劉煒熹 張業(yè)輝 張友勝 焦文娟 趙甜甜 周東來 黃利華 鐘偉銳

摘 要：研究烏鱧魚皮膠原蛋白肽在20～52 ℃低溫誘導(dǎo)下自組裝體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與理化性質(zhì)，比較分析聚集體變化過程中圓二色譜、自組裝動力學(xué)、微觀結(jié)構(gòu)、凝膠強(qiáng)度、粒徑、黏度、變性溫度和紅外光譜的變化。結(jié)果表明：在20～30 ℃溫度范圍內(nèi)，升溫對烏鱧魚皮膠原蛋白肽自組裝速率及聚集體穩(wěn)定性具有促進(jìn)作用，組裝成核時間縮短13.5 min，形成的三維網(wǎng)絡(luò)致密性增強(qiáng)，平均粒徑增大，凝膠強(qiáng)度從50.23 g/cm2升高至212.55 g/cm2（P<0.05），最大剪切黏度增加549.34%，β-折疊相對含量增加45.42%，膠原蛋白肽結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性顯著增強(qiáng);在30～52 ℃溫度范圍內(nèi)，升溫促使纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)生溶解和絮集，凝膠強(qiáng)度降低97.87%（P<0.05），粒徑降低46.16%，最大剪切黏度和β-折疊相對含量降低;差示量熱掃描測定結(jié)果表明，聚集體自組裝程度越高，其熱穩(wěn)定性越強(qiáng)。因此，適宜的溫度可有效改善烏鱧魚皮膠原蛋白肽纖維網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及理化性質(zhì)。

關(guān)鍵詞：烏鱧魚皮膠原蛋白肽;溫度;自組裝;微觀結(jié)構(gòu);理化特性

Effect of Temperature on Aggregation Structure and Physicochemical Properties of Collagen Peptide from Snakehead Fish （Channa argus） Skin

LIU Weixi1， ZHANG Yehui1，*， ZHANG Yousheng1， JIAO Wenjuan1， ZHAO Tiantian1， ZHOU Donglai1， HUANG Lihua2， ZHONG Weirui3

（1.Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing， Key Laboratory of Functional Foods，

Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Sericulture and Agri-Food Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou 510610， China; 2.Department of Food， Guangzhou City Polytechnic， Guangzhou 510405， China;

3.Shanwei Wufeng Marine Biotechnology Co. Ltd.， Shanwei 516626， China）

Abstract： This study was designed in order to investigate the structure and physicochemical properties of self-assembled collagen peptide （CP） from snakehead fish skin induced by low temperatures 20–52 ℃ and to compare changes in circular dichroism （CD） spectra， self-assembly kinetics， microstructure， gel strength， particle size， viscosity， denaturation temperature and infrared spectra during the aggregation process. The results indicated that the increase of temperature in the range of 20–30 ℃ could promote the self-assembly rate and aggregate stability of CP， reduce the assembly nucleation time by

13.5 min， lead to the formation of a more compact three-dimensional network， increase the average aggregate size， raise the gel strength significantly from 50.23 to 212.55 g/cm2 （P < 0.05）， increase the maximum shear viscosity by 549.34% and β-sheet content by 45.42%， and significantly enhance the structural stability of CP. However， the increase of temperature in the range of 30–52 ℃ could facilitate the dissolution and flocculation of the fibrous network structure， decrease the gel strength by 97.87% （P < 0.05） and the average particle size of aggregates by 46.16% （P < 0.05）， and reduce the maximum shear viscosity and β-sheet content. Differential scanning calorimetric （DSC） results showed that the higher the degree of self-assembly， the stronger the thermal stability. In conclusion， the fibrous network structure stability and physicochemical properties of CP could be effectively improved at a suitable temperature.

Keywords： Channa argus skin collagen peptide; temperature; self-assembly; microstructure; physicochemical properties

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210428-115

中圖分類號：TS254.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2021）06-0001-09

引文格式：

劉煒熹， 張業(yè)輝， 張友勝， 等. 溫度對烏鱧魚皮膠原蛋白肽聚集體結(jié)構(gòu)及理化特性的影響[J]. 肉類研究， 2021， 35（6）： 1-9. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210428-115.? ? http：//www.rlyj.net.cn

LIU Weixi， ZHANG Yehui， ZHANG Yousheng， et al. Effect of temperature on aggregation structure and physicochemical properties of collagen peptide from snakehead fish （Channa argus） skin[J]. Meat Research， 2021， 35（6）： 1-9. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210428-115.? ? http：//www.rlyj.net.cn

我國水域遼闊，水產(chǎn)資源豐富，水產(chǎn)品總產(chǎn)量常年居于世界首位。2020年我國水產(chǎn)品總產(chǎn)量為6 545.02 萬t，

其中淡水產(chǎn)品總產(chǎn)量為3 234.64 萬t，同比增長約1.15%[1]。烏鱧（Channa argus）是我國主要淡水魚養(yǎng)殖品種，其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價值高。在我國，多有術(shù)后患者和孕婦食用烏鱧的習(xí)慣，食用烏鱧可生肌活血、促進(jìn)傷口收斂、加速表面?zhèn)谟蟍2]。烏鱧還具有增強(qiáng)記憶力和抗疲勞功效，體弱者食用烏鱧可快速恢復(fù)體力[3]。此外，烏鱧體表會分泌一種特殊黏液，不僅可以快速修復(fù)損傷表皮，還具有一定的抑菌活性。當(dāng)前，烏鱧生產(chǎn)加工產(chǎn)品主要是凍魚片和生魚肉，在烏鱧加工過程中，魚皮、魚骨等加工副產(chǎn)物通常利用價值低，其中富含的生物活性成分未能得到有效的開發(fā)與利用。因此，提高加工副產(chǎn)物的利用率和利用價值，也是水產(chǎn)加工行業(yè)提高經(jīng)濟(jì)利益的途徑之一。

膠原蛋白肽產(chǎn)量豐富，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥等行業(yè)，不僅具有抗氧化、抗皺延衰、增強(qiáng)免疫力、降血壓血脂、美白肌膚和保濕鎖水等多種功效，且低溫條件下具有良好的生物活性。當(dāng)前，已有關(guān)于膠原蛋白與溫度關(guān)系的研究。如許蓉等[4]研究不同溫度對雞胸軟骨Ⅱ型膠原蛋白溶液的影響，研究發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白的黏度和結(jié)構(gòu)與溫度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，隨著溫度升高，膠原蛋白黏度減小，螺旋分解增加。Aukkanit等[5]研究不同提取溫度對銀線魚膠原蛋白自組裝纖維的影響，結(jié)果表明，10 ℃條件下提取的膠原蛋白不僅具有較高的自組裝率，而且自組裝纖維直徑更大。Zhu Shichen等[6]研究不同溫度條件下（20～37 ℃）草魚膠原蛋白的微流變學(xué)特性發(fā)現(xiàn)，升溫對膠原纖維網(wǎng)絡(luò)的形成具有促進(jìn)作用，且纖維緊密性增強(qiáng)。當(dāng)前有關(guān)溫度與烏鱧膠原蛋白肽自組裝關(guān)系的研究較少。因此，本研究采用烏鱧副產(chǎn)物魚皮制備膠原蛋白肽，探究不同溫度對膠原蛋白肽自組裝聚集體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及理化性質(zhì)的影響，為膠原蛋白肽自組裝改性方面的進(jìn)一步研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烏鱧活魚（質(zhì)量約500 g），購于廣州華潤萬家超市。

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純） 福晨化學(xué)試劑有限公司;戊二醛、氫氧化鈉（均為分析純） 天津市大茂化學(xué)試劑廠;乙酸（分析純） 江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司;無水乙醇（分析純） 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;正丁醇（分析純） 天津市富宇精細(xì)化工有限公司;胃蛋白酶 上海源葉生物科技有限

公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JascoJ-815圓二色譜儀 日本分光公司;UV-1800紫外分光光度計 日本島津公司;S-3400N掃描電子顯

微鏡 日本日立公司;WJL-628激光粒度分析儀 上海

儀電物理光學(xué)儀器公司;ST85B3-1真空冷凍干燥機(jī) 美國

Milirock公司;DSC200F3差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 德國Netzsch公司;AR-1500 EX流變儀 美國TA公司;LRH-250F生化

培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;VERTEX33傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司;TA-XT.Plus物性分析儀 英國Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 烏鱧魚皮膠原蛋白肽的制備

參考文獻(xiàn)[7-9]的方法，首先將烏鱧魚皮洗凈切碎，以料液比1∶10（m/V）將魚皮加入0.1 mol/L NaOH中，反應(yīng)24 h去除膠原蛋白中的色素和雜蛋白，魚皮取出后用超純水沖洗至中性并瀝干;以料液比1∶10添加體積分?jǐn)?shù)10%正丁醇溶液，與魚皮混合反應(yīng)24 h進(jìn)行脫脂處理，取出魚皮，用超純水沖洗至中性后瀝干;再以0.5 mol/L乙酸作為溶劑，以料液比1∶10添加至瀝干后的魚皮中，提取膠原蛋白48 h，隨后將溶液

10 000 r/min、4 ℃離心20 min獲得上清液;向上清液中加入NaCl鹽析至出現(xiàn)沉淀，4 ℃、8 000 r/min離心10 min后取沉淀，以料液比1∶10用0.5 mol/L乙酸復(fù)溶，隨后采用去離子水（1∶50，V/V）透析24 h，將透析液凍干，獲得膠原蛋白。

將膠原蛋白復(fù)溶于0.1 mol/L乙酸后采用胃蛋白酶（酶比活力1∶3 000），10 ℃酶解2 h，獲得膠原蛋白肽溶液。

1.3.2 圓二光譜測定

將1.3.1節(jié)酶解所得質(zhì)量濃度0.5 mg/mL膠原蛋白肽溶液在pH 4、不同溫度（20、25、30、37、42、52 ℃）條件下自組裝10 min后，分別移取300 μL膠原蛋白肽溶液于光程為1 mm的比色皿中，在波長190～260 nm、持續(xù)通入氮氣的條件下進(jìn)行圓二光譜掃描，實驗重復(fù)2 次[10]。

1.3.3 濁度測定

參考賈俊強(qiáng)[11]、Leo[12]等方法并略作修改，使用紫外分光光度計測定不同溫度（4、20、25、28、30、37、42、52 ℃）條件下，pH 7、1 mg/mL膠原蛋白肽自組裝過程中吸光度。波長設(shè)為313 nm，將樣品放置于恒溫環(huán)境中，每隔1 min采集吸光度數(shù)據(jù)。

1.3.4 掃描電子顯微鏡觀察

采用掃描電子顯微鏡觀察不同溫度（20、25、30、37、42、52 ℃）條件下，pH 7、質(zhì)量濃度10 mg/mL、自組裝10 min膠原蛋白肽凝膠的形貌與微觀結(jié)構(gòu)。上機(jī)樣品參照Chen等[13]方法進(jìn)行制備。

1.3.5 凝膠強(qiáng)度測定

參考宋曉敏等[14]的方法并略作修改，采用物性分析儀對不同溫度條件下，pH 7、質(zhì)量濃度10 mg/mL、自組裝10 min膠原蛋白肽凝膠的凝膠強(qiáng)度進(jìn)行測定，選用P/0.5圓柱探頭做穿刺實驗，參數(shù)設(shè)定為：觸發(fā)力5 g，測試前、測試中和測試后速率均為1.0 mm/s，應(yīng)變50%。

1.3.6 粒徑測定

取等量的不同溫度條件下膠原蛋白肽溶液自組裝10 min后樣品，置于超純水中配制成質(zhì)量濃度2 g/100 mL分散溶液，采用激光粒度分析儀測定膠原蛋白肽自組裝顆粒粒徑分布。

1.3.7 黏度測定

采用流變儀測定不同溫度條件下處理膠原蛋白肽凝膠的黏度（剪切應(yīng)力）曲線。將3 mL pH 7、10 mg/mL膠原蛋白肽溶液置于測試平臺上，測定條件設(shè)置為平板直徑40 mm，測試前溫度20、25、30、37、42、52 ℃，測試前平衡時間（自組裝時間）5 min，平衡后將溫度設(shè)為常溫25 ℃，在剪切速率為0.01～0.1 s-1變化范圍內(nèi)測定黏度變化[15]。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜測定

將不同溫度條件下自組裝膠原蛋白肽樣品凍干后分別與KBr混合，樣品（1～2 mg）與KBr質(zhì)量比1∶100，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)測定樣品傅里葉變換紅外光譜[10]。

1.3.9 熱變性溫度測定

參考Jolanta等[16]方法，將烏鱧魚皮膠原蛋白肽溶液在不同pH值（pH 4、6、7、8、9、10）、溫度30 ℃條件下自組裝1 h處理樣品冷凍干燥后，以空的鋁制坩堝作為對照。DSC測定方法：準(zhǔn)確稱取10 mg膠原蛋白肽凍干樣品，用20 μL超純水充分溶脹24 h（4 ℃），溫度掃描范圍為20～60 ℃，升溫速率2 ℃/min，樣品室氮氣流速20 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS v26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和結(jié)果分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;紅外光譜圖使用PeakFit 4.12軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理;圓二色譜數(shù)據(jù)采用Prodata軟件處理;所有數(shù)據(jù)圖均采用Origin 9.0軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對烏鱧魚皮膠原蛋白肽圓二色譜的影響

RPN. 正吸收峰與負(fù)吸收峰的比值（ratio of positive to negative）。

圓二色譜通過測定生物大分子物質(zhì)的手性結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的左右旋光差異吸收來分析生物分子結(jié)構(gòu)，可用于分析膠原蛋白肽鏈三螺旋結(jié)構(gòu)[17]。由圖1可知，膠原蛋白肽存在2 個極為明顯的吸收峰，其中195～205 nm有一個負(fù)吸收峰，215～225 nm存在一個正吸收峰，這是膠原蛋白肽三螺旋結(jié)構(gòu)在圓二光譜圖中的吸收性質(zhì)[18]。其中，RPN與膠原蛋白的螺旋程度呈現(xiàn)正相關(guān)[11]，反映了膠原蛋白肽分子中的螺旋區(qū)域與非螺旋區(qū)域的相對含量[19]。不同溫度條件對峰值具有一定的影響，膠原蛋白肽在20、25、30 ℃條件下的圓二色譜圖與RPN變化并不明顯，說明在此溫度下膠原蛋白肽鏈仍保持良好的三螺旋結(jié)構(gòu)，但隨著溫度的升高，其負(fù)吸收峰逐漸增大，說明在達(dá)到變性溫度前，升溫可促進(jìn)膠原蛋白肽自組裝，在保持原有結(jié)構(gòu)的條件下，自組裝有利于膠原蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。當(dāng)溫度處于37 ℃時，其負(fù)吸收峰峰值明顯增加，正吸收峰消失，RPN驟然下降，說明在該溫度下，膠原蛋白肽三螺旋結(jié)構(gòu)已經(jīng)完全打開，此時膠原蛋白肽鏈為松散的3 條亞基鏈[20]。原因可能是由于溫度達(dá)到了膠原蛋白肽的變性溫度，膠原蛋白肽三螺旋結(jié)構(gòu)因溫度的升高而分解，變得松散，相比于37 ℃圓二光譜吸收曲線，42 ℃及52 ℃處理時變化并不明顯，可能是膠原蛋白肽處于某一溫度范圍，某部分結(jié)構(gòu)受到溫度影響較為明顯，但其結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步崩解需要更高的溫度。這說明高溫長時間處理會引起膠原蛋白肽解螺旋，出現(xiàn)三螺旋向單體的轉(zhuǎn)變，最終可能引起烏鱧皮膠原蛋白肽的自組裝方式發(fā)生變化。

2.2 溫度對烏鱧魚皮膠原蛋白肽自組裝速率的影響

不少研究者[21-22]認(rèn)為，膠原蛋白肽自組裝過程可在波長313 nm條件下進(jìn)行檢測，通過313 nm波長處的吸光度變化來反映不同外界條件下膠原蛋白肽自組裝過程所需時間長短。由圖2可知，烏鱧魚皮膠原蛋白肽自組裝過程吸光度變化曲線為S型，其自組裝過程分為成核期（吸光度增加緩慢）、生長期（吸光度快速增加）和平衡期（吸光度不變）3 個階段[12，23]。20 ℃條件下膠原蛋白肽成核時間（18.5 min）明顯長于其他溫度條件下的成核時間，且隨著溫度的升高（20～52 ℃），自組裝所需成核時間逐漸縮短，生長期斜率增大，組裝效率增加;這是由于膠原蛋白肽是一種兩親性分子，在氫鍵作用下分子表面形成水合層，當(dāng)溫度較低時，分子間運動遲緩，水分子無法突破氫鍵的作用，水合層阻隔了膠原蛋白肽分子間的聚集，從而抑制自組裝的進(jìn)行[24]，而升溫可提升分子運動能力，增大分子碰撞幾率，導(dǎo)致水層破壞，使得更多活性基團(tuán)暴露，從而促進(jìn)膠原蛋白肽分子間的自組裝[25]。

但當(dāng)溫度超過膠原蛋白肽變性溫度（32 ℃）時[26]，

平衡期吸光度出現(xiàn)降低，42 ℃處理的膠原蛋白肽最大吸光度為1.912，明顯低于非變性溫度下的吸光度，且其吸光度持續(xù)下降，而52 ℃處理的膠原蛋白肽最大吸光度為0.977，在超過變性溫度條件下仍存在吸光度升高的現(xiàn)象，這可能是在升溫（5～52 ℃）過程中，膠原蛋白肽分子發(fā)生變性需要一定的時間，故樣品仍出現(xiàn)短時間的自組裝聚集現(xiàn)象?？梢姡瑸貅k魚皮膠原蛋白肽擁有較低的變性溫度，當(dāng)超過變性溫度時，吸光度雖然仍在增加，但纖維生長的同時帶來纖維的崩解，當(dāng)纖維崩解速率大于纖維生長速率時，吸光度降低。

2.3 溫度對烏鱧魚皮膠原蛋白肽聚集體微觀結(jié)構(gòu)的影響

A. 20 ℃;B. 25 ℃;C. 30 ℃;D. 37 ℃;E. 42 ℃;F. 52 ℃。

由圖3可知，不同溫度條件對烏鱧魚皮膠原蛋白肽三維網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)形貌影響不同。當(dāng)溫度為20 ℃時，膠原蛋白肽自組裝緩慢，形成凝膠程度不高，凝膠纖維直徑及密度較后期組裝的凝膠纖維相對較小，這是由于溫度過低，膠原蛋白肽分子運動速率較低，自組裝動力不足導(dǎo)致。隨著溫度的升高（20～30 ℃），膠原蛋白肽三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)得到明顯的改善，其表面變得平滑、均勻，孔隙變小，三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得更為有序和致密。但隨著溫度的繼續(xù)升高（30～37 ℃），有序纖維結(jié)構(gòu)向無序轉(zhuǎn)變，這是由于烏鱧魚皮膠原蛋白肽到達(dá)變性溫度所導(dǎo)致，而Liu Wentao等[26]測得烏鱧魚皮膠原蛋白溶液的變性溫度為32 ℃，說明膠原纖維聚集，逐漸靠攏，以抵抗高溫帶來的蛋白變性。當(dāng)溫度繼續(xù)升高至42 ℃，纖維結(jié)構(gòu)孔隙增大，表層纖維由于高溫發(fā)生溶解，纖維直徑變細(xì)，未溶解纖維靠攏，無序結(jié)構(gòu)增多;當(dāng)溫度達(dá)到52 ℃，纖維結(jié)構(gòu)逐步崩潰，大部分纖維溶解及形成絮狀結(jié)構(gòu)，該現(xiàn)象與高昕等[27]關(guān)于刺參膠原纖維在變性溫度條件下出現(xiàn)的現(xiàn)象基本一致，這是由于高溫部分破壞了膠原纖維的三螺旋結(jié)構(gòu)，纖維間的共價鍵遭到破壞，纖維變性收縮發(fā)生聚集，膠原蛋白肽凝膠網(wǎng)絡(luò)被破壞。該結(jié)構(gòu)變化與吸光度變化規(guī)律相符，蛋白質(zhì)纖維的形成有其最適溫度，如乳清蛋白纖維形成的最適溫度為178 ℃[28]，膠原蛋白肽自組裝最適溫度應(yīng)為30 ℃，適宜的溫度條件下可以增強(qiáng)膠原蛋白肽分子的運動能力，使其突破水合層，有助于纖維間氫鍵、二硫鍵等次級結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步形成，提高組裝效率的同時，還能提高結(jié)構(gòu)的緊密性，而過低溫度會抑制膠原蛋白肽纖維的形成，過高的溫度則會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性。

2.4 溫度對烏鱧魚皮膠原蛋白肽凝膠強(qiáng)度的影響

凝膠強(qiáng)度是用于表征蛋白質(zhì)凝膠特性的重要指標(biāo)，凝膠強(qiáng)度的大小可反映蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的質(zhì)量，與蛋白聚集程度及蛋白聚集體大小緊密相關(guān)[29]。由于烏鱧膠原蛋白肽自組裝形成的凝膠具有一定的彈韌性，可以承受一定的外部壓力，可根據(jù)凝膠所能承受的極限壓力測定其凝膠強(qiáng)度大小[30]。

小寫字母不同，表示不同溫度條件下

同一指標(biāo)間差異顯著（P<0.05）。圖6同。

由圖4可知，烏鱧魚皮膠原蛋白肽凝膠破斷力、破斷距離及凝膠強(qiáng)度隨著溫度的持續(xù)升高均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，隨著溫度的升高（20～30 ℃），聚集體凝膠強(qiáng)度從50.23 g/cm2顯著升高至212.55 g/cm2（P<0.05），由于溫度的升高有助于膠原蛋白肽分子間的運動，增加了膠原蛋白肽分子的碰撞幾率，促進(jìn)了膠原蛋白肽分子間的二硫鍵、氫鍵等次級結(jié)構(gòu)的形成，從而促進(jìn)膠原蛋白肽的自組裝，未聚集的膠原蛋白肽分子聚集率增加，凝膠化程度增加。隨著溫度的繼續(xù)升高（30～52 ℃），膠原蛋白肽凝膠強(qiáng)度從212.55 g/cm2顯著降至4.52 g/cm2（P<0.05），而膠原蛋白肽聚集體的破斷力也出現(xiàn)相同的變化趨勢，這也說明膠原蛋白肽凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在超過變性溫度32 ℃[26]情況下，內(nèi)部出現(xiàn)了部分坍塌[31-32]。膠原蛋白肽在30 ℃條件下凝膠強(qiáng)度最高，該條件更有助于膠原蛋白肽的自組裝。處理溫度決定了膠原蛋白肽的變性程度和熱聚集體含量，影響參與凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的膠原蛋白肽分子的數(shù)量，從而影響膠原蛋白肽聚集體的凝膠強(qiáng)度[33]。

2.5 溫度對烏鱧魚皮膠原蛋白肽黏度的影響

由圖5可知，不同溫度處理條件下烏鱧魚皮膠原蛋白肽均呈現(xiàn)出剪切變稀現(xiàn)象，表現(xiàn)為典型非牛頓流體的假塑性流動行為，與前人研究[34-35]結(jié)果一致。低剪切速率下，膠原蛋白肽聚集體的剪切黏度均出現(xiàn)了短暫升高，這是由于膠原蛋白肽自組裝形成纖維空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在受力形變前產(chǎn)生的阻力作用，從而導(dǎo)致黏度出現(xiàn)短暫增加[36]。當(dāng)剪切力達(dá)到一定程度時，纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)逐步潰散，黏度降低，從而表現(xiàn)為剪切稀釋。

不同溫度下自組裝膠原蛋白肽聚集體的黏度存在一定差異。隨著溫度的升高，聚集體的初始黏度與最大黏度均呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，導(dǎo)致其黏度增大的原因是溫度升高促進(jìn)分子間運動，分子間碰撞加劇，水化層的破壞使得更多的疏水基團(tuán)結(jié)合，膠原蛋白肽分子相互纏結(jié)，形成更為穩(wěn)定的聚集體[37]，而膠原蛋白肽微觀纖維網(wǎng)絡(luò)緊密性和穩(wěn)定性的改變決定了宏觀黏度的變化[38]，30 ℃條件下的膠原蛋白肽黏度較大，說明其聚集程度較高，與微觀結(jié)構(gòu)及凝膠強(qiáng)度的測定結(jié)果相互印證，由于膠原蛋白肽自組裝有其最適溫度，故在30 ℃左右的條件下，膠原蛋白肽聚集體纖維緊密性最高，在剪切力作用下，其產(chǎn)生的黏度更高。而繼續(xù)升溫黏度降低是由于高溫導(dǎo)致膠原蛋白肽變性，從微觀結(jié)構(gòu)可以看出，纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生解聚或溶解，三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的緊密性降低，使得膠原蛋白肽的剪切阻力下降，最終導(dǎo)致黏度降低。

2.6 溫度對烏鱧魚皮膠原蛋白肽粒徑的影響

顆粒的粒徑大小反映了膠原蛋白肽的聚集程度。由圖6可知，溫度對膠原蛋白肽自組裝聚合物粒徑大小具有一定的影響，隨著溫度的升高（20～52 ℃），膠原蛋白肽自組裝顆粒粒徑呈先增加（由112.56 ?m增加至184.52 ?m）后降低（由184.52 ?m降低至99.34 ?m）的趨勢，在30 ℃時，膠原蛋白肽聚集體的平均粒徑達(dá)到最大值184.52 ?m，說明膠原蛋白肽在該溫度條件下形成的聚集體結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定，該變化趨勢與王艷[39]對不同溫度草魚皮膠原蛋白粒徑變化的研究相符，但其測得最適溫度為35 ℃，這可能是由于膠原蛋白的種類不同導(dǎo)致。在30～52 ℃溫度范圍內(nèi)，膠原蛋白肽聚集體的粒徑逐漸減小，這是由于膠原蛋白肽變性溫度條件下，形成自組裝聚集體結(jié)構(gòu)的共價鍵及非共價鍵因高溫遭到破壞，膠原蛋白肽纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生解聚，維持膠原蛋白肽三螺旋結(jié)構(gòu)的非共價鍵也遭到破壞，聚集結(jié)構(gòu)溶解，膠原蛋白肽聚集體粒徑隨之降低[40-41]。因此，適宜的處理溫度有利于形成更為穩(wěn)定且凝膠強(qiáng)度更好的聚集體。膠原蛋白肽自組裝有其較為適宜的溫度，過低的溫度會影響膠原蛋白肽自組裝速率或?qū)е陆M裝停滯，而過高溫度可使膠原蛋白肽變性，從而導(dǎo)致膠原蛋白肽聚集程度降低，顆粒粒徑下降。

2.7 溫度對烏鱧魚皮膠原蛋白肽聚集體二級結(jié)構(gòu)的影響

A. 4 ℃;B. 20 ℃;C. 25 ℃;D. 30 ℃;E. 37 ℃;F. 42 ℃;G. 52 ℃。

圖7為不同溫度條件下烏鱧膠原蛋白肽自組裝聚集體的紅外圖譜。蛋白質(zhì)中的C=O、N-H和C-N的振動方式與其二級結(jié)構(gòu)有關(guān)，多個紅外波段可用于反映鍵振動方式，其中，酰胺Ⅰ帶（1 600～1 700 cm-1）

可反映C=O的伸縮振動[42]。因此，本研究對不同溫度條件下烏鱧魚皮膠原蛋白肽自組裝聚集體的酰胺Ⅰ帶進(jìn)行分析，研究溫度對烏鱧魚皮膠原蛋白肽自組裝聚集體二級結(jié)構(gòu)的影響。其中，β-折疊所處波段為1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1，無規(guī)則卷曲為1 637～1 645 cm-1，α-螺旋為1 646～1 664 cm-1，β-轉(zhuǎn)角為1 664～1 681 cm-1[43]。

由表1可知，自組裝對烏鱧魚皮膠原蛋白肽二級結(jié)構(gòu)相對含量影響顯著（P<0.05），從Fan Daidi等[44]研究可知，膠原蛋白最低自組裝溫度約為22 ℃，達(dá)到該溫度時，膠原蛋白才會發(fā)生自組裝，因此，4 ℃條件下的烏鱧魚皮膠原蛋白肽并未發(fā)生自組裝反應(yīng)，但由于上述研究采用的膠原蛋白為類人膠原蛋白，與本研究不同，所以最低自組裝溫度可能存在差異。相較于4 ℃條件下的烏鱧魚皮膠原蛋白肽，20 ℃自組裝烏鱧魚皮膠原蛋白肽β-折疊相對含量無顯著變化，但無規(guī)則卷曲相對含量顯著降低22.66%（P<0.05），α-螺旋相對含量顯著增加22.08%（P<0.05），表明膠原蛋白肽在該溫度條件下可能已發(fā)生自組裝反應(yīng)。研究[45-47]表明，蛋白質(zhì)自組裝可促使二級結(jié)構(gòu)由無序狀態(tài)向有序狀態(tài)轉(zhuǎn)變，其中大量無規(guī)則卷曲形成β-折疊，凝膠纖維網(wǎng)絡(luò)逐步形成。β-折疊是多肽自組裝納米纖維的重要組成部分，其相對含量的升高表明更多納米纖維的形成。隨著溫度的持續(xù)升高，β-折疊相對含量先增加后降低，這是由于非變性溫度條件下，升溫有助于更穩(wěn)定的纖維結(jié)構(gòu)的形成;當(dāng)溫度到達(dá)37 ℃時，β-折疊相對含量出現(xiàn)降低，且隨著溫度的繼續(xù)升高，

β-折疊相對含量持續(xù)降低，表明膠原蛋白肽自組裝纖維結(jié)構(gòu)難以抵抗變性溫度的作用，其有序的β-折疊結(jié)構(gòu)逐步向無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變。

2.8 烏鱧魚皮膠原蛋白肽聚集體熱變性溫度分析

由圖8可知，不同pH值條件下烏鱧魚皮膠原蛋白肽自組裝后的DSC圖譜中存在一個明顯吸熱峰，這主要是膠原蛋白肽鏈螺旋結(jié)構(gòu)分解的吸熱行為，該峰值溫度為烏鱧魚皮膠原蛋白肽的熱變性溫度（Td）[48]。pH值為4的條件下，烏鱧魚皮膠原蛋白肽Td為33.8 ℃，稍高于Liu Wentao等[26]

采用烏鱧魚皮膠原溶液測得的32 ℃，導(dǎo)致該情況的原因是由于本研究采用超純水溶脹不同pH值條件下自組裝的膠原蛋白肽24 h，使得膠原蛋白肽分子之間更為接近，膠原蛋白肽的熱穩(wěn)定性增強(qiáng)。自組裝程度較高的膠原蛋白肽（pH 6～10）的熱穩(wěn)定性高于自組裝程度較低的膠原蛋白肽（pH 4），這是因為pH 4條件下的膠原蛋白肽多以單分子的形式存在，化學(xué)鍵及次級結(jié)構(gòu)之間的結(jié)合較少，而自組裝程度較高的膠原蛋白肽形成了有序的三維網(wǎng)絡(luò)纖維結(jié)構(gòu)，提高了膠原蛋白肽分子間及分子內(nèi)的交聯(lián)程度，對高溫帶來的變性起到一定的抵抗作用，因此pH 6～10條件下膠原蛋白肽熱穩(wěn)定性更高[49]。此外，不同pH條件下膠原蛋白肽自組裝結(jié)構(gòu)的變性溫度隨著pH值的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢，pH 8條件下達(dá)到最大值，變性溫度為54.1 ℃，高于其他溫度條件下自組裝的膠原蛋白肽，這是由膠原蛋白肽自組裝程度所決定，當(dāng)膠原蛋白肽pH值逐漸接近8時，膠原蛋白肽更接近于等電點，電荷趨向于零，阻礙膠原蛋白肽自組裝的阻力減小，自組裝程度更高，因而膠原蛋白肽自組裝形成的聚集體結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定。

3 結(jié) 論

在20～52 ℃時，烏鱧魚皮膠原蛋白肽自組裝速率和溫度呈正相關(guān)，可通過改變溫度影響自組裝速率。然而，膠原蛋白肽聚集體三維纖維網(wǎng)絡(luò)緊密性隨溫度的升高先增大后降低，與其凝膠強(qiáng)度、粒徑、黏度和二級結(jié)構(gòu)中β-折疊相對含量隨溫度的變化規(guī)律相一致，其中30 ℃條件下膠原蛋白肽自組裝聚集體各項指標(biāo)達(dá)到最大值，表明該溫度條件下烏鱧膠原蛋白肽自組裝聚集體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性最強(qiáng)。膠原蛋白肽聚集體結(jié)構(gòu)相比未組裝的膠原蛋白肽熱穩(wěn)定性更強(qiáng)，當(dāng)溫度高于膠原蛋白肽變性溫度時，其三螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解旋，纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)潰散。因此，可以通過改變溫度的方式提高自組裝效率，得到聚集程度更為緊密、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性更強(qiáng)的膠原蛋白肽聚集體。由于膠原蛋白肽具有良好的生物相容性和低致敏性，使其在藥物緩釋方面具有一定的研究前景，可在藥物載體的應(yīng)用方面開展進(jìn)一步探索。

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