醇厚口感，且自身也可具備特征的風(fēng)味等特點(diǎn)[2]。目前呈味基料的制備方法主要有蛋白可控酶解法、定向合成法(主要包括化學(xué)合成、酶法合成、DNA重組技術(shù)等)以及從微生物、動(dòng)植物生物體內(nèi)直接提取分離純化法等[3]。酶解法制備的呈味肽具有安全性高、生產(chǎn)條件溫和、水解過(guò)程易控制等特點(diǎn)，因此酶法水解是獲得食品級(jí)呈味肽的常用方法和食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[4]。

豌豆(PisumsativumLinn)原產(chǎn)于地中海和中亞細(xì)亞地區(qū)，是我國(guó)主要的農(nóng)作物之一。豌豆蛋白是豌豆的重要組成部分，氨基酸比例較為均衡，其中賴氨酸的含量豐富，同時(shí)谷氨酸、天冬氨酸等鮮味氨基酸含量也較高，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源[5]，同時(shí)，也是一種制備呈味肽的良好來(lái)源。豌豆蛋白主要是生產(chǎn)淀粉后的副產(chǎn)物，以往主要用作蛋白源添加入飼料中，加工和利用未引起足夠的重視，造成了蛋白資源的浪費(fèi)[6-8]。近年來(lái)，利用生物酶法處理低值蛋白制備呈味肽和生物活性肽，是大宗低值蛋白深加工的一個(gè)研究熱點(diǎn)[9]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的咸味肽主要是一些小分子二肽類(lèi)，這些二肽類(lèi)物質(zhì)(如γ-Glu-Phe和γ-Glu-Tyr)不僅具有咸味，由于其富含的γ-Glu還使得其具有鮮味與輕微酸味[10]。Toelstede等[11]的研究表明奶酪中含有L-Arg的多肽也具有咸味增強(qiáng)作用。此外，咸味肽對(duì)于糖尿病、心血管疾病、高血壓等需要低鈉飲食的特殊人群有著重要的功能價(jià)值，Zhu等[12]從無(wú)鹽醬油中分離出的二肽不僅具有咸味，而且可以通過(guò)抑制ACE而達(dá)到降血壓的目的。本研究以豌豆蛋白為原料，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)豌豆蛋白風(fēng)味蛋白酶酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，分析最佳酶解工藝產(chǎn)物的肽分子量分布、氨基酸組成等特性，以期為豌豆蛋白制備咸味肽的深入研究提供理論與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料與試劑

豌豆蛋白粉：山東六六順食品有限公司；風(fēng)味蛋白酶、37071堿性蛋白酶：諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；胰酶：全新祥盛生物科技有限公司；50 C、Umami G鮮味酶：天野酶制劑(江蘇)有限公司；菠蘿蛋白酶：重慶驕王天然產(chǎn)物股份有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、硫酸鉀、甲醛等常用化學(xué)試劑(均為分析純)：天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙腈(色譜純)：科密歐化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸(色譜純)：上海阿拉丁公司；肽分子量標(biāo)品(牛血清蛋白、細(xì)胞色素C、抑肽酶、桿菌肽、Gly-Gly-Gly，色譜純)：美國(guó)Sigma公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

THZ-C臺(tái)式恒溫振蕩器 太倉(cāng)市華美生化儀器廠；KDN-103F微量凱式定氮儀、KDN-40八孔消化爐 上海纖檢儀器有限公司；Scientz-18N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司；雷磁PHS-3E pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；GL-21M型高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；LC-15C液相色譜儀 島津?qū)嶒?yàn)器材有限公司。

1.2 豌豆蛋白深度酶解工藝優(yōu)化

1.2.1 豌豆蛋白酶解產(chǎn)物的制備

豌豆蛋白粉→加水搖勻(料液比為1∶9)→調(diào)節(jié)pH(0.1 mol/L KOH溶液)→酶解一定時(shí)間→滅酶(沸水浴10 min)→離心(8000 r/min，15 min)→取上清液→豌豆蛋白酶解產(chǎn)物→冷凍干燥備用。

1.2.2 不同蛋白酶對(duì)豌豆蛋白酶解的影響

稱取10 g豌豆蛋白粉，加入90 g的水溶解，用1 mol/L KOH溶液分別將豌豆蛋白水溶液調(diào)節(jié)pH至6種蛋白酶的最適pH，分別加入豌豆蛋白質(zhì)量0.1%的風(fēng)味蛋白酶、37071堿性蛋白酶、胰酶、50 C、Umami G鮮味酶、菠蘿蛋白酶置于50 ℃空氣搖床分別水解3，6，9，12，24 h后離心得到豌豆蛋白酶解液。測(cè)定不同種類(lèi)蛋白酶對(duì)豌豆蛋白深度酶解的影響，進(jìn)而篩選出一種效果較好的蛋白酶進(jìn)行后續(xù)的工藝優(yōu)化。

續(xù) 表

1.2.3 酶解溫度對(duì)豌豆蛋白酶解的影響

稱取10 g豌豆蛋白粉，加入90 g的水溶解，用1 mol/L KOH溶液將豌豆蛋白水溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，加入豌豆蛋白質(zhì)量0.1%的風(fēng)味蛋白酶，分別置于45，50，55，60 ℃的空氣搖床中水解24 h后離心得到豌豆蛋白酶解液。測(cè)定不同酶解溫度對(duì)豌豆蛋白深度酶解的影響。

1.2.4 酶解pH對(duì)豌豆蛋白酶解的影響

稱取10 g豌豆蛋白粉，加入90 g的水溶解，用1 mol/L KOH溶液將豌豆蛋白水溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，8.0，9.0，10.0，加入豌豆蛋白質(zhì)量0.1%的風(fēng)味蛋白酶，置于50 ℃的空氣搖床中水解24 h后離心得到豌豆蛋白酶解液。測(cè)定不同pH對(duì)豌豆蛋白深度酶解的影響。

1.2.5 總氮和氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定

總氮含量根據(jù)GB 5009.5-2010測(cè)定。氨基酸態(tài)氮含量采用甲醛滴定法測(cè)定[13]。

1.2.6 水解度和蛋白質(zhì)回收率的計(jì)算[14]

1.2.7 酶解產(chǎn)物肽分子量分布的測(cè)定

將豌豆蛋白水解液凍干樣品加水稀釋至蛋白濃度為10 mg/mL，采用高效液相色譜測(cè)定酶解液中肽分子量分布情況，凝膠柱型號(hào)為T(mén)SK gel G2000 SWXL分析柱，流動(dòng)相為乙腈∶水∶TFA為25∶75∶0.1，流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。標(biāo)準(zhǔn)肽樣品分別為：牛血清蛋白(68000 Da)、細(xì)胞色素C(12384 Da)、抑肽酶(6511 Da)、桿菌肽(1423 Da)、Gly-Gly-Gly(189 Da)。以保留時(shí)間x為橫坐標(biāo)，相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)y為縱坐標(biāo)，繪制相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線并得到方程：y=-0.288x+8.1408，R2=0.985。

1.2.8 酶解產(chǎn)物氨基酸組成分析

參照孫媛媛等[15]的方法并加以修改，準(zhǔn)確稱取0.1 g樣品，在水解管中加入6 mol/L鹽酸5 mL，封口，然后放在(110±1) ℃的恒溫干燥箱內(nèi)水解24 h，取出冷卻。打開(kāi)水解管，過(guò)濾水解液，用去離子水多次沖洗水解管，將水解液全部轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中定容。吸取1～2 mL定容后的樣品，置于60 ℃恒溫干燥箱中脫酸。向脫酸后的樣品中加入1～3 mL緩沖液，均勻振蕩，用注射器吸取少量，過(guò)0.22～0.45 μm濾膜后裝入樣品瓶中上機(jī)分析。

1.2.9 酶解產(chǎn)物感官評(píng)定

參照GB/T 16291.1-2012和劉通訊等[16]的方法進(jìn)行感官評(píng)價(jià)分析。感官評(píng)價(jià)小組包括5男5女，年齡在16～25歲，感官評(píng)價(jià)室的溫度為(24±1) ℃。感官評(píng)定員在感官評(píng)定之前經(jīng)過(guò)基本滋味培訓(xùn)，熟悉豌豆酶解產(chǎn)物的風(fēng)味特征和感官?gòu)?qiáng)度，進(jìn)行培訓(xùn)的標(biāo)準(zhǔn)品分別是甜味(1%蔗糖)、咸味(0.35%食用鹽)、鮮味(0.2%味精)、苦味(0.02 g/L鹽酸奎寧)、酸味(0.04%檸檬酸)。樣品溶液取10 mL置于杯中，評(píng)定員將樣品溶液全部倒入口中，并保持10 s左右，隨后將其吐出。感官評(píng)定使用評(píng)分法，0～9分制(0～1：無(wú)感覺(jué)，2～3：閾值感覺(jué)，4～5：感覺(jué)微弱，6～7：感覺(jué)中等，8～9：感覺(jué)強(qiáng)烈)，用雷達(dá)圖表示定量描述分析結(jié)果[17]。

2 豌豆蛋白深度酶解工藝單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶對(duì)豌豆蛋白酶解的影響

蛋白質(zhì)經(jīng)深度酶解后會(huì)產(chǎn)生游離的呈味氨基酸和呈味肽，大量實(shí)驗(yàn)表明，在一定時(shí)間范圍內(nèi)水解時(shí)間越長(zhǎng)，水解度越高，水解產(chǎn)物所表現(xiàn)出的呈味強(qiáng)度越高[18]。本實(shí)驗(yàn)選取了6種不同的蛋白酶水解豌豆蛋白并對(duì)其水解度、蛋白回收率和感官進(jìn)行了評(píng)價(jià)，從而篩選出水解效率最高的酶。

由圖1可知，6種蛋白酶對(duì)豌豆蛋白溶液均產(chǎn)生了不同程度的水解，Umami G鮮味酶、風(fēng)味蛋白酶、胰酶的效果較為明顯。在酶解3～24 h內(nèi)，酶解時(shí)間越長(zhǎng)，水解度和蛋白回收率越高；在水解24 h后，Umami G鮮味酶水解度最高，風(fēng)味蛋白酶次之，分別達(dá)到了37.56%和20.21%。Umami G鮮味酶蛋白回收率最高，胰酶和風(fēng)味蛋白酶次之，分別達(dá)到了71.04%、67.29%和59.44%。由1中C可知，感官評(píng)價(jià)顯示風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物的咸味和鮮味最為突出，其他幾種酶均表現(xiàn)出明顯的苦味，胰酶尤為明顯。綜合考慮水解效率、感官評(píng)價(jià)這兩種指標(biāo)，選擇風(fēng)味蛋白酶進(jìn)一步研究酶解效果。

圖1 不同蛋白酶對(duì)豌豆蛋白酶解的影響Fig.1 Effect of different proteases on pea protein hydrolysis

2.2 酶解溫度對(duì)豌豆蛋白酶解的影響

由圖2中A可知，酶解24 h后，豌豆蛋白酶解液的水解度和蛋白回收率都隨著溫度的升高先增大后減小，在酶解溫度為50 ℃時(shí)水解度和蛋白回收率均達(dá)到最高，分別為19.12%和48.88%。由圖2中B可知，感官評(píng)價(jià)顯示在50 ℃時(shí)豌豆蛋白酶解液的鮮味和咸味最明顯，這一結(jié)果與張典等[19]研究的溫度對(duì)風(fēng)味蛋白酶酶解牡蠣的影響基本一致。因此，選取50 ℃為風(fēng)味蛋白酶的最適溫度。

圖2 酶解溫度對(duì)豌豆蛋白酶解的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on pea protease hydrolysis

2.3 pH對(duì)豌豆蛋白酶解的影響

pH的調(diào)控在蛋白體系酶解中發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用，通過(guò)影響酶分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和底物的解離，進(jìn)而影響酶解效率[20]。

由圖3中A可知，隨著pH的增大，豌豆蛋白酶解液的水解度和蛋白回收率隨之減小，在pH為7.0時(shí)，水解度和蛋白回收率分別達(dá)到最大值22.63%和58.08%。由圖3中B可知，感官評(píng)價(jià)顯示在pH為7.0時(shí)豌豆蛋白酶解液的鮮味和咸味最明顯，這表明風(fēng)味蛋白酶在較佳pH下促進(jìn)蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生肽和氨基酸，增加了產(chǎn)品的滋味和香氣。因此，選取pH 7.0為風(fēng)味蛋白酶的最適pH。

圖3 酶解pH對(duì)豌豆蛋白酶解的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis pH values on pea protease hydrolysis

2.4 豌豆蛋白酶解產(chǎn)物肽分子量分布

采用高效液相色譜法測(cè)定豌豆蛋白酶解產(chǎn)物的肽分子量分布，由表1可知，在最佳酶解條件下對(duì)豌豆蛋白分別水解不同時(shí)間得到的酶解產(chǎn)物的相對(duì)分子量主要集中在5 kDa以下的肽段范圍內(nèi)(>60%)，并且隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，大分子肽段(1～50 kDa)含量減少，小分子肽段(0.5～1 kDa)含量增加。其中在酶解24 h的樣品中<1 kDa的肽段達(dá)到了65.60%，說(shuō)明在24 h后豌豆蛋白經(jīng)深度酶解得到了一系列的小分子肽。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道分子質(zhì)量<3 kDa的小分子肽對(duì)食品的滋味有重要影響，是食品滋味的重要貢獻(xiàn)者[21]。

表1 豌豆蛋白酶解產(chǎn)物肽分子量分布Table 1 The molecular weight distribution of peptides of pea protein hydrolysates

2.5 豌豆蛋白深度酶解產(chǎn)物氨基酸組成分析

由表2可知，豌豆蛋白深度酶解產(chǎn)物中游離氨基酸種類(lèi)齊全，富含高達(dá)39.16%的人體和動(dòng)物必需的氨基酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。其中鮮味氨基酸和甜味氨基酸(主要是谷氨酸和天冬氨酸)是良好呈味基料的基礎(chǔ)，且含量分別達(dá)到36.79%和15.03%。在整體感官評(píng)價(jià)中，也證明了酶解產(chǎn)物具有顯著的鮮味和鮮味特征，為開(kāi)發(fā)制備高品質(zhì)調(diào)味品奠定了良好的基礎(chǔ)。

表2 豌豆蛋白酶解產(chǎn)物氨基酸組成分析

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，以水解度、蛋白回收率和感官評(píng)分為指標(biāo)，確定豌豆蛋白深度酶解最佳工藝條件為：風(fēng)味蛋白酶酶解溫度50 ℃，酶解pH 7.0，酶解時(shí)間24 h。在最佳酶解工藝下對(duì)豌豆蛋白進(jìn)行深度酶解，酶解液水解度達(dá)到22.63%，蛋白回收率達(dá)到58.08%，感官評(píng)價(jià)顯示具有顯著的鮮味和咸味。所獲得的豌豆蛋白深度酶解產(chǎn)物中分子量<1 kDa的小分子肽含量為65.60%。豌豆蛋白深度酶解產(chǎn)物游離氨基酸中必需氨基酸含量為39.16%，鮮味氨基酸含量為36.79%，甜味氨基酸含量為15.03%。本研究通過(guò)一系列的條件探索，最終得到了豌豆蛋白酶解的最佳條件，從而得到一種具有良好呈味特性的小分子肽混合物，并且通過(guò)測(cè)定豌豆蛋白酶解產(chǎn)物的水解度、蛋白回收率、感官分析、氨基酸分析和肽分子量分布等特性對(duì)呈味特性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步提高豌豆蛋白的利用率提供了數(shù)據(jù)支持，為以咸味肽為基料制備高級(jí)調(diào)味品奠定了良好的基礎(chǔ)。